Methodenartikel

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

DOI:

10.3791/4393

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13. Februar 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt eine vollständige und detaillierte Verfahren zur RNA-seq, eine leistungsstarke Next-Generation-DNA-Sequenzierung Technologie zum Profil Transkriptomen in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung anzuwenden. Dieses Protokoll ist generalisierbar verschiedenen Zellen oder Geweben von verschiedenen Reagenzien oder Krankheitszuständen befallen.

Zusammenfassung

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Die Charakterisierung der Genexpression in Zellen über Messung der mRNA ist ein nützliches Werkzeug bei der Bestimmung, wie der transkriptionellen Maschinerie der Zelle von externen Signalen (zB Arzneimittelbehandlung) oder wie Zellen unterscheiden zwischen einem gesunden Zustand und einem erkrankten Zustand ist betroffen. Mit dem Aufkommen und kontinuierliche Weiterentwicklung der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Technologie hat RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eine zunehmend beliebte Methode der Transkriptom-Analyse, um alle Arten von Transkripten zu katalogisieren, um die transkriptionelle Struktur aller exprimierten Gene zu ermitteln und zu quantifizieren die wechselnden Expressionsniveaus des gesamten Satzes von Transkripten in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Organismus 1,2. RNA-seq ersetzt nach DNA-Mikroarrays als bevorzugte Methode für die Transkriptom-Analyse, da sie die Vorteile der Profilierung eine komplette Transkriptom hat, ein digitales Typ Datum (Kopienzahl jeder transcript) und sich auf keine bekannten genomischen sequence 3.

Hier stellen wir eine vollständige und detaillierte Protokoll RNA-seq zum Profil Transkriptomen gelten in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung. Dieses Protokoll basiert auf unseren kürzlich veröffentlichten Studie mit dem Titel basiert "RNA-seq enthüllt Novel Transkriptom von Genen und deren Isoformen in Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin behandelt," 4, in denen wir erfolgreich durchgeführt die erste komplette Transkriptom-Analyse der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen behandelt mit Thrombin mittels RNA-seq. Es ergab beispiellose Ressourcen für weitere Experimente, um Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Thrombin-vermittelte endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Diabetes und koronare Herzkrankheit zu gewinnen, und bietet potenziellen neuen Leads für therapeutische Targets zu diesen Krankheiten.

Der beschreibende Text des Protokollsist in vier Teile gegliedert. Der erste Teil beschreibt die Behandlung von pulmonaler menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin und RNA-Isolation, Qualität Analyse und Quantifizierung. Der zweite Teil beschreibt Aufbau der Bibliothek und Sequenzierung. Der dritte Teil beschreibt die Analyse der Daten. Der vierte Teil beschreibt einen RT-PCR Validierung Assay. Repräsentative Ergebnisse von mehreren wichtigen Schritten angezeigt. Nützliche Tipps oder Hinweise auf zu Erfolg in wichtigen Schritten zu steigern sind in der Diskussion Abschnitt. Obwohl dieses Protokoll verwendet menschlichen pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen mit Thrombin behandelt wird, kann es sein, generalisierte zum Profil Transkriptomen in beiden Säuger und Nicht-Säuger-Zellen und in Geweben mit unterschiedlichen Stimuli oder Inhibitoren oder Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand vergleichen behandelten und einen Krankheitszustand.

Protokoll

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Ein Flussdiagramm, dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

Ein. Behandlung der Zellen mit Thrombin, RNA Isolation, Quality Assessment und Quantifizierung von RNA

  1. Kultur Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-LBL) 90-100% Konfluenz in 6-Well-Platten in EGM-2-Medium mit 5% FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika (Lonza, cat # CC-3202).
  2. Anderer Medien zu den Hungermedium (0% FBS) 30 min vor der Behandlung mit Thrombin.
  3. Behandlung der Zellen mit 0,05 U / ml Thrombin oder lassen unbehandelten als Kontrolle für 6 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Isolieren der Gesamt-RNA aus den behandelten und Kontroll-Zellen unter Verwendung des Ambion mir Vana Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  5. Bewerten Sie die Qualität der RNA mit einer Experion StdSense eukaryotischen RNA-Chip nach dem Standard-Protokoll auf dem Experion Automatisierte Elektrophorese Station (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
  6. Quantifizierung der RNA mit einem Standard-spektrophotometrische Methode.

2. Library Construction und Sequenzierung

  1. Verwenden Sie 1 ug von hoher Qualität Gesamt-RNA pro Probe als Ausgangsmaterial.
  2. Um die Bibliothek zu bauen, folgen Sie den Standard-Verfahren von Illumina (Protokoll # 15008136 Rev. A). In diesem Protokoll zwei Runden von Poly (A) enthaltende mRNA Auswahlen werden durchgeführt, um zu entfernen, um die rRNA rRNA-Sequenzierung zu minimieren.
  3. Bewerten Sie die Qualität der Bibliotheken mit einem Experion DNA 1K-Chip nach dem Standard-Protokoll auf dem Experion Automatisierte Elektrophorese Station ( www.bio-rad.com ).
  4. Quantifizierung der Bibliothek mit qPCR: Verwenden Sie eine Bibliothek, die zuvor als Standardkurve und spezifische Primer für die ligierten Adapter wurde sequenziert. Verwenden Sie eine Reihe von Verdünnungen der unbekannten Bibliotheken (dh 1:100, 1:500 und 1:1000). Führen Sie die qPCR according der SyberGreen MM-Protokoll und berechnen den ursprünglichen Bestand Konzentration von jeder Bibliothek.
  5. Verdünnen Sie die Bibliotheksbestände bis 10 nm und bei -20 ° C bis zum Cluster eine Durchflusszelle.
  6. Wenn Sie bereit sind Cluster eine Durchflusszelle, auftauen der CBOT Reagenz Platte in einem Wasserbad. CBOT ist eine Illumina Instrument benutzt, um die Cluster-Generation zu rationalisieren.
  7. Waschen Sie die CBOT Instrument.
  8. Denaturierung der Bibliotheken: Kombinieren Sie 13 ul 1x TE und 6 ul 10 uM Bibliothek und an der Seite des Rohres, fügen Sie 1 ul 1 N NaOH (von Illumina). Vortex, Spin-down, Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und legen die denaturierten Bibliotheken auf Eis.
  9. Verdünnt den Bibliotheken: Verdünnen der denaturierten Bibliotheken mit vorgekühlten Hybridisierungspuffer (HT1, bereitgestellt durch Illumina) durch Kombinieren 996 ul HT1 und 4 ul denaturierten Bibliothek nach einer Endkonzentration von 12 pM. Legen Sie die denaturiert und verwässert Bibliotheken auf Eis.
  10. Invert jede Zeile der Rohre der CBOT Platte,sicherzustellen, dass alle Reagenzien aufgetaut werden. Spin-Down der Platte entfernen / Punktion der Folie Dichtungen und laden auf der CBOT.
  11. Aliquot 120 ul der verdünnten, denaturierten Bibliotheken auf einen Streifen Gefäß mit der Beschriftung 1-8. Mit 1,2 ul verdünnte, vergällt PhiX Control-Bibliothek (von Illumina) in jedes Röhrchen als spike-Kontrolle. Vortex und Spin-down der Rohre und laden Sie sie an der CBOT in der richtigen Ausrichtung (Röhrchen Nr. 1 auf der rechten Seite).
  12. Legen Sie eine Durchflusszelle und vielfältig auf die CBOT.
  13. Füllen Sie die Strömung zu überprüfen und beginnen das Clustering Lauf.
  14. Nach dem Lauf abgeschlossen ist, überprüfen Reagenz Lieferung in allen Gassen. Notieren Sie alle Auffälligkeiten. Entweder starten die Sequenzierung Lauf sofort oder lagern Sie die Durchflusszelle in der mitgelieferten Röhrchen bei 4 ° C.
  15. Tauen die Sequenzierung durch Synthese (SBS, Illumina) Reagenzien.
  16. Legen Sie die Reagenzien zu den entsprechenden Stellen auf den Reagenzgefäße, was sicher nicht zu den anderen Reagenzien nach dem Berühren der Spaltung Mix berühren.
  17. Verwendung eines nichtn-Sequenzierung Durchflusszelle (dh eine, die zuvor wurde sequenziert), prime die Reagenzleitungen zweimal.
  18. Reinigen Sie die Sequenzierung Durchflusszelle mit 70% EtOH und Kimwipes, um 70% EtOH und Brillenputztuch gefolgt. Überprüfen Sie die Durchflusszelle für alle Streifen. Re-Reinigung, wenn nötig.
  19. Laden die Flußzelle auf dem Sequenzer und führen einen Strom überprüfen, um sicherzustellen, dass die Dichtung zwischen dem Verteiler und der Durchflusszelle dicht ist.
  20. Starten Sie die Sequenzierung Lauf.
  21. Bewerten Sie die Qualität Metriken (zB die Cluster-Dichte, Clustern vorbei Filter, Q30, Intensität), sobald sie verfügbar während des Laufs werden.
  22. Überwachen Intensität über die gesamte Auflage.
  23. Nach 101 Zyklen abgeschlossen sind, führen Turnaround Chemie zur Vollendung des zweiten lesen: Tauen Sie die Paired-End-Reagenzien und die zweite Lese Incorporation Buffer (ICB, eine Komponente des SBS Reagenzien, Illumina) und laden Sie die Reagenzien.
  24. Fahren Sie mit der Sequenzierung Lauf Beurteilung 2 nd lesen Intensität, Q30 einnd anderen Qualitätsmetriken als Lauf fortschreitet.

3. Data Analysis

  1. Verwenden Sie die neueste Version von Casava (Illumina, derzeit 1.8.2), um die Basis-Call-Dateien (. Bcl) Dateien. Fastq Dateien zu konvertieren, setzen fastq-cluster-count auf 0, um die Schaffung eines einheitlichen fastq Datei für jede Probe zu gewährleisten . Entpacken Sie die fastq Dateien für nachgeschaltete Analyse.
  2. Führen gepaart Ende Ausrichtung mit den neuesten Versionen von TopHat (1.4.1) 5, die RNA-seq liest Säuger-sized Genome mit dem Ultra-High-Throughput-Kurz read Ausrichter (Bowtie, 0.12.7) 6 und samtools (0,1 ausrichtet. 17) 7. Samtools implementiert verschiedene Dienstprogramme für die Nachbearbeitung Ausrichtungen in der SAM-Format. Der Verweis menschlichen Transkriptom aus iGenomes (heruntergeladen werden www.illumina.com ). Im laufenden TopHat, haben wir alle Standard-Parametereinstellungen einschließlich der Bibliothek Typ Option fr-unverseilten (default).
  3. UnsIng. das Programm CuffDiff ein Teil der Manschettenknöpfe (1.3.0) 8 Softwarepaket, vergleicht die Thrombin-behandelten Zellen zu den Kontrollen Zellen herauszufiltern die differentiell exprimierten Gens Transkripte in der ehemaligen am menschlichen Referenz Transkriptom basiert. Dieser Vergleich ermittelt die differentielle Expression von bekannten Transkripte. Verwenden Sie Microsoft Excel, um das Ergebnis in tabellarischer Form darzustellen. Im laufenden Manschettenknöpfe Programm, haben wir alle Standard-Parametereinstellungen. Diese Gentranskripten mit FPKM <0,05 und p> 0,05 herausgefiltert.
  4. Um neue Isoformen erkennen, führen Manschettenknöpfe ohne einen Verweis Transkriptom. Vergleichen Sie die Probe transcript Dateien auf den Referenz-Genom mit Cuffcompare und testen Sie die differentielle Expression mit Cuffdiff mit kombiniertem Thrombin transcript-Dateien als Referenz Genom für eine Analyse und die kombinierte Steuerung transcript-Dateien als Referenz Genom für eine zweite Analyse. Verwenden Sie Microsoft Excel, um das Ergebnis in tabellarischer Form darzustellen. Wieder those Gentranskripten mit FPKM <0,05 und p> 0,05 herausgefiltert. Nach diesem Schritt können die Ermittler entscheiden, um eine Liste der neu gemeldeten Transkripte der UCSC Genome Browser Website (Upload http://genome.ucsc.edu/ ) auf ihre Gültigkeit durch eine manuelle Inspektion zu überprüfen.
  5. Senden Listen differentiell exprimierter Gene Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) zur Charakterisierung der Gene und Signalwege durch den Thrombin Behandlung nicht beeinflusst. In diesem Schritt kann die Ermittler entscheiden, Kummerbund (verwenden http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), eine R-Paket, das entworfen, um zu helfen und vereinfachen die Aufgabe der Analyse Manschettenknöpfe RNA-seq ausgegeben wird, um die Verwaltung, Visualisierung und Integration aller Daten durch einen Cuffdiff Analyse hergestellt.

4. Validierung der RNA-seq Ergebnisse mittels quantitativer real-time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

  1. Führen Gesamt-RNA Isolation von Steuerung und Thrombin behandelten HMVEC-LBL-Zellen, RNA Qualitätsbewertung und RNA-Quantifizierung in den Schritten von 1,4 bis 1,6 beschrieben.
  2. Generieren komplementäre DNA von 1 pg Gesamt-RNA jeder Probe mit SuperScript III First-Strand Synthesis System RT Kits nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, 18080-051).
  3. Führen qRT-PCR-Analyse auf einem Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System mit TaqMan-Assay-on-Demand entwickelt Oligonukleotide für die Detektion von CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) und β-Aktin (ACTB, Hs99999903_m1). Jede Probe wies eine Vorlage entspricht 5 ng Gesamt-RNA. Messen Quantifizierung mit dem DDCt Methode und zu normalisieren, um β-Aktin. Jeder Test wurde über mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt.

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Ergebnisse

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Für Schritt 1: Die 28s: 18s-Verhältnis wird traditionell als Indikator für die RNA-Abbau verwendet. Idealerweise sollte die 28s Peak etwa doppelt der Fläche der 18s Band (ein Verhältnis von 2) aufweisen, wird dies jedoch oft nicht ideale Verhältnis in der Praxis angesehen. Weiterhin 28s: 18s können Verhältnisse von spektrophotometrischen Methoden erhalten unterschätzen die Menge des Abbaus der RNA. Um genauer zu quantifizieren den Abbau und somit die Qualität der RNA-Probe, berechnet das System eine RNA...

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Diskussion

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Wichtige Schritte

RNA Handhabung: RNasen sogar verschlechtern die meisten hochwertigen RNA, daher muss darauf bei der Isolierung, Lagerung und Verwendung von RNA 10 entnommen werden. Handschuhe sind immer getragen werden, um Verschmutzungen durch RNasen auf die menschliche Hände fanden verhindern. Handschuhe sollten häufig gewechselt werden, insbesondere nach dem Berühren der Haut, Türklinken oder anderen gängigen Oberflächen. Eine Reihe von Pipetten sollten ausschli...

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Stephen Kingsmore und die Kinderradiologie Genome Medicine Center im Kinderkrankenhaus Mercy Krankenhäuser und Kliniken danken für die Nutzung ihrer Computing-Cluster für unsere Datenanalyse, Illumina Außendienst (Elizabeth Boyer, Scott Cook und Mark Cook) und technische Berater-Team für die schnellen Antworten und Anregungen auf dem Lauf der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Instrument, HiScanSQ und Datenqualität Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants HL080042 (um SQY) unterstützt und Start-up-Fonds und Ausstattung der Kinder Mercy Krankenhäuser und Kliniken, University of Missouri in Kansas City (auf SQY).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien oder Ausrüstungen Firma Katalognummer Kommentare
Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 EGM-2 enthält, FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika
Thrombin Sigma T4393
Ambion mir Vana Kit Life Technologies AM 1560
RNase-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens RNA Bio-Rad 700-7103
TruSeq RNA-PräparationSatz Illumina FC-122-1001
AMPureXP Beads Beckman Coulter A63881
Superscript Reverse Transkriptase II Life Technologies 18064-014
Experion DNA 1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE Cluster-Generation Kit Illumina PE-401-3001
PhiX Control Kit Illumina FC110-301
200 Zyklus SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina SY-103-2001
CBOT Illumina SY-301-2002
qPCR Maschine - Viia7 Life Technologies Model # VIIA7 / Equipment # 10631261 Oder gleichwertig
Experion-System Bio Rad 7007001 Bioanalyzer ist ein alternatives System
Spektrophotometer Bio-Tek Epoch Mikroplatten-Spektralphotometer Oder gleichwertig
Zentrifuge - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Oder gleichwertig
Magnetfuß Life Technologies AM10027
96-well Thermocycler General Lab Lieferant
Tabelle 3. Liste der Key Reagenzien und Major Equipment. *, In dem Video wurde HiSeq1000 statt HiScanSQ demonstriert.

Referenzen

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Schlagwörter

Transcriptome ProfilingThrombin TreatmentRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

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