שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.
גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) של האשך מייצגים דוגמה קלסית לתאי גזע של יונקי בוגרים ולשמר פוריות לכמעט כל החיים של בעלי החיים. בעוד המנגנון המדויק ששולט בהתחדשות עצמית ובידול in vivo מאתגר למחקר, מערכות שונות שפותחו בעבר כדי להפיץ SSCs Murine במבחנה באמצעות שילוב של אמצעי תקשורת תרבות מיוחד ותאים מזינים 1-3.
רוב הגיחות במבחנה לביולוגיה של SSCs שנבעו משורות תאי ילודים, אולי בשל הקושי בהשגת שורות תאי בוגרים 4. עם זאת, האשך ממשיך להבשיל עד ~ 5 שבועות של גיל ברוב הזנים של עכברים. בתקופה הראשונה שלאחר הלידה, שינויים דרמטיים בארכיטקטורה של האשך ובביולוגיה של תאים והן גופניים spermatogenic, כוללים שינויים ברמות הביטוי של גזע רב הקשור לתאגנים. לכן, קווי SSC נגזרים-neonatally לא יכולים לסכם באופן מלא את הביולוגיה של SSCs המבוגר כי נמשך לאחר האשך המבוגר הגיע למצב יציב.
מספר גורמים שעכבו את הייצור של קווי מבוגרי SSC מבחינה הסטורית. ראשית, חלקם של תאי גזע פונקציונליים עשוי לרדת במהלך הבגרות, או בשל גורמים פנימיים או חיצוניים 5,6. יתר על כן, כמו בתאי גזע בוגרים אחרים, זה כבר קשה להעשיר SSCs מספיק תאים מאשכים בוגרים כלל ללא שימוש בשילוב של אסטרטגיות מיון immunoselection או אחרות 7. אסטרטגיות מועסק נפוץ כוללות שימוש בעכברים טמירים כמקור לתאי תורם בשל יחס גבוה יותר של תאי גזע לתאים מסוגים אחרים 8. בהתבסס על ההשערה כי הסרת תאים הסומטיים מהתרבות הראשונית משבשת אינטראקציות עם נישת תאי הגזע שהם חיוניים להישרדות SSC, פתחו שיטות עבר כדי להפיק ליטר מבוגראינס, שאינו דורש immunoselection או תורמים טמירים אלא להעסיק העשרה סידורית של SSCs בתרבות, המכונה להלן כSESC 2,3.
השיטה המתוארת להלן כרוכה הליך פשוט לגזירת קווי SSC במבוגרי dissociating תורם המבוגר seminiferous tubules, ואחריו ציפוי של תאים במתקני ההאכלה המורכבות משורת אשכי סטרומה תא (JK1) 3. דרך סידורי passaging, חזק נדבק, לזהם תאי ניבט שאינו מתרוקנים מהתרבות עם העשרה קשורה של SSCs. תרבויות שנוצרו בדרך זו מכילות תערובת של spermatogonia בשלבים שונים של התמיינות, המכילות SSCs, המבוסס על יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. עיקרה של שיטת SESC הוא שהוא מאפשר SSCs לבצע את המעבר הקשה מהתחדשות עצמית in vivo להתחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה בmicroenvironment שונה בתכלית, מייצר קווי SSC לטווח ארוך, ללא זיהוםתאים הסומטיים, ובכך מאפשר מניפולציה ניסויית הבאה של SSCs.
שיטה זו להפקת SSCs המבוגר באמצעות תאים מזינים המופקים מאשך למבוגרים היא חזקה והצליחה כאשר רקע גנטי משותף (למשל FVB, C57Bl6 ו129SV/C57Bl/6 המעורב) וזנים מוטנטים שונים הועסקו 2,3,7,14. למעשה, microenvironment נוצר על ידי מערכת התרבות הוא מספיק כדי להתגבר על כמה מהמחסומים הגנטיים לשמ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מדינת ניו יורק מחלקת בריאות (C026878). MS היה בחור ניו יורק לתאי גזע קרן-Druckenmiller. נתמך בחלקו על ידי מענק מחקר המס '5-FY11-571 מהמצעד הפרוט קרן.
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
Table 2. Dissociation buffer | |||
StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
Additional supplements** | |||
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
Table 3. Stem cell medium | |||
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |