Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Ein Protokoll für Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) und High-Throughput-Durchflusszytometrie, polymere Gentransfer Nanopartikel evaluieren beschrieben. NTA eingesetzt wird, um die Nanopartikel Teilchengrößenverteilung und das Plasmid pro Teilchenverteilung charakterisieren. High-throughput Durchflusszytometrie erlaubt die quantitative Transfektion Wirksamkeitsnachweis für eine Bibliothek der Gentransfer Biomaterialien.

Zusammenfassung

Nicht-virale Gentransfer unter Verwendung von polymeren Nanopartikeln als attraktiver Ansatz für Gentherapie zur Behandlung genetischer Krankheiten ¹ und als Technologie für die regenerative Medizin ² entstanden. Im Gegensatz zu Viren, die erhebliche Sicherheitsprobleme haben, können Polymernanopartikel gestalten als nicht-toxisch, nicht-immunogenen, nicht-mutagen, leichter zu synthetisieren, chemisch vielseitig für die Beförderung von Fracht größeren Nukleinsäure und biologisch abbaubare und / oder ökologisch anspricht werden. Kationischen Polymeren mit negativ geladenen DNA über elektrostatische Wechselwirkung auf Komplexe in der Größenordnung von 100 nm, die üblicherweise polymere Nanoteilchen bezeichnet bilden selbst zusammen. Beispiele von Biomaterialien verwendet werden nanoskalige polykationischen Genabgabe Nanopartikel bilden, umfassen Polylysin, Polyphosphoester, Poly (Amidoamine) s und Polyethylenimin (PEI), welches ein nicht-abbaubaren off-the-shelf kationisches Polymer ist üblicherweise für Nukleinsäurelieferung ^1,3 verwendet. Poly (beta-aminoEster) s (PBAEs) sind eine neuere Klasse von kationischen Polymeren, die hydrolytisch abbaubare ^{4 5,6} sind und es wurde gezeigt, die bei Gentransport zu hart zu transfizierende Zelltypen wie menschlichen retinalen Endothelzellen (HRECs) ⁷ wirksam, Maus Brustepithelzellen ^8, menschliche Gehirn Krebszellen ⁹ und makrovaskuläre (humane Nabelschnur, HUVECs) Endothelzellen ^10.

Ein neues Protokoll zu polymeren Nanopartikel nutzen Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) charakterisieren beschrieben. In diesem Ansatz wird sowohl die Korngrößenverteilung und die Verteilung der Anzahl von Plasmiden pro Partikel ¹¹ erhalten. Zusätzlich wird ein Hochdurchsatz-96-Well-Platte für Transfektions-Assay schnelle Screening der Transfektion Wirksamkeit von polymeren Nanopartikeln vorgestellt. Bei diesem Protokoll, Poly (beta-Aminoesters) s (PBAEs) als Modell Polymeren und menschlichen retinalen Endothelzellen (HRECs) verwendet werden als mo benutztdel menschlichen Zellen. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um jegliche polymere Nanoteilchen und eine beliebige Zellart von Interesse in einer Multiwellplatte Format auswerten.

Einleitung

Die Bestimmung der Anzahl von Plasmiden pro Nanopartikel komplexiert ist eine wirksame Nanopartikel-Genabgabe Strategien, insbesondere zum Zusammenwirken Bereitstellung von mehreren Plasmiden zur selben Zelle Target gestalten, wie es oft in Stammzelle Umprogrammierung Studien ¹² erforderlich. Einige Ansätze, um die Anzahl von Plasmiden mit einer einzelnen Nanopartikel assoziiert berechnen beschrieben worden sind, und jeder Ansatz hat Nachteile in den Techniken zur Abschätzung ^13-16 verwendet. Quantenpunkt (QD) Markierung mit TEM kombiniert wurde verwendet, um Plasmide pro Teilchen in Chitosan basierende Nanopartikel abzuschätzen. Die Möglichkeit, dass verkapselte unmarkierten DNA nicht direkt erfasst;; potentiell überlappenden Plasmiden und QD in den 2D-TEM-Aufnahmen der Partikel; Schätzung mit diesem QD Technik ist aufgrund der Notwendigkeit, die DNA, die ihre Selbstorganisation Eigenschaften verändern kann beschriften kompliziert und anderen vereinfachenden Annahmen ^13. Ein alternativer Ansatz, a istpplicable wenn bestellt Mikrodomänen in den Teilchen vorhanden sind verwendet worden, um Lipopolyamin-DNA-Komplexe mittels Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Cryo-TEM), Röntgenstreuung und dynamische Lichtstreuung (DLS) ^14,15 studieren. Leider sind Materialien wie die polymeren Nanopartikel hier untersuchten entfällt bei dieser Methode. In einer anderen Studie verwendet Collins et al eine Strömung Teilchenfluß-Bildanalyse Technik zu studieren (Lys) _{16-enthaltende} Peptid / DNA-Komplexen;. Jedoch ihre Methode nur auswerten größeren, Mikrometergröße Partikel ^16. Somit haben wir kürzlich entwickelte eine neuartige flexible Assay, um die Anzahl von Plasmiden pro Nanopartikel ¹¹ quantifizieren.

Protokoll

Ein. Zellaussaat

1. Lassen Sie keine Zellen auf overconfluency wachsen. Verwenden frühen Passage Zellen, wenn Transfektion primärer Zellen.
2. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion der Zellen trypsinieren Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt die Zellsuspension mit Medien, um die gewünschte Zelldichte (Zellen / Volumen) zu erreichen. Seed Zellen in klare Gewebe mit flachem Boden 96-Well-Platten mit einem Reservoir und Mehrkanal-Pipetten Kultur behandelt. Die gewählte Dichte sollte 70-80% Konfluenz am Tag der Transfektion. Zum Beispiel, wie in Tabelle 1 dargestellt, wurden die Zellen auf 25 bis 50 Zellen / ul für die Transfektion Daten abgebildet verdünnt.

2. Zelltransfektion

1. Dilution von Polymer und DNA Aktien. Auftauen Polymer und DNA Stammlösungen bei Raumtemperatur (RT). Verdünnte Polymer-Stammlösung und DNA Stocklösung, getrennt in klaren 96-Well-Platten unter Verwendung eines Zwölf-Kanal-Pipette, Mit dem geeigneten Lösungsmittel, um Konzentrationen erforderlich, um die gewünschte DNA zu Polymergewicht Gewichtsverhältnissen (Gewicht / Gewicht) zu erhalten. In diesem Fall ist das gewählte Lösungsmittel 25 mM Natriumacetatpuffer (pH = 5,2).
   1. DNA-Verdünnung. Typischerweise wird die DNA mit 1 mg / ml gelagert Natriumacetat-Puffer auf eine Konzentration von 0,03 bis 0,06 mg / ml in einem klaren, nicht Gewebekultur-behandelten Platte mit 96 Vertiefungen (eine Vertiefung für eine einzelne Formulierung) verdünnt. Tabelle 2 zeigt, die typische DNA-Verdünnung Protokoll für einen einzigen Formulierung verwendet, um vier replizieren Wells in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit Zellen aus Schritt 1 ausgesät transfizieren.
   2. Polymer Verdünnung. Die 100 mg / ml Polymer / DMSO-Lösung wird in Natriumacetatpuffer gemäß der Konzentration, die erforderlich, um das gewünschte Polymer zu DNA wt / wt-Verhältnis zu erhalten verdünnt. Der Bereich der wt / wt-Verhältnisse typisch für die Genabgabe mit Poly (beta-Aminoesters) s (PBAEs) eingesetzt ist 20 bis 100 ist. PBAE Polymere ersten bis 10 mg / ml verdünnt, gefolgt von der Verdünnung pROTOKOLL wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Polymer-Verdünnungen in einem klaren, nicht Gewebekultur-behandelten Platte mit 96 Vertiefungen, die die Probe Orientierung des DNA Verdünnungsplatte übereinstimmt durchgeführt werden.
2. Nanopartikelbildung. Hinzufügen des PBAE Lösung zu einem gleichen Volumen der Plasmid-DNA-Lösung mit einer Zwölf-Kanal-Pipette und kräftig schütteln. Lassen Sie die Mischung inkubieren bei RT für 10 min bis self-assembly ermöglichen.
3. Nanopartikel Transfektion. Nach Selbstorganisation werden 20 ul pro Vertiefung Nanopartikel zum Kulturmedium tropfenweise über das Zwölf-Kanal-Pipette zugegeben. Die Wells werden unbehandelt oder mit im Handel erhältlichen Reagenzien als Kontrollen transfiziert. Die transfizierten Zellen werden bei 37 ° C für zwei bis vier Stunden und dann die Vertiefungen werden mit frischem Medium (100 pl / Vertiefung) ersetzt. Die Wahl der Inkubationszeit wird auf der Zelllinie Kulturbedingungen, und Transfektion Systems abhängen. Der Unterschied bei der TransfektionseffizienzEffizienz und Zelltoxizität als Ergebnis unterschiedlicher Inkubationsdauer wird durch die Analyse-Protokoll in Schritt 3 beschrieben quantifiziert werden.

3. Analyse der Transfektionseffizienz und Zelltoxizität

Transfektionseffizienz wird visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert und quantifiziert unter Verwendung eines Durchflusszytometers 48 Stunden nach der Transfektion. Zelltoxizität wird visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert und quantifiziert unter Verwendung des 96 CellTiter wässrigen Einkomponenten-Assay 24 Stunden nach der Transfektion.

1. Fluoreszenzmikroskopie. Optisch analysieren die Vertiefungen für die Expression des transfizierten Reportergens (beispielsweise EGFP oder DsRed) unter Verwendung der entsprechenden Fluoreszenz-Kanal. Erwerben Sie Bilder für jeden gut, die Wahl Sichtfelder, die entsprechend stellen die Transfektionseffizienz für die jeweiligen Formulierungen (Abbildung 1). Notieren Sie sich jeden Zelltoxizität visuell beobachtet.
2. Durchflusszytometrie.
   1. Verwenden Sie Mehrkanal-Pipetten, um die 96-Well-Platte für die Durchflusszytometrie vorzubereiten. Waschen mit PBS, mit 30 ul / Vertiefung von Trypsin / EDTA, mit 170 ul FACS-Puffer (PBS + 2% FBS) zu neutralisieren, Pipette nach oben und unten in jede Vertiefung, einschließlich an den Kanten trypsinieren, und übertragen Sie die gesamte 200-ul Volumen von jede Vertiefung in entsprechende Vertiefungen in einer Hin-und Boden-oder V-96-Well-Platte.
   2. Zentrifuge die Platte bei 130 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
   3. Entfernen 170 ul Medien von jedem gut und Pipette resuspendieren Zellen unter Vermeidung Blasen. So verwenden Sie eine Lebensfähigkeit wie Propidiumiodid (PI) zu färben, fügen Sie 10 ul FACS-Puffer + PI (50:1 FACS-Puffer: PI Verdünnung; PI Lager Konzentration 1 mg / ml) in jede Vertiefung. Sofort auf Eis legen und decken von Licht.
   4. Starten Sie den C6 Accuri Durchflusszytometer, die HyperCyt 96-well Anlage, und die HyperView Software. Verwenden HyperView Design und Protokoll Registerkarten, um die entsprechende p wählenspäten Typs, Platinenlayout und andere Einstellungen wie Shake / sip / spülen / schütteln Zeit. Für die oben Protokoll wurden die folgenden Parameter verwendet, eine pre-Platte prime für eine Minute und eine Pre-Platte shake für 30 sec bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. Sip Zeit für 15 Sekunden bei 15 Umdrehungen pro Minute eingestellt, spülen eine Sonde jeder gut für 2 sec und eine inter-gut schütteln alle 12 Brunnen für 12 sec bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. Die zwischen Bohrlöchern Shake ist wichtig, dass die Zellen dispergiert in den Medien, sowie für eine verbesserte Fähigkeit, um die Daten, indem zeitlich zwischen Gruppen von Vertiefungen (in diesem Fall 12 sek) zu verarbeiten.
   5. Verwenden HyperView Nun Registerkarte Identifikation die Daten und trennen sich in die entsprechende Vertiefung (Abbildung 2) zu verarbeiten. Um die einzelnen Vertiefungen zu erkennen, kann es helfen, die Software-Rauschfilter, sowie eine Basis sogar Filter unter den erweiterten Einstellungen zu verwenden.
   6. Quantifizierung Prozentsatz der positiv transfiziert lebenden Zellen durch geeignete Gating verschiedenen Pop trennenulations (Abbildung 3). Erste Seite Flow-Daten auf einem FSC vs SSC Streudiagramm, um einzelne Zellen aus Schutt (Abbildung 3A). Wenn Propidiumiodid (PI) verwendet wurde, Tor der einzelnen Zellpopulation und Ansicht, dass Daten auf einem FSC vs FL3 Grundstück, um lebende Zellen von toten Zellen und Gate die lebenden Zellen zu trennen. Um die Anzahl der transfizierten Zellen zu quantifizieren, das Live-Zellpopulation auf die entsprechenden Kanäle, beispielsweise GFP in FL1 gesehen werden. Verwendung des unbehandelten Population, die unbehandelten Zellen Gate, um das Hintergrundsignal (3B) zu identifizieren. Die positiv transfizierten Zellen können dann isoliert mit diesen Gate und durch Anzeigen der transfizierten Populationen unter Verwendung sowohl streuen und Konturplots (3C und 3D). Es kann ein Kontinuum von positiv transfizierten Zellen sein, da unterschiedliche Zellen an verschiedenen Graden an Fluoreszenz transfiziert wird.
3. CellTiter 96 wässrige One-Assay
   1. Transfizieren andere Platte in gleicher Weise für Zelltoxizität Messungen.
   2. Vormischung 1 ml der wässrigen Einkomponenten CellTiter 96 Assaylösung mit 10 ml frischem Medium. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und verwenden Sie eine Multikanal-Pipette bis 110 ul der vorgemischten Lösung + Medien pro hinzufügen.
   3. Die Extinktion bei 490 nm jede Stunde Intervall von 1 bis 4 Stunden, bis die Absorption aus dem Bohrloch zu unbehandelten Zustand ist im linearen Bereich des Assays. Gehören vier Kontrollvertiefungen mit einzige Lösung + Medien für einen Hintergrund Extinktion.
   4. Durchschnittliche die Absorption Werte aus den vier replicate Wells pro Zustand und subtrahieren die durchschnittliche Hintergrundabsorption voneinander Durchschnitt. Normalisieren Sie die korrigierte Durchschnitt für jeden behandelten Zustand der korrigierten Mittelwert der unbehandelten Zustand, um die prozentuale Zellviabilität zu bestimmen.

_title "> 4. Nanopartikel Sizing mit NTA und Plasmid Per Particle Berechnungen

1. Prime die Fluidik-System der NanoSight NS500, indem Sie das Verdünnungsmittel Pumpe nach vorne bei etwa 1:5 die maximale Geschwindigkeit und die Probe Pumpe rückwärts bei etwa 1:10 die Höchstgeschwindigkeit. Fortfahren, bis die Fluidik-System mit Verdünnungsmittel gespült wird.
2. Vorbereitung der Nanopartikel analysiert werden. Im Fall von PBAEs, getrennt verdünnt das Lager Plasmid-DNA (1 mg / ml) und Lager PBAE (100 mg / ml) in Natriumacetat-Puffer (25 mM, pH 5) in Eppendorf-Röhrchen.
3. Verdünnt das Plasmid-DNA-Konzentration auf 0,06 mg / ml. Polymer-Konzentration kann je nach dem erforderlichen Gewicht-Gewicht-Verhältnis von Polymer zu DNA (zum Beispiel für 60 wt / wt Teilchen wird Polymer zu 3,6 mg / ml verdünnt).
4. Hinzufügen der Polymerlösung zu einem gleichen Volumen der Plasmid-DNA-Lösung und mischt kräftig. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 10 min bis Selbstorganisation ermöglichen.
5. DiLaute die Nanopartikel-Lösung 100-fach in PBS, damit die Konzentration Nanopartikel in den geeigneten Bereich für NTA sein und um ein Endvolumen von mindestens 500 ul zu erhalten.
6. Laden der Probe in die NanoSight indem das Einwurfrohr in der Probe Eppendorfröhrchen (4A). Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.
7. In Capture-Modus, erhöht die Kamera waagerecht bis alle Partikel zu sehen. Stellen Sie den Fokus, so dass die Partikel glatter aussehen (4A und 4B).
8. Während im Standard-Modus, stellen Sie die Kamera waagerecht über den Punkt, dass alle Partikel auf dem Bildschirm zu sehen sind. Dann verringert sich die Kamera in der untersten Ebene, so dass die Teilchen alle noch beobachtet werden kann. Wenn ein Zwischenprodukt Kamera-Ebene erforderlich, in fortgeschrittenen Modus und ändern Sie den Kamera-Auslöser und gewinnen den entsprechenden Ebenen.
9. Sichtprüfung sicherstellen, dass es zwischen 20 bis 100 Teilchen auf der screen. Eine ideale Zahl für Nanopartikel Tracking ist etwa 50 Teilchen. Wenn es zu viele oder zu wenige sind, spülen Sie das NS500, passen Sie die Verdünnung in PBS, und wieder laden die Probe.
10. Stellen Sie die Dauer des Imports nach dem Standard-Tabelle. Typisch 30 - 60 sec ist eine geeignete Erfassung Länge (4B).
11. Um die nächste Probe laden, spülen Sie das System, dann erneut laden die neue Probe.
12. Einmal Videos erfasst werden, um die Verarbeitung der Bühne gehen durch die Eröffnung einer Videodatei.
13. Es gibt eine Reihe von Parametern, die abgestimmt werden kann, um zur bestmöglichen verarbeiten ein Video (4C). Das Ziel ist es, Parameter auswählen, die am besten zu erfassen jedes Partikel auf dem Bildschirm, wie durch ein rotes Kreuz Zeichen auf dem Bildschirm über jedes Teilchen (Abbildung 5) dargestellt.
14. Erhöhen Sie den Bildschirm Gewinn um besser sehen die Partikel. Unter dem Standard-oder erweiterten Modus, wählen Sie das Auto für die Parameter einstellen, indem ClickIng die entsprechenden Felder ein. In dem Fall, dass die automatischen Einstellungen nicht angemessen auszuwählen Partikel setzen, klicken Sie erneut die Box und manuell die Parameter (4C).
15. Sobald alle Partikel werden auf dem Bildschirm ausgewählt, klicken Sie auf die Schaltfläche Prozess der Software, um die Videodatei (4C) zu verarbeiten. Dies bietet die Teilchengrößenverteilung, Größendurchschnitte sowie Partikelkonzentration.
16. Um sicherzustellen, dass die Partikelkonzentration genau ist, ändern Sie die PBS Verdünnung, z. B. durch zunehmende Verdünnung durch 2x, und wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang. Messen mehrerer Verdünnungen derselben Probe wird empfohlen, dass die Konzentration Messung der Probe genau ist. Eine gute Auswahl für die Messung ist 10 ⁷ -10 ⁹ Partikel / ml.
17. Sicherstellen, dass alle Plasmide in Nanopartikel werden durch Ausführen Gelelektrophorese der Nanopartikel und Evaluieren, ob beliebige freie DNA vorliegt eingearbeitet.Wenn nicht alle Plasmide eingekapselt sind, verwenden Standard-Techniken zur DNA Absorption zu messen, um insgesamt gekapselte Plasmide zu quantifizieren.
18. Die durchschnittliche Anzahl von Plasmiden pro Partikel dividieren die Gesamtzahl eingekapselten Plasmidkonzentration von der NTA gemessene Teilchenkonzentration. Um das Plasmid pro Partikel Probenverteilungssystem abzuschätzen, zuerst die NTA Teilchengröße Histogramm, um den Volumenanteil der jeweiligen 1-nm-Bin der Teilchen zu berechnen. Multiplikation dieses Volumenanteils Verteilung durch die gesamte Plasmid Betrag, um die Anzahl von Plasmiden in jedem Bin erhalten. Unterteilen diese Nummern durch die Anzahl der Teilchen in jedem Fach, um die Anzahl von Plasmiden-per-Teilchens für jede Teilchengröße (Abbildung 6) zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines Beispiels für eine erfolgreiche Transfektion HRECs mit der EGFP-Plasmid. Die Hellfeld Bild ist hilfreich, um sicherzustellen, dass die Zellen ihre übliche Morphologie erhalten. Zusätzlich können Zelllebensfähigkeit Assays, wie MTS oder ähnliche Assays verwendet, um die Toxizität von Nanopartikeln ⁷ zu bewerten. Durchflusszytometrie, wie beschrieben, verwendet, um die Transfektionseffizienz zu quantifizieren. Bei Verwendung des Hy...

Diskussion

Die Protokolle über beschreiben Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit der Transfektion von Nanopartikel-Formulierungen sowie einen Weg, um die Teilchengröße und DNA Beladung der Nanopartikel zu charakterisieren. Die Anzahl von Plasmiden pro Partikel ist ein wichtiger Parameter, der zur Vorhersage der Wirksamkeit der Partikel kann und kann auch für Dosisermittlung verwendet werden. Nanopartikel Tracking-Analyse kann in einem Bereich von unterschiedlichen wässrigen Lösungen, wie solche, die sich in der Salzkonzentration...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			Reagens
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Trypsin	Invitrogen	25300
Natriumacetatpuffer	Sigma-Aldrich	S7899	Verdünnen bis 25mm in deionisiertem Wasser
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP DNA	Elim Biopharmaceuticals	NA
DsRed DNA	Addgene	21718
PEI-, verzweigte	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 wässrige One	Promega	G3580
			Materialien
Klar flacher Boden 96-Well-Platte, steril	Sarstedt	82.1581.001
Klare Rundboden 96-Well-Platte, steril	Sarstedt	82.1582.001
12-Kanal-Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 und 50-300 ul
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	NA	Modellnummer: AX10
C6 Accuri Durchflusszytometer	BD Biosciences	NA
HyperCyt Anlage	Intellicyt	NA
NS500	NanoSight	NA