Method Article

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

DOI:

10.3791/50047

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May 3rd, 2013

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1Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis , 2NSF Center for Biophotonics Science & Technology, University of California, Davis , 3University of Tromsø, 4Department of Surgery (Division of Surgical Oncology), University of California, Davis , 5UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis , 6Department of Biological Chemistry, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Abstract

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Prostatakrebs ist die führende Form von malignen Erkrankungen bei Männern in den USA Während der Operation trägt ein erhebliches Risiko von Impotenz und Inkontinenz, haben traditionelle chemotherapeutische Ansätze weitgehend erfolglos. Hormontherapie ist in einem frühen Stadium wirksam, aber oft nicht mit dem späteren Entwicklung von Hormon-resistentem Tumoren. Wir haben in die Entwicklung von Therapeutika für bestimmte metabolische Mangel von Tumorzellen interessiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Prostata-Tumorzellen spezifisch fehlt ein Enzym (Argininosuccinatsynthase oder ASS) für die Synthese der Aminosäure Arginin 1 beteiligt. Dieser Zustand bewirkt, dass die Tumorzellen abhängig zu werden exogenen Arginin, und sie unterziehen metabolischen Stress, wenn der freie Arginin durch Arginindeiminase (ADI) 1,10 aufgebraucht ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass die menschliche Prostata-Krebszellen CWR22 Rv1 effektiv durch ADI mit Caspase-unabhängige Apoptose und aggressive autopha getötetgy (oder Makroautophagie) 1,2,3. Autophagie ist ein evolutionär konservierten Prozess, Zellen zu verstoffwechseln unerwünschte Proteine ​​durch lysosomalen Abbau während Ernährungs Hunger 4,5 ermöglicht. Obwohl die wesentlichen Komponenten dieses Weges gut charakterisierten 6,7,8,9 sind, sind viele Aspekte der molekularen Mechanismus noch unklar - insbesondere, was ist die Rolle der Autophagie in den Tod-Reaktion von Prostata-Krebszellen nach Behandlung ADI ? Um diese Frage zu beantworten, benötigten wir ein experimentelles Verfahren, um das Niveau und den Umfang der autophagic Reaktion in Zellen zu messen - und da es keine bekannten molekularen Markern, die genau verfolgen können diesen Prozess sind, entschieden wir uns für ein bildgebendes Ansatz zu entwickeln, mit quantitative 3D Fluoreszenzmikroskopie 11,12.

Mit CWR22Rv1 Zellen mit fluoreszierenden Sonden für Autophagosomen und Lysosomen speziell markierten, zeigen wir, dass 3D-Bild Stapel entweder mit wi erworbendefield Entfaltung Mikroskopie (und später, mit Super-Auflösung, strukturierte Illumination Microscopy) eindeutig erfassen die frühen Phasen der Autophagie Induktion. Mit kommerziell verfügbaren digitalen Bildanalyse, können wir leicht zu bekommen statistische Informationen über Autophagosom und Lysosomen Anzahl, Größe, Verteilung und Grad der Kolokalisation von jedem abgebildeten Zelle. Diese Informationen ermöglichen es uns, genau zu verfolgen den Fortschritt der Autophagie in lebenden Zellen und ermöglicht unseren fortgesetzten Untersuchung in die Rolle der Autophagie in Krebs-Chemotherapie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Teil 1: Zellkultur und Immuno-Fluoreszenz-Labeling

  1. Wachsen CWR22 Rv1 menschlichen Prostata-Tumorzellen auf Deckgläschen (# 1.5 bzw. 170 um Dicke) in 6-well Platten mit RPMI (Mediatech, VA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Glutamin.
  2. Induce Autophagie durch Behandlung mit ausgewählten Proben Arginindeiminase (ADI, 0,3 ug / ml) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
  3. Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA, Fisher Scientific, NH) in PBS verdünnt; 100 ul pro Deckglas für 10 min bei RT.
  4. Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA.
  5. Durchdringbar Zellen mit 0,05% Saponin (Sigma, MO) in HEPES (HBS) / BSA, 100 ul pro Deckglas 15 min bei RT.
  6. Vor der Immuno-Kennzeichnung, Block Proben mit 2,5% Casein (Sigma, MO) in HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas für 1 h bei RT.
  7. Inkubieren fixierten Zellen mit primären Antikörpern in 2,5% Casein / HBS / BSA, 100 ul pro coversl verdünntip, O / N bei 4 ° C.
  8. Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA.
  9. Inkubieren fixierten Zellen mit sekundären Antikörpern in 2,5% Kasein / HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas verdünnt, 1 h bei RT.
  10. Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA.
  11. Montieren vorbereiteten Deckgläser auf reguläre Glas Objektträger mit SlowFade Gold-oder Gold-Verlängern antifade Reagenz (Invitrogen, CA) mit 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI).
  12. Seal Deckglas Kanten mit Nagellack. Für beste Bildergebnisse, damit sie rechtzeitig (idealerweise O / N) für anti-fade Medien gründlich durchdringen Zellen.
  13. Saubere Deckglas mit Methanol und / oder Chloroform.
  14. In Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 bei der Bildgebung bei 37 ° C oder 1,516 bei der Bildgebung bei RT) an die 60X 1,42 NA Objektiv (Olympus, Japan).
  15. Position gleiten auf der Bühne und schaffen Mikroskop Fokus mit den Zellen von Interesse.

2. Teil 2: Herstellung von Zellen, für Live-Imaging

  1. Wachsen CWR22 Rv1 Zellen, die grün fluoreszierendes Protein-gekoppelten Light Chain 3 (LC3-GFP) in RPMI Kulturmedium, enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika auf 35 mm Poly-D-Lysin beschichteten Glasboden Kulturschalen (MatTek, MA). Die Zellen sollten in ausreichender Dichte beschichtet werden, um eine schnelle Verbreitung zu erleichtern, aber nicht so viel, dass die Zellen überwachsen und verklumpt durch die Zeit der Bildgebung sind.
  2. Gönnen ausgewählt Zellproben mit ADI (0,3 ug / ml) in PBS.
  3. Etwa 1 Stunde vor der Bildgebung, verdünnte 1,5 ul LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) mit 20 ml RPMI. enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika. Mit Lösungen, die ADI für ausgewählte Proben. Halte alle Medien auf 37 ° C vor der Zugabe in der Kulturschale.
  4. Inkubieren Zellen mit RPMI mit LysoTracker Red DND-99 für 15-45 min bei 37 ° C
  5. Etwa 30 min vor der Bildgebung auf der WeatherStation Schutzgehäuse drehen und ermöglichen bis 37 ° C ins Gleichgewicht und 5% CO 2 (mit Humidified Luft).
  6. Waschen der Zellen mit PBS gewaschen und ersetzen Medien mit Standard-RPMI mit nur 10% FBS und 1% Antibiotika. In ADI um Proben wie angegeben.
  7. Berg 35 mm Deckglas-bottom Kulturschalen in kundenspezifische Adapter (Applied Precision, Inc., WA), und die Position auf dem Mikroskop Bühne. Verwenden Immersionsöl (Brechungsindex 1,520) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv, und positionieren Sie den montierten Kulturschale auf der Bühne.

3. Teil 3: Dekonvolution Microscopy and Analysis

Das Protokoll in diesem Abschnitt wird vorausgesetzt, die Verwendung des DV DeltaVision Persönliche Entfaltung Mikroskop und zugehörigen SoftWorX Application Suite (Applied Precision, Inc., WA).

  1. Schalten Sie Mikroskop-System, einschließlich der Akquisitions-Workstation und Instrument-Controller. Öffnen Resolve3D Anwendung das Mikroskop Bühne und wiederum auf der Xenon-Lichtquelle zu initialisieren. Warten Sie 10 min für Lichtquelle, um sich aufzuwärmen und erreichen einen stabilen Bedingungen.
  2. HinzufügenTropfen Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 für lebende Proben, die bei 37 ° C oder 1,516 für feste Proben bei RT) auf der 60X 1,42 NA Objektiv und Zentrum Gewebeprobe (Deckglas nach unten) über die Objektivlinse.
  3. Entweder mit Hellfeld-oder Außenbeleuchtung und Grobfokus Einstellknopf langsam erhöhen Objektivlinse bis der Wulst Immersionsöl Kontakt mit dem invertierten Deckglas. (Von diesem Punkt die Zellschicht sollten in den Fokus innerhalb von ein paar Windungen der feinen Schärfe einzustellen Knopf kommen). Bei der Arbeit mit festen Proben auf den Objektträgern, ist es empfehlenswert, Zellen innerhalb oder in der Nähe von Gebieten mit Blasen zu vermeiden. Bei der Anzeige mit Live-Proben auf dem Glasboden-Gericht, zu vermeiden Bewegen der Objektivlinse außerhalb der Grenze des Deckglas.
  4. Autophagosomen kann durch eGFP-Signal (grün) identifiziert werden. Lysosomen sind von LysoTracker Red (live Probe) oder anti-Lamp1 Fluoreszenz-Antikörper (feste Probe) identifiziert. Zellkerne sind durch DAPI st identifiziertaining (feste Probe).
  5. Wählen Sie die gewünschte Sichtfeld. Im Idealfall sollten die Zellen gut Fluoreszenzsignal in allen geeigneten Kanäle aufweisen und ausreichend befestigt und auf dem Deckglas Oberfläche, so dass die intrazelluläre Inhalte einfach zu visualisieren sind verteilt. Kleine Änderungen in seitlicher x-, y-und z-Ausrichtung kann durch den Computer unter Verwendung des Acquire3D Schnittstelle gesteuert werden. Setzen Binning 1x1 bis 2x2 oder, je nach gewünschter Sichtfeld (mehr Zellen können in das Feld, wenn Binning auf 2x2 gesetzt ist zu sehen).
  6. Für ein gegebenes Bild durch den Mittelteil einer Zelle, die Belichtung Parameter (zB% Sendeleistung und Belichtungszeit), so dass die maximale Pixelintensität nicht überschreitet 3000 zählt. Im Allgemeinen sollte% Transmission so niedrig wie möglich eingestellt werden, ohne Erhöhung der entsprechenden Belichtungszeit länger als 1 Sekunde. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fluoreszenz Farbe abgebildet werden und für jeden einzelnen Bereich der Blick auf die Bilder von höchster Qualität zu erhalten.
  7. Stellen Sie die upper und unteren Grenzen des Z-Stapel durch Einstellen des Fokus nur geringfügig über die oberen und unteren Ende der Zellprobe sind. Die Gesamtzahl der Bilder in einer bestimmten Z-Stapel wird somit durch diese Grenzwerte und durch den Abstand zwischen den Schichten (: 0,2 um Voreinstellung) bestimmt werden.
  8. Um Bewegungsartefakte während der Bildaufnahme zu minimieren, empfehlen wir, die Bildaufnahme-Modus auf "Wellenlänge dann z-Stapel" für feste Proben, und "z-Stapel dann Wellenlänge" für Live-Proben.
  9. Fluoreszenz-Bilder werden mit entfalteten SoftWorX (Applied Precision, WA) und später unter Verwendung Volocity (Improvision, jetzt Perkin Elmer, MA).

4. Teil 4: Super-Auflösung, Structured-Beleuchtung (OMX) Mikroskopie

Das Protokoll in diesem Abschnitt gilt für die Nutzung der OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA).

  1. Schalten Sie den Netzschalter aus und gewünschte Laser (410 nm, 488 nm und / oder 532 nm). Warten Sie, bis 20 kmn für die Laser thermisch stabilisiert werden.
  2. In Immersionsöl (Brechungsindex 1,516 für feste Proben bei RT) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv. Wenn Blasen in der Öltropfen zu sehen sind, reinigen Sie das Ziel und Öl wieder.
  3. Zeigen Probenobjektträger auf der Bühne und bei Bedarf lassen Sie 10 min für Zellen auf Deckglas begleichen.
  4. Initialisieren die Akquisition Programm. Verwenden Fluoreszenzbeleuchtung um den Fokus einzustellen, bis eine scharfe Kontur der Zelle zu sehen. (Es sollte zu allen Zeiten, um die Exposition von Zellen gegenüber Fluoreszenzanregung zu minimieren, bis die tatsächliche Bildaufnahme).
  5. Eine Spirale Mosaik Scan kann erworben, um größere Bereiche der Probe Vorschau auf Zellen oder Bereiche von Interesse auszuwählen. Es wird empfohlen, kurze Belichtungszeiten (1-10 ms) und niedrigen Anregungsenergie (0,1-1% Transmission) verwenden, während Abtasten der Probe oder der Suche nach Zielen.
  6. Identifizieren Autophagosomen von GFP-LC3 Fluoreszenz. Identifizieren Lysosomen von Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosom-assoziiertes Membranprotein) und Zellkerne mit DAPI (feste Proben).
  7. Wählen experimentellen Bedingungen einschließlich Anregungswellenlänge Bildbereich (zB 512x512), Stapeldicke, Belichtungszeit und Laserübertragung Prozentsatz. Für Super aufgelöste Bilder, sicherzustellen, dass die strukturierte Beleuchtung Option aktiviert ist. Für Entfaltung Mikroskopie an der OMX, wählen Sie die Option konventioneller Beleuchtung.
  8. Für die besten Ergebnisse Rekonstruktion Wählen experimentellen Bedingungen, so dass die maximale Intensität Zahl zwischen 10.000 und 15.000 ist während der Aufnahme. Wenn Bleichen ist ein Anliegen, kann Bildgebung bei einer niedrigeren Exposition (zählt zwischen 5.000 und 10.000) verwendet werden. Idealerweise sollte die Zählungen nicht um mehr als den Faktor zwei über die gesamte Erfassung und verringert sich um mehr als einen Faktor von vier zu vermeiden. Falls erforderlich, reduzieren Sie die Stapeldicke eine nachhaltige Intensität Zählung zu gewährleisten. Die Kamera sättigt mit 64.000 zählt, also maximal inIntensität sollte nie mehr als diese. Für eine gute Proben, fanden wir die experimentellen Bedingungen zu 10 sein ~ 50 ms Belichtungszeit mit 1% Laserübertragung. Helle und photostabil Proben, die immer wieder abgebildet werden können, werden bevorzugt. Eine stabile Fleck für Zeitraffer, super aufgelöste Bilder erforderlich.
  9. Um das Rauschen, ein 95MHz Auslesegeschwindigkeit (Medium Speed ​​Option) und den Erwerb von 2 ms oder mehr reduzieren wird empfohlen. Erhöhte Artefakte werden in der rekonstruierten abgebildeten, wenn die Probe während der Aufnahme bewegt erhalten. Aufgrund dieser Wirkung werden kurze Belichtungszeiten für nicht haftende oder sich schnell bewegende Zellen empfohlen.
  10. Mehrkanal-Bildgebung kann gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden. Modus Sequential Renditen weniger Übersprechen und wird daher empfohlen.
  11. Zur Reduzierung Bleichen, ist es im Allgemeinen dem Bild mit mehr Anregungswellenlängen ersten (532 nm, 488 nm, und 410 nm) empfohlen. Für den experimentellen Ergebnissen in Fig. 3 gezeigt, war das Rückwärtsd (dh 48 nm, 532 nm und 410 nm) auf die Photostabilität von diesem bestimmten Probe.
  12. Stellen Sie den oberen / unteren Grenze des Z-Stapel durch das Mikroskop zu bewegen, bis die Bühne oben / unten der Zellen ist etwas unscharf. Der gewünschte Abstand zwischen jedem Bild sollte konstant gehalten werden, um bei 0,125 für Super-Resolution Imaging, als Rekonstruktion Software nehmen diesen Wert als Standard.
  13. Rekonstruieren Bildstapeln mit SoftWorX (Applied Precision, WA) und analysieren mit Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA).

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Results

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Die Bildsequenz in 1 gezeigt sind die körperlichen Veränderungen, die in CWR22-Zellen auftreten, während der ersten 80 min der autophagy Induktion. In dieser und anderen Studien (nicht gezeigt) wir konsequent beobachtet: (1) Verschiebung des Kerns vom Zentrum der Zelle, (2) Reduktion der fokalen Adhäsion Punkte, und (3) allgemeine Translokation Autophagosomen und Lysosomen in Richtung der Mitte des Zelle. Darüber hinaus haben wir auch beobachtet einen leichten Anstieg in Kolokalisation (gelb) zwischen A...

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Discussion

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Während die direkte Beobachtung von Zellen mit fluoreszierenden Sonden gegen LC3 beschriftet wird weithin als Standard-Methode, um autophagic Antwort 6, quantitative 3D-Bildgebung des gleichen Systems (wie wir getan haben) bietet beispiellose Informationen und Details über den komplexen Prozess der zellulären Autophagie bestätigen akzeptiert . Insbesondere beobachten wir, dass Hunderte (wenn nicht Tausende) von Autophagosomen in lebenden Zellen innerhalb von 80 min Induktion der Autophagie gebildet werden. Eb...

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Zuschüsse: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Zentrum für Biophotonik Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Bold), das Forschungszentrum Council of Norway, Leiv Eiriksson Reisestipendium 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkennt auch die Unterstützung der Gemeinschaft Auburn Cancer Endowment Fund. RJ Bold erkennt auch die Unterstützung der J. McDonald Stiftung.

Wir danken Dr. Jenny Wei-Jen Kung und Dr. Bor-wen Wu bei DesigneRx für die großzügige Bereitstellung von ADI.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Arginin Deiminase (ADI)DesigneRx
HEPESSigmaH4034
CaseinSigmaC5890
ParaformaldehydFisher4042
SaponinSigmaS4521
Alexa Anti-Maus 555InvitrogenA21422
Alexa Anti-Kaninchen 647InvitrogenA21244
LysoTracker Rot DND-99InvitrogenL7528
Anti-Lamp1DSHBH4A3
Anti-CadherinCell Signaling#3195
SlowFade GoldInvitrogenS36936
35 mm Poly-D-Lysin beschichtete GlasbodenplatteMatTekP35GC-1.5-1.4-C
Nr.1, 22 mm DeckglasCorning#2865-22
ObjektträgerGlobe Scientific1324G

References

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