Method Article

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

DOI:

10.3791/4393

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February 13th, 2013

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1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll stellt eine vollständige und detaillierte Verfahren zur RNA-seq, eine leistungsstarke Next-Generation-DNA-Sequenzierung Technologie zum Profil Transkriptomen in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung anzuwenden. Dieses Protokoll ist generalisierbar verschiedenen Zellen oder Geweben von verschiedenen Reagenzien oder Krankheitszuständen befallen.

Abstract

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Die Charakterisierung der Genexpression in Zellen über Messung der mRNA ist ein nützliches Werkzeug bei der Bestimmung, wie der transkriptionellen Maschinerie der Zelle von externen Signalen (zB Arzneimittelbehandlung) oder wie Zellen unterscheiden zwischen einem gesunden Zustand und einem erkrankten Zustand ist betroffen. Mit dem Aufkommen und kontinuierliche Weiterentwicklung der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Technologie hat RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eine zunehmend beliebte Methode der Transkriptom-Analyse, um alle Arten von Transkripten zu katalogisieren, um die transkriptionelle Struktur aller exprimierten Gene zu ermitteln und zu quantifizieren die wechselnden Expressionsniveaus des gesamten Satzes von Transkripten in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Organismus 1,2. RNA-seq ersetzt nach DNA-Mikroarrays als bevorzugte Methode für die Transkriptom-Analyse, da sie die Vorteile der Profilierung eine komplette Transkriptom hat, ein digitales Typ Datum (Kopienzahl jeder transcript) und sich auf keine bekannten genomischen sequence 3.

Hier stellen wir eine vollständige und detaillierte Protokoll RNA-seq zum Profil Transkriptomen gelten in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung. Dieses Protokoll basiert auf unseren kürzlich veröffentlichten Studie mit dem Titel basiert "RNA-seq enthüllt Novel Transkriptom von Genen und deren Isoformen in Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin behandelt," 4, in denen wir erfolgreich durchgeführt die erste komplette Transkriptom-Analyse der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen behandelt mit Thrombin mittels RNA-seq. Es ergab beispiellose Ressourcen für weitere Experimente, um Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Thrombin-vermittelte endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Diabetes und koronare Herzkrankheit zu gewinnen, und bietet potenziellen neuen Leads für therapeutische Targets zu diesen Krankheiten.

Der beschreibende Text des Protokollsist in vier Teile gegliedert. Der erste Teil beschreibt die Behandlung von pulmonaler menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin und RNA-Isolation, Qualität Analyse und Quantifizierung. Der zweite Teil beschreibt Aufbau der Bibliothek und Sequenzierung. Der dritte Teil beschreibt die Analyse der Daten. Der vierte Teil beschreibt einen RT-PCR Validierung Assay. Repräsentative Ergebnisse von mehreren wichtigen Schritten angezeigt. Nützliche Tipps oder Hinweise auf zu Erfolg in wichtigen Schritten zu steigern sind in der Diskussion Abschnitt. Obwohl dieses Protokoll verwendet menschlichen pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen mit Thrombin behandelt wird, kann es sein, generalisierte zum Profil Transkriptomen in beiden Säuger und Nicht-Säuger-Zellen und in Geweben mit unterschiedlichen Stimuli oder Inhibitoren oder Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand vergleichen behandelten und einen Krankheitszustand.

Protocol

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Ein Flussdiagramm, dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

Ein. Behandlung der Zellen mit Thrombin, RNA Isolation, Quality Assessment und Quantifizierung von RNA

  1. Kultur Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-LBL) 90-100% Konfluenz in 6-Well-Platten in EGM-2-Medium mit 5% FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika (Lonza, cat # CC-3202).
  2. Anderer Medien zu den Hungermedium (0% FBS) 30 min vor der Behandlung mit Thrombin.
  3. Behandlung der Zellen mit 0,05 U / ml Thrombin oder lassen unbehandelten als Kontrolle für 6 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Isolieren der Ges....

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Results

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Für Schritt 1: Die 28s: 18s-Verhältnis wird traditionell als Indikator für die RNA-Abbau verwendet. Idealerweise sollte die 28s Peak etwa doppelt der Fläche der 18s Band (ein Verhältnis von 2) aufweisen, wird dies jedoch oft nicht ideale Verhältnis in der Praxis angesehen. Weiterhin 28s: 18s können Verhältnisse von spektrophotometrischen Methoden erhalten unterschätzen die Menge des Abbaus der RNA. Um genauer zu quantifizieren den Abbau und somit die Qualität der RNA-Probe, berechnet das System eine RNA.......

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Discussion

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Wichtige Schritte

RNA Handhabung: RNasen sogar verschlechtern die meisten hochwertigen RNA, daher muss darauf bei der Isolierung, Lagerung und Verwendung von RNA 10 entnommen werden. Handschuhe sind immer getragen werden, um Verschmutzungen durch RNasen auf die menschliche Hände fanden verhindern. Handschuhe sollten häufig gewechselt werden, insbesondere nach dem Berühren der Haut, Türklinken oder anderen gängigen Oberflächen. Eine Reihe von Pipetten sollten ausschli.......

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Stephen Kingsmore und die Kinderradiologie Genome Medicine Center im Kinderkrankenhaus Mercy Krankenhäuser und Kliniken danken für die Nutzung ihrer Computing-Cluster für unsere Datenanalyse, Illumina Außendienst (Elizabeth Boyer, Scott Cook und Mark Cook) und technische Berater-Team für die schnellen Antworten und Anregungen auf dem Lauf der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Instrument, HiScanSQ und Datenqualität Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants HL080042 (um SQY) unterstützt und Start-up-Fonds und Ausstattung der Kinder Mercy Krankenhäuser und Kliniken, University of Missouri in K....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenzien oder Ausrüstungen Firma Katalognummer Kommentare
Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 enthält, FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika
Thrombin Sigma T4393
Ambion mir Vana Kit Life Technologies AM 1560
RNase-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens RNA Bio-Rad 700-7103
TruSeq RNA-PräparationSatz Illumina FC-122-1001
AMPureXP Beads Beckman Coulter A63881
Superscript Reverse Transkriptase II Life Technologies 18064-014
Experion DNA 1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE Cluster-Generation Kit Illumina PE-401-3001
PhiX Control Kit Illumina FC110-301
200 Zyklus SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina SY-103-2001
CBOT Illumina SY-301-2002
qPCR Maschine - Viia7 Life Technologies Model # VIIA7 / Equipment # 10631261 Oder gleichwertig
Experion-System Bio Rad 7007001 Bioanalyzer ist ein alternatives System
Spektrophotometer Bio-Tek Epoch Mikroplatten-Spektralphotometer Oder gleichwertig
Zentrifuge - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Oder gleichwertig
Magnetfuß Life Technologies AM10027
96-well Thermocycler General Lab Lieferant
Tabelle 3. Liste der Key Reagenzien und Major Equipment. *, In dem Video wurde HiSeq1000 statt HiScanSQ demonstriert.

References

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  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y.

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RNA seq AnalysisTranscriptome ProfilingThrombin TreatmentHuman Pulmonary Microvascular Endothelial CellsRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

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