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Methodenartikel

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

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DOI:

10.3791/50025

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12. Dezember 2012

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1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Zusammenfassung

In der primären Sehrinde des Nicht-Nagetier Säugetieren, sind Neurone nach ihrer Präferenz für Stimulus-Features wie Ausrichtung 1-4, Richtung 5-7, okuläre Dominanz 8,9 und binokulare Disparität 9 gruppierten. Orientierungsselektivität ist das am besten untersuchte und eine kontinuierliche Funktion der Karte mit einem quasi-periodischen Layout für bevorzugte Orientierung vorhanden ist über den gesamten primären Sehrinde 10,11. Die Integration der synaptischen, Mobilfunk-und Netzwerk-Beiträge, die Stimulus-selektive Reaktionen in diesen funktionellen Karten führen erfordert die Hybridisierung von bildgebenden Verfahren, die sub-micron überspannen bis Millimeter räumlichen Skalen. Bei herkömmlichen intrinsische Signal optische Bildgebung kann die gesamte Anordnung der Funktionskarten über die gesamte Oberfläche des visuellen Kortex 12 bestimmt werden. Die Entwicklung der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit Calcium-sensitiven Farbstoffen ermöglicht es, die SYNAPT bestimmenIC-Eingang ankommen einzelnen dendritischen Dornen 13 oder Rekord-Aktivität gleichzeitig aus Hunderten von einzelnen neuronalen Zellkörper 6,14. Folglich Kombinieren intrinsische Signal Bilderzeugung mit der Sub-Mikrometer Ortsauflösung Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, genau festzustellen, welcher dendritischen Zellen Segmente und an das Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte in der Großhirnrinde beitragen. Hier zeigen wir, eine hohe Ausbeute-Verfahren zum schnellen Gewinnung eines kortikalen Orientierungskarte und die eine spezifische Mikro-Domäne in diesem funktionellen Karte zur Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Neuronen in einem nicht-Nagetier-Säuger. Mit dem gleichen Mikroskop für Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet, wir erzeugen zunächst eine Orientierung Karte mit intrinsische Signal optische Bildgebung. Dann werden wir zeigen, wie man ein Mikro-Domain von Interesse mit einer Mikropipette mit Farbstoff entweder Label geladen gezielt eine Population von neuronalen Zellkörper oder Etikett eines einzelnen Neurons, dass Dendriten, Stacheln und Axone sichtbar sindvivo. Unsere Verbesserungen gegenüber bisherigen Methoden ermöglichen eine Untersuchung der neuronalen Struktur-Funktions-Beziehungen mit sub-zellulärer Auflösung im Rahmen des Neokortex funktionalen Architekturen.

Protokoll

Ein. Chirurgische Vorbereitung

  1. Induzieren Anästhesie und kontinuierlich überwachen Herzfrequenz, endexspiratorischen CO 2, EEG und Temperatur. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt und wurden auf die wir zuvor veröffentlichten 9,15 basiert.
  2. Setzen Sie den dorsalen Oberfläche des Schädels, indem die Haut mit einem Skalpell. Sezieren die Bindegewebe über dem Knochen mit einer Brudon Kürette. Reinigen Sie die Knochen mit Wattestäbchen Applikatoren und Baumwollgaze. Bewerben Knochenwachs (bei Bedarf) auf den Schädel, gelegentlich Blutungen durch kleine Emissarien stoppen.
  3. Bringen Sie einen Titan oder Edelstahl Kopfplatte auf den Schädel (über die Region von Interesse, wo die Kraniotomie durchgeführt werden), indem Zahnzement mit schwarzer Farbe (siehe Materialien) gemischt. Eine rechteckige Öffnung in der Mitte der Kopfplatte bietet Zugang für den Kraniotomie und optische Bildgebung. Bringen Sie ein Metall-Kammer auf der Oberseite des Kopfes Platte. Diese Kammer wird als Fluidreservoir zur Bildgebung dienen mit dem Wasser Immersionsobjektivlinse.
  4. Sichern Sie die Kopfplatte mit einem xy mit Metall-Beiträge.
  5. Auszudünnen einen großen Bereich des Knochens innerhalb der rechteckigen Öffnung der Kopfplatte durch Verwendung eines Dentalbohrers. Der zu verdünnen muß gut über die Grenzen des geplanten Kraniotomie erstrecken. Die dicke Schädel des nicht-Nagetier-Säuger muss ausgedünnt, wenn Bilder mit hoher Auflösung aus der Großhirnrinde erworben werden, weil am Ort Kraniotomie, die Dicke des Knochens wird die Dicke der Agarose zwischen dem Deckglas und neokortikalen Oberfläche diktiert werden (siehe unten) .
  6. Bohren eines 2 x 2 mm quadratischen Umriss im Knochen für die Kraniotomie. Spülen Sie die Kammer regelmäßig mit frischen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) an Knochen Scherben zu entfernen und zu minimieren Wärmeabgabe an den zugrunde liegenden Kortex. Bewerben Knochenwachs nach Bedarf auf gelegentliche Blutung zu stoppen.
  7. Lift der Knochen Klappe mit einem # 3 Pinzette.
  8. Entfernen Sie alle, aber die untere Schicht der Dura mit einer feinen Pinzette (# 5CO) und Vannas Frühjahr Schere. Die Dura in Nicht-Nagetier Säugetieren ist dick und undurchsichtig, kann aber in verschiedenen Schichten entfernt werden. Blutung ist selten, kann aber mit Gelfoam gestoppt werden und kein Blut Rückstände sollten vorsichtig aus dem verbleibenden Schicht der Dura mit einer Pinzette und Spülen mit ACSF entfernt werden. Die letzte Schicht der Dura ist transparent und Pia Schiffe sollten deutlich sichtbar sein durch. Verlassen dieses letzte Schicht der Dura intakt während intrinsische Signal Bildgebung die Erfolgsrate der Bulkbeladung fluoreszierender Kalzium-Indikatoren für die anschließende Zwei-Photonen-Imaging-Phase des Experiments zu erhöhen (siehe Diskussion).
  9. Geben Sie einen Tropfen warmen 2% Agarose (gelöst in ACSF) und sofort einen Deckglas über die Kraniotomie. Prüfen der Kraniotomie um sicherzustellen, dass respiratorischen und Herz-Kreislauf Pulsationen minimal sind durch Verwendung eines chirurgischen Präpariermikroskop oder die Okulare des zweiteiligenPhotonen-Mikroskop im Hellfeld-Modus.

2. Intrinsic Signal Optical Imaging

  1. Hinzufügen Gel-Schaum mit ACSF um die Außenseite des Abdeckglases, um die Agarose von Trocknung während intrinsische Signal Bildgebung verhindern eingeweicht.
  2. Bringen Sie die intrinsische Signal Imaging CCD Kamera mit dem Standard-C-Mount-Anschluss auf der Oberseite des Zwei-Photonen-Mikroskop (Abbildung 1). Legen Sie die Beleuchtungslichtquelle in der Luft Tisch in der Nähe der xy-Ebene (Abbildung 1A). Position und sichern Sie die Lichtleiter über die Kraniotomie und Kopfplatte / Kammer (Abbildung 1B). Einfahren des primären dichroitischen Spiegel und die unterhalb der C-Mount-Port, so dass das reflektierte rote Licht für intrinsische Signale benötigt wird direkt von der Kraniotomie zur CCD-Kamera (1C-D). Mit dem 4x Luftobjektiv (0,13 NA, 17 mm WD), einem 2 x 2 mm Sichtfeld ist für intrinsische Signal Bildgebung zur Verfügung.
  3. Legen Sie eine Wärme-Filter in der light Pfad, um den Kortex von Erwärmung zu verhindern. Verwenden eines Filters, der grünes Licht (546 nm Mittelpunkt λ) und Aufzeichnen eines digitalen Referenzbildes der kortikalen Oberfläche Blutgefäße hindurchgeht.
  4. Bewegen Sie den z Fokus auf 500 um unterhalb der kortikalen Oberfläche. Verwenden Sie einen roten Filter (630 nm Zentrum λ), um den Cortex zur Messung intrinsische Signale zu beleuchten. Positionieren Sie die Lichtleiter, so dass die kortikale Oberfläche gleichmäßig ausgeleuchtet wird. Abschirmen Kraniotomie aus dem Licht von dem visuellen Stimulus-Display hergestellt. Präsentieren Sie eine Abfolge von visuellen Reizen und aufzeichnen Reflexionsdaten Bildern. Um eine Ausrichtung der Karte innerhalb von 10 min zu erzeugen, Daten erfassen, welche 4 Wiederholungen einer Sequenz von 8 Stimuli (4 Orientierungen und zwei Richtungen für jede Richtung).
  5. Analysieren Sie die intrinsische Signal Daten an eine falsche Farbe Orientierungsplan generieren. Wählen potenziellen Zielregionen für Zwei-Photonen-Kennzeichnung von Neuronen, zB Orientierung pinwheel Singularitäten - Punkte in der Karte, woAlle bevorzugten Orientierungen konvergieren (Abbildung 2A). Überlagern die Ausrichtung der Karte und das Bild der kortikalen Oberfläche Gefäßsystem (2B-C). Verwenden das Layout der funktionalen Domänen und die Lage der großen Oberfläche Gefäße, um ein Ziel auszuwählen, die Vermeidung Bereichen mit großen Blutgefäßen und Arteriolen 15.

3. Bulk Loading fluoreszierender Kalzium-Indikatoren

  1. Vorbereiten einer Lösung aus 20% Pluronic / DMSO nach Zugabe von 1 g Pluronic in 5 ul DMSO. Das Gemisch wird bei 60 ° C für 10 min bis zum vollständigen Lösen des Pluronic. Man läßt das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen. Add 4 ul des Pluronic / DMSO-Gemisch zu einer 50 ug Fläschchen der fluoreszierende Kalzium-Indikator Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Dann fügen Sie 1 ul einer roten Farbstoff (Alexa Fluor 594, 2 mM Stammlösung) und 35 ul der Pipette Lösung (siehe Materialien) für eine Endkonzentration von 1 mM OGB-01.00. Beschallen die Lösung für ½ Stunde inein gekühltes Wasserbad und dann Zentrifuge mit einer 0,45 um-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen.
  2. Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einem äußeren Durchmesser der Spitze von 2,0-2,5 um. Beladung 5 ul der Farbstoffmischung in die Pipette.
  3. Entfernen Sie die letzte Schicht, um Dura Pipette Einführen zu erleichtern und zu erhalten, die höchste Qualität Zwei-Photonen-Bildern.
  4. Bestimmung der exakten Position auf der kortikalen Oberfläche daß die Pipette platziert werden muss, um sein Ziel in kortikalen Schicht 2/3 zu erreichen. Unsere vorgegebenen kortikalen Ziel ist ein Windrad Singularität in der Ausrichtung Karte (Abbildung 2). Die Pipette ist in die Rinde in einem 30 °-Winkel angetrieben werden, um zwischen der Kammerwand und dem Ziel passieren. Somit, um die Zielregion 200 um unterhalb der kortikalen Oberfläche bezeichnen, wird die Pipette Eingabeposition auf der kortikalen Oberfläche ungefähr 350 um quer zur Soll-Position (3 AB) sein.
  5. Bewegen des XY-Tischs (an dem das Tier und die pipette Mikromanipulator platziert sind) für die Zentrierung der kortikalen Oberfläche Eintrittsposition unter dem Objektiv (3C). Verwenden Sie ein 20x oder 40x-Objektiv mit einem Arbeitsabstand (WD) von mindestens 3 mm (siehe Materialien), um sicherzustellen, dass die Pipette wird leicht in die Hirnrinde, ohne das Ziel oder den Knochen an der Wand entlang der Kraniotomie. Sobald der Eintrag Position unter dem Ziel zentriert ist, erhöhen die Z-Position des Ziels um 2 mm (Figur 3D). Mit der grüne Auflicht-Fluoreszenz Licht eingeschaltet, um den roten Farbstoff Alexa in der Pipette zu visualisieren, benutzt das diagonale Achse der Mikromanipulator, um die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze zentriert ist (und fokussiert) unter dem Objektiv unmittelbar oberhalb der kortikalen Oberfläche Eingabeposition ( Abbildung 3E).
  6. Pipette senkrecht abzusenken (entlang der z-Achse), bis die Pipette erreicht den kortikalen Oberfläche (3F), die sich während kontinuierlich die Pipettenspitze durch die okulars des Mikroskops. Verwendung Hellfeldbeleuchtung sind die kortikalen Oberfläche Blutgefäße und verbleibende Meningen (pia und Arachnoidea) leicht sichtbar wie die Pipette den kortikalen Oberfläche nähert. Wenn die Pipette nicht erreicht den gewünschten Eintrag Position, heben Sie die Pipette und kalibrieren Targeting basierend auf den vaskulären Wahrzeichen an der kortikalen Oberfläche.
  7. Entfernen Sie das Ziel, Wick überschüssige Liquor aus dem Kraniotomie und trocknen Sie die angrenzenden Knochen mit fusselfreien Absorption Speeren. Geben Sie einen Tropfen warm 3% igen (gelöst in ACSF), um den Kortex, sichtbar durch die Kraniotomie (3G) ist zu stabilisieren. In Nicht-Nagern, 3% Agarose notwendig Pulsationen für eine erfolgreiche Aufnahme von fluoreszierenden Farbstoffen durch Neuronen zu dämpfen. Für intrinsische Signal Abbildungsoptik nur 2% Agarose ist erforderlich, da die Kombination von 2% Agarose und dem Deckglas für die nötige Stabilität. Hier wird kein Deckglas des Farbstoff-Ladeschritt so 3% Agarose verwendet wirdnotwendig. Nach Erstarren der Agarose, legen Sie eine 40x-Objektiv (0,8 NA, 3,3 mm WD) und neu füllen den Raum mit ACSF.
  8. Wechseln Sie von Hellfeld-, zwei-Photonen-Leser und suchen Sie die Pipettenspitze. Verwendung der diagonalen Achse des Mikromanipulators, die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze erreicht die gewünschte Tiefe in der Rinde (Abbildung 3H). Gelegentliche Druck Auswerfen puffs der Farbstoffmischung (ein paar psi, wobei jeder Impuls 0,1 sec) verhindern helfen Pipettenspitze verstopfen. Da Uhr OGB-1 nur sichtbar beim Betreten Zellen, ist der rote Farbstoff Alexa entscheidend für die Visualisierung der Pipettenspitze in der Hirnrinde.
  9. Vor dem Versuch, Neuronen in kortikalen Schicht 2/3 mit der vollen Dosis von Farbstoff zu laden, erneute Fokussierung des Ziels auf der kortikalen Oberfläche, um die Tiefe der Pipettenspitze zu bestätigen und sicherzustellen, dass die Spitze an der Zielposition ist, basierend auf dem Layout Oberfläche der Blutgefäße. Wenn die Pipette in Layer 2/3, sollten kleine puffs der Farbstoffmischung leuchten dieextrazellulären Raum und zeigen eine dichte Montage von runden Zellkörper als dunkle Schatten.
  10. Zum Laden neuronale Zellkörper in einer Sphäre des Cortex 300-600 Mikrometer Durchmesser, injizieren die Farbstoffmischung in den extrazellulären Raum mit 30-90 Pulsen, wobei jeder Impuls 1,0 sec, 2-10 psi. Die Impulse der Druck sollte nicht so stark sein, dass das Gewebe bewegt. Nach der Injektion abgeschlossen ist, warten Sie ein paar Minuten, dann entfernen Sie die Pipette und objektiv. Warten Sie 1 Stunde, damit der OGB-01.00 vollständig aufgewickelt werden von Neuronen.
  11. Entfernen Sie die Agarose für den Farbstoff Be-und spülen Sie die Aufnahme Kammer. Setzen Sie einen kleinen Tropfen von 2-3% Agarose auf der Oberfläche und schnell platzieren ein Deckglas über die Kraniotomie. Da die Fluoreszenzfarbstoffe lichtempfindlich sind, vermeiden Überbelichtung des Kortex Hellfeld-oder epi-fluoreszierendes Licht. Legen Sie eine hohe NA (1,0) 20x-Objektiv in das Objektiv Halter und re-Zentrum der markierten kortikalen Bereich unter dem Objektiv mit der xy. Schirmen die Kraniotomie aus Extraneous Lichtquellen, zB visuellen Stimulus Display, unter Verwendung mehrerer Schichten aus Blackout Material.

4. Single-cell Elektroporation von Fluoreszenzfarbstoffen

  1. Für die Untersuchung dendritische Morphologie, bereiten eine Lösung von 100 uM Alexa Fluor 594 (1:20 Verdünnung in ACSF von 2 mM Alexa Fluor 594 Aktien). Für die funktionelle Bildgebung von Dendriten eine OGB Salz kann 16,17 verwendet werden.
  2. Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einer Spitze Größe von 1 um und laden Sie 5 ul Farbstoff in die Pipette. Alle weiteren Schritte des Targeting eine funktionelle Domäne sind identisch mit dem Bulkbeladung Methode (Figuren 1-3). Um die Pipettenspitze benachbart zu einem neuronalen Zellkörper Membran positionieren, überwachen die Erhöhung Elektrodenimpedanz und Druck Sprühstöße von Farbstoff auf den extrazellulären Raum zu beleuchten und sehen Zellkörper als Schatten während Zwei-Photonen-Bildgebung.
  3. Wenn die Pipettenspitze neben einem neuronalen Zellkörper Membran ist, verwenden Sie die Axoporator 800A anzuwenden1-3 Impulsen (-8 bis -10 V, 10 ms Puls). Die sofortige Füllung des Neurons mit Farbstoff ist leicht sichtbar mit zwei-Photonen-Mikroskopie. Nehmen Sie die Pipette und sammeln hochauflösende Bilder von Dendriten und Axone in vivo.

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Ergebnisse

Um die Genauigkeit der Farbstoff Markierungsverfahren veranschaulichen, gezielte wir den kleinsten Mikro-Domäne von irgendeinem bekannten funktionellen Karte im nicht-Nagetier Neocortex. Dünn ganzen Orientierungsplan in der primären Sehrinde unterbrochen sind Singularitäten. Diese treten an Stellen, wo alle bevorzugten Orientierungen konvergieren, so dass in Falschfarben Karten der bevorzugten Orientierung, die Regionen um die Singularität aussehen "Windräder" (2A-B). Ein Windrad pro Kraniotom...

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Diskussion

Wir präsentieren eine Methode, um die Etikettierung von neuronalen Zellkörper (oder Dendriten und Axone) in vorgegebenen funktionalen Mikrodomänen des Neokortex Ziel. Zusammenführen intrinsische Signal optischen Bildgebung mit Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, zu bestimmen, welche Zellen Synapsen und tragen zur Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte, ob neuronalen Selektivität korreliert mit der Position des Neurons in einem funktionellen Karte, und die neuronale Schaltungskomponenten dass Ve...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Gnade Dion für das Verfolgen der Dendriten in 5A gezeigt;; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute R01EY017925 und R21EY020985 und Finanzierung von den Dana & Whitehall Foundations PK Wir danken auch Matthew Petrella für die Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen unterstützt und Pratik Chhatbar für Anmerkungen zum Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenz / Material Firma Katalog-Nummer Kommentare
Ein. Life Support / Experiment prep
Isofluran Webster Vet NDC 57319-474-05
Isofluran Verdampfer Midmark VIP 3000
Feedback geregelten Heizdecke Harvard Apparatus 50-7079F
EKG-Monitor Digicare Biomedical LifeWindow Lite
EEG-Verstärker AM-Systems 1800
EEG Monitor Hewlett Packard 78304A
Endexspiratorischen CO 2-Monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimieren Belüftung
Hartmetallbohrer Grate zum Bohren Knochen Henry Schein feine (0,5 mm Spitze) und grob (1,25 mm Spitze)
Zement für Kopfplatte / Kammermusik Dentsply 675571, 675572
Black Powder Tempera Farbe Sargent Art Inc. 22-7185 In den Zement zu lichtabschirmende verbessern und Reflexionen
Agarose - Typ III-A Sigma A9793 Zur Minimierung Pulsationen während intrinsische Signal und Zwei-Photonen-Imaging
Deckglas: 5 oder 8 mm Durchmesser, 0,17 mm Dicke World Precision InInstrumente 502040, 502041 Zur Minimierung Pulsationen während der Bildgebung kann die Deckglas nach Bedarf geschnitten werden
Brudon Küretten George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Reinigung Kopfoberfläche
Knochenwachs Ethicon W31G Schnell Blutungen stoppen
Wattestäbchen Electron Microscopy Sciences 72308-05 Saubere und trockene Knochenoberfläche
Dumont # 5CO Forceps Fine Science Tools 11295-20 Schnappen einzelnen Schichten der Dura oder pia
Vannas Federschere Fine Science Tools 15000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 Um Blutungen auf der Dura zu stoppen
Absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Ultra-schnelle und fusselfreien Aufsaugen von CSF
Blackout Material Thorlabs BK5 Schild Kraniotomie
2. Farbstoffzubereitung / Einspritzung
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma D2650
Pluronic Sigma P2443
Oregon Green 488 BAPTA-01.00 Invitrogen O6807 Calcium-Indikator
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438
Centrifugal Filter (0,45 um Porengröße) Millipore UFC30HV00 Um Verunreinigungen vor der Injektion zu entfernen
Glaspipette puller Sutter Instruments P97
Borosilikatglas Fäden verbundene Kapillare (1,5 mm Außendurchmesser) World Precision Instruments 1B150F-4 Dye Auswerfen Pipette
Microloader Eppendorf 5242 956 003 Zum Be-Farbstoff in Pipette
Micromanipulator Sutter Instruments MP-285 Um Pipettenposition
Pressure Impulsregler Parker Hannifin PicoSpritzer III Für Einspritzung des Farbstoffes
Einzelzell-Elektroporators Molecular Devices Axoporator 800A Zur Elektroporation des Farbstoffs
3. Intrinsic imaGing
4x Objective (0,13 NA, 17 mm WD) Olymp UPLFLN4X
Intrinsic Hardware / Software Optical Imaging Inc. Imager 3001 / VDAQ VDAQ Software ist für episodische Bildgebung
CCD-Kamera Adimec Adimec-1000
Lichtquelle Stromversorgung KEPCO ATE 15-15M
Lichtquelle Optical Imaging Inc. HAL 100 Lichtstärke an der kortikalen Oberfläche beträgt 3-5 mW
Grün-Filter (für vaskuläre Bild) Optical Imaging Inc. λ = 546 nm (Bandpass 30 nm) Für Referenzbild der Oberfläche Gefäßsystem
Red Filter (für eigensichere Signal) Optische Imaging Inc. λ = 630 nm (Bandpass 30 nm) Um intrinsische Signale zu sammeln
Wärmeschutzfilter Optical Imaging Inc. KG-1
4. Zwei-Photonen-rig / Imaging
Zwei-Photonen-Mikroskop und Software Prairie Technologies Siehe Shen et al. 2012 für Lichtweg, Filter und Laserleistung
Ti: Saphir-Laser Spectra-Physics Mai Tai XF
20x (0,5 NA, 3,5 mm WD) Olymp UMPLFLN20X 0,5 NA Ziel ist nur zum Ausrichten Pipette über die Kraniotomie verwendet (nicht für Zwei-Photonen-Imaging)
20x (1,0 NA, 2,0 mm WD) Olymp XLUMPLFLN20X
40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) Olymp LUMPLFLN40X/IR
Lufttisch Newport ST-200 Trennt Vorbereitung von externen Vibrationen
xy Mike Machine Co. (Attleboro, MA) Versuchsperson und Sutter Mikromanipulator auf xy Bühne platziert
Rezepte
Künstliche Cerebrospinalflüssigkeit NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4
Pipette Lösung 14 NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4

Referenzen

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