Eine praktische und neuartige Methode, um genomische DNA aus Blutentnahme Kits Auszug für Plasma Protein Preservation

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine neue Methode zur Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut für Plasma / Serologie gesammelt. Nach Plasma-Sammlung wird die verdichtete Blut in der Regel verworfen. Unsere neue Methode stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber bestehenden Verfahren und macht DNA und Plasma von einem einzigen Sammlung, ohne Anforderung zusätzlicher Blut.

Zusammenfassung

Labortests können auf zellulärer oder Fluidanteile des Blutes erfolgen. Die Verwendung unterschiedlicher Blutsammelröhrchen bestimmt den Anteil des Blutes, das analysiert werden kann (Vollblut, Plasma oder Serum). Laboratories in das Studium der genetischen Grundlagen menschlicher Erkrankungen beteiligt vertrauen auf antikoaguliertes Vollblut in EDTA-haltige vacutainer als Quelle der DNA für genetische / genomische Analyse gesammelt. Da die meisten klinischen Laboratorien, biochemische und serologische viraler Tests in einem ersten Schritt in phänotypischen Ergebnis Untersuchung durchzuführen, wird auch in Antikoagulans Heparin-haltigen Rohr (Plasmarohr) gesammelt. Daher, wenn die DNA-und Plasma für simultane und parallele Analysen sowohl Genomik und Proteomik-Daten benötigt werden, ist es üblich, Blut sowohl EDTA und Heparin Röhrchen zu sammeln. Wenn Blut in einem Röhrchen gesammelt werden konnte und als Quelle für Plasma und DNA, würde das Verfahren als eine Weiterentwicklung bestehender meth werdenODS. Die Verwendung des verdichteten Blut nach Plasmaextraktion stellt eine alternative Quelle für genomische DNA und damit Minimierung der Menge von Blutproben verarbeitet und die Verringerung der Anzahl von Proben von jedem Patienten erforderlich. Dies würde letztendlich Zeit und Ressourcen sparen.

Der BD P100 Blutentnahme für Plasmaprotein Erhaltung wurden als ein verbessertes Verfahren gegenüber früheren Plasma oder Serum-Röhrchen ¹ erstellt haben, um den Proteingehalt des Blutes zu stabilisieren, was eine bessere Protein Biomarkern und Proteomik Experimente aus menschlichem Blut. Die BD P100 Röhrchen enthalten 15,8 ml sprühgetrockneten K2EDTA und eine lyophilisierte proprietären breites Spektrum Cocktail von Protease-Inhibitoren zur Verhinderung der Koagulation und Stabilisierung der Plasmaproteine. Sie umfassen auch eine mechanische Trennvorrichtung, die eine physische Barriere zwischen Plasma und Zellpellets nach Zentrifugation stellt. Nur wenige Methoden wurden entwickelt, um DNA aus geronnenes Blut sa extrahierenmples in alten Plasmaröhrchen ^2-4 gesammelt. Herausforderungen von diesen Methoden wurden hauptsächlich mit der Art der Separator im Inneren der Rohre (Gel-Separator) zugeordnet ist und inklusive Schwierigkeiten bei der Gewinnung des geronnenen Blut, die Unannehmlichkeiten der Fragmentierung oder Dispergieren des Gerinnsels und Behinderung des Gerinnsels durch Extraktion des Trenngels.

Wir präsentieren die erste Methode, die extrahiert und reinigt genomischer DNA aus Blut in den neuen BD P100 Rohre gezogen. Wir vergleichen die Qualität der DNA-Probe von P100 Röhren dass von EDTA. Unser Ansatz ist einfach und effizient. Es handelt sich um vier große Schritte wie folgt: 1) die Verwendung eines Plasmas BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) Rohr mit mechanischen Abscheider für die Blutentnahme, 2) die Entfernung des mechanischen Abscheider mit einer Kombination aus Saccharose und eine sterile Büroklammer Metallhakgen, 3) die Abtrennung des buffy coat Schicht, die die weißen Zellen und 4) die Isolierung der genomischen DNA aus derBuffy-Coat mit einem normalen kommerziellen DNA-Extraktions-Kits oder eine ähnliche Standard-Protokoll.

Protokoll

1. Probenentnahme

1. Sammeln von Blutproben von Personen mit entsprechenden Einwilligung. Für jeden einzelnen, ziehen 4 bis 5 ml Blut in ein Röhrchen P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). Zu Vergleichszwecken wurden gleichzeitig sammeln Blut in einem EDTA-Röhrchen.
2. Die BD P100 Röhrchen enthalten 15,8 ml sprühgetrockneten K2EDTA und eine lyophilisierte proprietären breites Spektrum Cocktail von Proteaseinhibitoren zur Gerinnung zu verhindern und zur Stabilisierung der Plasmaproteine. Sie enthalten auch einen mechanischen Abscheider. Nach dem Sammeln der Vollblut, halten beide Röhrchen bei Raumtemperatur für 60 min über Nacht bis zur Verarbeitung auftritt.
3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen BD P100 bei 2.500 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Plasma über die mechanische Abscheider in Mikrozentrifugengefäße gesammelt.
4. Bewahren Sie die P100 Rohre, die das Blut unter dem Separator verdichtet, bei -80 ° C, bis Sie bereit sind, die DNA ext beginnenraction.

2.1 Von Blut P100 Rohr (P100_DNA)

1. Die P100 Röhrchen werden bei -80 ° C nach dem Plasma-Extraktion. Innerhalb von 3 bis 4 Monate, Abrufen der P100 Röhrchen mit dem verdichteten Blut aus dem Gefrierfach und Auftauen bei 37 ° C in einem Wasserbad für 5 min (1A). Entfernen Sie alle Restplasma, die über dem Abscheider sitzt. 2 ml 17% Saccharose-Lösung (Gradient Lösung im Haus getestet - unveröffentlichte Daten) in den P100 Rohre über dem Separator (Abbildung 1B). Die Röhrchen bei Raumtemperatur für 20 min bei 2.500 g; dieser Vorgang drückt die mechanische Abscheider zum oberen Ende des Rohres und liefert drei Schichten aus Lösung, die das buffy coat (Abbildung 1C). Extrahieren Sie manuell den Separator mit einer steriled Haken Metall Büroklammer (1D).
2. Nach dem Abrufen der mechanischen Abscheider aus jedem Röhrchen (1D), zu entfernen und discard die obere Schicht Saccharose. Übertragen Sie die mittlere Schicht, die die Buffy-Coat (BC)-Schicht, in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen. In Phosphate Buffer Saline (PBS), die Buffy-Coat-Volumen bis 3 ml zu erhöhen. Extrahieren Sie die DNA aus dem Buffy-Coat mit Reagenzien aus dem Qiagen Puregene Blood Kit nach der Empfehlung des Herstellers, ausgenommen einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 2.500 g (anstelle von 2.000 g).
3. Um lysieren und entfernen Sie die roten Blutkörperchen (RBC), fügen 9 ml RBC Lyse bis 3 ml Buffy-Coat. Umkehren jedes Rohr mehrmals und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min mit gelegentlichen invertierenden während der Inkubation. Drehe jede Mischung unten bei 2.500 g für 5 min und den Überstand verwerfen. Behandeln Sie die verbleibende Pellet in jedem Röhrchen mit 3 ml Zell-Lyse-Lösung und Vortex für 15 Sekunden. Behandeln Sie das Lysat mit 1 ml Protein Fällungslösung und Vortex für 15 Sekunden.
4. Zentrifuge bei 2500 g für 5 min und den Überstand in ein frisches 15 ml konischen Röhrchen mit3 ml 100% Isopropanol. Kehren Sie die neuen Rohre 10-mal und Zentrifuge bei 2.500 g für 3 min. Überstand verwerfen und 1 ml 70% Ethanol. Kehren Sie die konische Röhrchen ein paar Mal zu lösen und waschen das DNA-Pellet. Zentrifuge bei 2.500 g für 1 min. Die Tablette für 3 min (das Reagenzglas auf den Kopf) bei Raumtemperatur trocknen und dann setzt die DNA mit 250 ml Rehydrationslösung bei 37 ° C für 10 min und Transfer zu einem pre-markierten 1,7 ml Mikroröhre. Bewahren Sie die Röhrchen bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2.2 aus dem Blut von EDTA Ttube (EDTA_DNA)

1. Das Vollblut für die routinemäßige Prüfung Immunhämatologie in Kunststoff vaccutainer Röhrchen gesammelt mit 10,8 mg K ₂ EDTA-Spray aufgetragen und bei -80 ° C. Da die Rohre nicht enthalten einen mechanischen Abscheider, wird die DNA-Extraktion nicht die Schritte, die die mechanischen Abscheider (2.1.1 und 2.1.2).
2. Innerhalb von 3 bis 4 Monaten von Blut Lagerung, die DNA extrahiert mit der KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Es ist eine Automatisierung DNA Absaugsystem Magnetpartikel-Technologie und besteht aus Zelllyse / DNA-Bindung, mehreren Waschschritten und DNA-Elution.
3. Das Kit in der DNA-Extraktion verwendet wird, die KingFisher Flex 24 DNA Blood Kit (Qiagen, Deutschland).

3. DNA Menge and Quality Assessment

Die Menge, Qualität und Integrität der genomischen DNA durch eine Kombination von Verfahren, die PicoGreen, Spektroskopie und Elektrophorese umfasst beurteilt.

1. Die Konzentration der genomischen DNA durch Nanodrop und PicoGreen Quantifizierung bestimmt.
2. Die Reinheit wird aus dem 260/280 Verhältnis Messung am Nanodrop Spektralphotometer bestimmt.
3. Die Probe (500 ng) wird ebenfalls auf 1% Agarose-Gel geladen, um die Integrität (Degradation) der DNA zu beurteilen.

4. Genotyping Assays und Qualitätskontrolle

1. Fünf P100_DNA und ihre entsprechenden EDTA_DNA Proben werden nach dem Zufallsprinzip für die weitere Analyse mithilfe des benutzerdefinierten Immunochip (Immuno DNA Analysis BeadChip) ausgewählt. Immunochip ist ein Infinium Genotypisierung Chip mit 196.524 Polymorphismen und ist für ⁵ immungenetischen Studien konzipiert.
2. Für jede Probe werden 200 ng DNA amplifiziert, fragmentiert, gefällt und in die entsprechende Hybridisierungspuffer.
3. Die denaturierten Proben werden auf Immunochips bei 48 ° C für mindestens 16 Stunden hybridisiert.
4. Nach der Hybridisierung werden die Immunochips für Ein-Basen-Extension Reaktionen und gefärbten verarbeitet.
5. Die immunochips werden dann aufgenommen mit Illumina Bead Array HiScan Leser und die normalisierte Intensität Wulst Daten in den Illumina GenomeStudio Software geladen und in Genotypen. Genotypen werden als mit dem Algorithmus von autocalling GenomeStudio. Die Qualitätskontrolle ines spricht Ausschluss von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) mit einem Aufruf Rate <95%.
6. Die SNP anrufen wird als Maß für die Effizienz immunochip Assay verwendet. Es wird als Prozentsatz der Gesamtzahl von Assays, die auf dem Chip (196.524 SNPs auf jedem Chip codiert), die eine ausreichende Signalstärke und Qualität zu erzielen, eine automatische Zuordnung Genotyp erhalten berechnet. Hochwertige DNA (260/280 von 1,8 oder höher und Abwesenheit von Abbau) wird erwartet, dass mindestens die gleiche anrufen als HapMap Kontroll-DNA in dem Test eingeschlossen immunochip erreichen. Qualitätskontrolle beinhaltet Ausschluss von SNPs mit einem Aufruf Rate <95% in jedem Datensatz.

Ergebnisse

DNA Qualitätsbewertung und Konzentrationsmessung

Die Ausbeuten an P100_DNAs waren signifikant niedriger als die der EDTA_DNAs (Tabellen 1 und 2). Die DNA-Reinheit durch seine 260/280 Verhältnis Wert dargestellt ist ähnlich für beide P100_DNA und EDTA_DNA Probe-Set (Tabellen 1 und 2). Die Qualität der DNA ist ziemlich einheitlich in jedem Satz der Probe, obwohl einige Verschlechterung der EDTA_DNA Proben gesehen, wie durch Licht...

Diskussion

Viele menschliche Erkrankungen genetische Ursachen haben und die Erforschung der genetischen Grundlagen von Erkrankungen des Menschen verlangt eine zunehmende hochwertige DNA. Die häufigste Quelle von DNA in genetischen Studien verwendet wird Vollblut Antikoagulation. Da die meisten klinischen Labors biochemische, serologische und viraler Tests durchzuführen, wie in einem ersten Schritt phänotypische Untersuchung Ergebnis wird das Blut oft in einem Plasma-Röhrchen gesammelt. Nach der Entnahme des Plasmas wird der verdic...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD P100-Röhrchen	BD Diagnostics	366448
EDTA-Röhrchen	BD Diagnostics	367863
Saccharose	Sigma	S9378
Büroklammer	Büroprodukt
15-ml-Röhrchen	Corning	430052
rote Blutkörperchen (RBC)	Qiagen	158389 (Kit)
Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
1,7-ml-Mikroröhrchen	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Bead-Array-Lesegerät	Illumina	NA
GenomeStudio-Software	Illumina	N/A