Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.
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Methodenartikel
Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine konstruktiv transformiert lytischen Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsbereich von Staphylococcus aureus und Penicillin-Bindungsprotein (PBP 2a)-Antikörper, konjugiert Latex-Kügelchen wurden verwendet, um einen Biosensor zur Diskriminierung von Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindlich (MSSA) S ausgelegt zu erstellen . aureus Arten 1,2. Die lytische Phagen in Phagen Sphäroide wurde durch Kontakt mit Wasser-Chloroform-Schnittstelle umgewandelt. Phagen Sphäroid Monoschichten haben auf einem Biosensor Oberfläche wurde durch Langmuir-Blodgett (LB)-Technik 3 bewegt. Die angelegten Biosensoren nach einem Quarzkristall mit Dissipationsmessung Verfolgung (QCM-D), um Bakterien-Phagen-Wechselwirkungen auswerten untersucht. Bakterien-Sphäroid Wechselwirkungen zu reduzierten Resonanzfrequenz und einem Anstieg in Dissipationsenergie sowohl für MRSA und MSSA Stämmen führte. Nach der bakteriellen Bindung haben diese Sensoren wurde weiter auf die Penicillin-bindende Protein Antikörper Latexperle ausgesetzts. Sensoren mit MRSA untersucht reagierte auf 2a Antikörper Perlen PBP, obwohl Sensoren mit MSSA inspiziert gab keine Antwort. Diese experimentelle Unterscheidung bestimmt eine eindeutige Unterscheidung zwischen Methicillin-resistenten und sensiblen S. aureus-Stämme. Ebenso gebundenen und ungebundenen Bakteriophagen unterdrücken das Wachstum von Bakterien auf Oberflächen und in Wasser-Suspensionen. Sobald lytischen Phagen in Sphäroide geändert werden, behalten sie ihre starke lytische Aktivität und zeigen eine hohe bakterielle Capture-Funktion. Die Phagen und Phagen Sphäroide können für die Prüfung und Sterilisation von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verwendet werden. Andere Anwendungen können die Verwendung in Bakteriophagen-Therapie und antimikrobielle Oberflächen.
Einleitung
Methicillin-resistente Stämme von Staphylococcus aureus haben als ein Faktor in wesentlichen Infektionen und nosokomiale Ausbrüche 4-8 vorgeschlagen worden. Gemeinsame Wege der Anerkennung von Methicillin-Resistenz, wie die Scheibe Diffusion Oxacillin Agar Probeaufnahmen oder Bouillonmikrodilutions auf maßgeschneiderte Kulturbedingungen verlassen, um den Ausdruck des Widerstands zu verbessern. Änderungen umfassen die Verwendung von Oxacillin, Inkubation bei 30 oder 35 ° C statt 37 ° C, und die Aufnahme von NaCl zu dem Wachstumsmedium. Weiterhin für korrekte Erkennung durch diese Art von Techniken, eine lange Inkubationszeit von 24 h statt 16 bis 1....
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Protokoll
1. Einstellen der Stage
- Erhalten Typstamm S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 und Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicillin-resistente Stämme von S. aureus - MRSA1, MRSA 2, 5 MRSA, MRSA 13, 26 MRSA, MRSA 34, 45 MRSA, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Das lytische Phagen 12600.
- Erhalten PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen.
- Bereiten NZY Medium wie beschrieben 21.
- Erhalten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Bereiten VE-....
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Ergebnisse
Die Phagen zeigte lytische Aktivität gegen alle getesteten Stämme von S. aureus, einschließlich MRSA-Stämme, wie die Phagen-Spot-Test angegeben. Plaque Größen Regel reichten von 5 bis 15 mm. Wurde keine Aktivität gegen andere Test-Kulturen (Tabelle 1).
Ein normales Wachstum von S. aureus ATCC 12600 in NZY Mediums auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C ist in Abbildung 1A (eine Kurve durch leere Kreise gekennzeichnet) gezeigt. Die Anzahl der Bak.......
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Diskussion
Es ist bekannt, dass Phagen als Biosensor Sonden für bakterielle Erreger 28 verwendet werden. Es wird in dieser Arbeit gezeigt, dass Phagen zusammen mit PBP 2a Antikörper genutzt werden, um das alte Problem zu lösen: schnelle Diskriminierung antibiotikaresistenten und empfindliche Stämme.
Es wurde gefunden, jedoch diese normale unveränderte Staphylokokken Phagen nicht geeignet sind für Bakterien Detektion mit QCM Geräte, obwohl sie Bakterien binden. Die Phagen-Schwanz ist so lang,.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Arbeit hier berichtet wird, wurde durch Zuschüsse von der Auburn University und AUDFS USAF CRADA 07-277-60MDG-01 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position der United States Air Force, Department of Defense, oder die US-Regierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien | |||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| spektralphotometrisches Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 154733 | (99,8 % A.C.S.) |
| Hexan-wasserfrei | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 29609-0 | (95%) |
| Ethylalkohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT | 64-17-5 | 190 Proof |
| Equipment | |||
| PBP 2a Antikörper konjugierte Latexkügelchen | Denka Seiken Co., Ltd, Tokio, Japan | Der MRSA-Screen-Test | |
| S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 und Bacillus subtilis ATCC 6051 aus | der American Type Culture Collection (Manassas, VA); | ||
| MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Der lytische Phagen 12600 | Die Kultursammlung der Auburn University, Auburn, AL | ||
| Zentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K Ultra Zentrifuge | |
| KSV 2200 LB Filmwaage | KSV Chemicals, Finnland | ||
| Optisches System für Lichtmikroskope | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| QCM-D | Q-Sense AB, Vä stra Frö lunda, Schweden | E4 | |
| Rasterelektronenmikroskop (REM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL-7000F REM | |
| Sendeelektronenmikroskopie (TEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL, JEM 2010 | |
| Stericup, Presterilized | Millipore Corporation, Billerica, MA | SCGPU05RE | 0,22 μ m, GP Express PLUS Membran |
| Bio-Assay-Schale | NUNC A/S, Dänemark | 240835 | Abmessungen (mm), 245 x 245 x 25 |
| Pipetten | Gilson, Pipetman, Frankreich | P100, P200, P1000 | |
| C24 Inkubator-Schüttler | New Brunswick Scientific, CT | Classic C24 | |
| Vergoldete Quarzstücke | Auburn University, AL | Hausgemachte | |
| Petrischalen | Fisher Brand, USA | 0875713 | 100 mmX15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, ME | SG403 | |
| Kultur-Anzuchtkolben | Corning Incorporated, NY | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyerkolben |
| Optisches Spektrometer | Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. | 4001 | |
| Plasmareiniger | Harrick Plasma, USA | PDC-32G | |
| Millipore Wasseraufbereitungssystem | Millipore | Direct-Q | |
| Imaging Ellipsometer | Accurion, USA | nanofilm_ep3se | |
| Software | Q-Sense AB, Schweden | QSoft, QTools |
Referenzen
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
