Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Zusammenfassung

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Mechanische Eigenschaften der Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen einschließlich Stammzelldifferenzierung, Tumorentstehung und Wundheilung. Änderungen in der Steifigkeit von Zellen und ECM sind oft Anzeichen von Veränderungen in der Zellphysiologie oder Krankheiten in Geweben. Somit ist Zelle Steifigkeit ein Index, um den Status von Zellkulturen zu bewerten. Unter der Vielzahl von Methoden angewandt, um die Steifigkeit von Zellen und Geweben zu messen, bietet Mikro-Vertiefung mit einem Atomic Force Microscope (AFM) einen Weg, um zuverlässig zu messen die Steifigkeit der lebenden Zellen. Diese Methode wurde in großem Umfang angewendet, um die mikro-Steifigkeit für eine Vielzahl von Materialien, angefangen von Metalloberflächen weichen biologischen Geweben und Zellen zu charakterisieren. Das Grundprinzip dieses Verfahrens ist es, Gedankenstrich eine Zelle mit einer AFM-Spitze aus Geometrie und messen die aufgebrachte Kraft aus der Biegung des AFM-Cantilever. Montage der Kraft-Einzug Kurve nach Hertz-Modusl für die entsprechende Geometrie der Spitze geben können quantitative Messungen der Steifigkeit des Materials. Dieses Papier zeigt das Verfahren, um die Steifigkeit von lebenden Zellen mit AFM charakterisiert. Die wichtigsten Schritte einschließlich des Prozesses der AFM Kalibrierung, Kraft-Kurve Erwerb und Datenanalyse unter Verwendung eines MATLAB Routine demonstriert. Einschränkungen dieser Methode werden ebenfalls diskutiert.

Einleitung

Mechanische Eigenschaften, insbesondere Festigkeit, der einzelnen Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) sind entscheidend für viele biologische Prozesse wie Zellwachstum, Motilität, Teilung, Differenzierung und Gewebshomöostase. ¹ Es wurde gezeigt, dass die Zelle mechanische Steifigkeit wird hauptsächlich bestimmt durch das Zytoskelett, insbesondere die Netzwerke von Actin und intermediären Filamenten und andere Proteine ​​mit ihnen verbunden sind. ^{2 ergibt sich} aus mechanischen Tests in vitro Netzwerke von Actin und Intermediärfilamenten vermuten, dass die Zelle Mechanik weitgehend abhängig von der Zytoskelett-Struktur und der Vorspannung ist in das Zytoskelett. ^3-5 Steifigkeit von lebenden Zellen wird dann als Index für die Zytoskelett-Struktur ^6, Myosin Aktivität ⁷ und viele andere zelluläre Prozesse evaluieren angesehen. Noch wichtiger ist, sind Veränderungen in der Zelle mechanische Eigenschaften auch oft festgestellt, dass nahe stehendeATED mit verschiedenen Krankheitszuständen wie Tumorbildung und Metastasenbildung ^8-10 Kontrolle der mechanischen Steifigkeit von lebenden Zellen kann daher einen neuen Weg zur Zellphysiologie zu überwachen;. zu erkennen und zu diagnostizieren Krankheiten ^8;. und um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlungen ausgewertet ^{11 , 12}

Mehrere Verfahren, einschließlich Teilchen Tracking Mikrorheologie, ^13-16 magnetischen Verdrehen Zytometrie ¹⁷ Mikropipette Streben ^18,19 und Mikroindentation ^20-22 wurden entwickelt, um die Elastizität der Zellen zu messen. Particle Tracking Mikrorheologie zeichnet die thermischen Schwingungen von entweder Submikron fluoreszierenden Teilchen in Zellen oder Bezugsmarkierungen in der Zelle Zytoskeletts injiziert. ²³ elastischen und viskosen Eigenschaften von Zellen aus den gemessenen Verschiebungen Teilchen mit der Fluktuations-Dissipations-Theorem berechnet. ^14,23 Dieses Verfahren ermöglicht gleichzeitige Messungen der lokalenmechanische Eigenschaften mit hoher räumlicher Auflösung an verschiedenen Orten in einer Zelle. Jedoch kann Einspritzen fluoreszierenden Teilchen in die Zellen auf Veränderungen in der zellulären Funktion, Zytoskelett-Struktur und damit die Zellmechanik führen. Die Mikropipette Aspiration Methode gilt Unterdruck in einer Mikropipette mit einem Durchmesser im Bereich von 1 bis 5 um ein kleines Stück von der Zellmembran in die Pipette saugen. Zelle Steifigkeit von der angelegten Unterdruck und Zellmembran Verformung. ¹⁸ Dieses Verfahren berechnet wird, kann jedoch nicht erkennen, die heterogene Verteilung der Steifigkeit über die Zelle. Magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie (MTC) gilt Magnetfeld Drehmoment an superparamagnetische Kügelchen, die an der Zellmembran zu erzeugen. ¹⁷ Handy Steifigkeit wird bei diesem Verfahren aus der Beziehung zwischen der angelegten Drehmoments und der Drehverformung der Zellmembran abgeleitet. Es ist schwierig, die Position der magnetischen Kügelchen in der MTC Verfahren zu steuern, und es ist auch challenging, die Verdrehungsdeformation mit hoher Auflösung zu charakterisieren. Mikroindentation gilt ein Stempel mit wohldefinierten Geometrie in die Zelle zu stanzen. Das Einrücken Kraft und die daraus resultierende Vertiefung in Zellen folgen oft die Vorhersage der Hertz-Modell. Young-Modul von Zellen aus den Kraft-Vertiefung Kurven durch Aufstecken auf die Hertz-Modell berechnet werden. Diese Methode wurde in großem Umfang eingesetzt, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe und Zellen trotz seiner Grenzen wie die Unsicherheit in Kontaktstelle Bestimmung Anwendbarkeit der Hertz-Modell, und das Potential zu Schäden am Zellen zu testen. Unter den vielen Geräten für microindentaion ^20, ist der Atomic Force Microscope (AFM) im Handel erhältlich und wurde in großem Umfang angewendet, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen und Geweben ^21,24-27 charakterisieren.

Dieses Papier zeigt das Verfahren der Verwendung eines Asylum MFP3D-Bio AFM zu Zelle Mechanik charakterisieren. AFM nicht aufly liefert hochauflösende Topographie der Zellen, sondern auch weit verbreitet angewendet worden, um die mechanischen Eigenschaften von Gewebe-Zellen charakterisieren. Das Prinzip der AFM Vertiefung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die AFM-Cantilever nähert die Zelle von wenigen Mikrometern über, in Kontakt mit der Zelle; Einzüge die Zelle, so dass die Cantileverauslenkung erreicht einen vorgewählten Sollwert und zieht sich aus der Zelle. Dabei wird die freitragende Auslenkung in Abhängigkeit von seiner Lage aufgezeichnet, wie in Abbildung 1 dargestellt. Vor dem Kontakt mit der Zelle bewegt sich der Ausleger in dem Medium ohne sichtbare Verformung. Wenn Einrücken auf der Zelle, den Freischwinger Kurven und den Ablenksignal zunimmt. Die Ausleger sind als elastische Strahlen, so dass die Auslenkung proportional zu der Kraft, die auf die Zelle modelliert. Durch die Einstellung der maximalen Cantileverauslenkung wird die maximale Größe der Kraft, die auf die Probe beschränkt d vermeidenAmage zu den Zellen. Der Abschnitt der Kraftverlauf von Punkt B nach C in Fig. 1, wobei die Spitze Vertiefungen in die Zelle, an die Hertz-Modell zu passen, um die Zelle zu extrahieren Steifigkeit zeigen.

Abbildung 1. Illustration von AFM Mikroindentation und Interpretation der Kraft-Kurve. Das obere Feld zeigt die Bewegung der AFM-Cantilever durch die Piezo-Scanner gefahren. Die vertikale Lage des Auslegers und der z Cantileverauslenkung D wird während des Verfahrens aufgezeichnet. Der Ausleger beginnt bei Punkt a, wenige Mikrometer über der Zelle. Bei Annäherung an die Zelle, bleibt die Probe Vertiefung δ Null bis Punkt B, wo die Spitze in Kontakt mit der Zelle erreicht. Die Koordinaten des Punktes b in der Handlung sind kritische Wertefür die Datenanalyse durch (z _0, d _0>) bezeichnet. Von B nach C, die Cantilever-Einzüge in die Zelle, bis die Cantileverauslenkung erreicht einen Sollwert, der auf das Verhältnis zwischen der maximalen gezielte Eindruckkraft und Kragfeder Konstante sein wird. Sobald die Auslenkung Signal erreicht den vorgegebenen Maximalwert, wird der Ausleger dann aus der Zelle zu Punkt d, wo es oft nach unten durch Spitze-Probe Haftung gezogen werden zurückgenommen, löst sich von der Zelle und kehrt in seine ursprüngliche Lage am e. Das rechte Bild zeigt die Beziehung zwischen der Vertiefung und dem aufgezeichneten z und d-Signals. In der unteren linken Bereich ist eine graphische Darstellung eines repräsentativen Kraftverlauf, die maximale Vertiefung eines Auslegers, der die Federkonstante gemessen werden 0.07N / m ist, ist auf 17 nm, so dass die maximale Eindruckkraft anzuwendenden Probe ist 1,2 nN. Die wichtigsten Orten während der Vertiefung sind markiert.

Protokoll

1. Kalibrieren Sie die Federkonstante der Cantilever

1. Legen Sie den Ausleger in die AFM gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es ist notwendig, die Cantileverhalters mit Ethanol gereinigt vor allen Experimenten. Dies wird Ihnen helfen zu begrenzen bakterielle Kontamination der Kultur in den AFM-Messungen.
2. Kalibrieren InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity). Dieser Parameter beschreibt die Menge der Photodiode Antwort (Volt) pro Nanometer Cantileverauslenkung.
3. Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die Probe Bühne, installieren Sie dann die AFM Kopf und stellen Sie den Laserstrahl und die Ausrichtung nach den Anweisungen des Herstellers. Rasten Sie die AFM-Spitze auf dem Objektträger.
4. Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie eine Kraft-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V.
5. Mit der Piezo zurückgezogen, richten Sie den Spiegel mit einer Photodiode Lesung von -2 V. Führen Sie einen foRCE-Spektroskopie Messung mit einem Triggerpunkt (maximal Photodiode Antwort) von +2 V. Hinweis: Die Spannungswerte hier sind spezifisch für die Asylum AFM. Dieser Wert sollte nach den Vorgaben des Herstellers vorgesehen eingestellt werden.
   Nach der Datenerfassung abgeschlossen ist, in der Firma-Kontaktbereich der Kraftkurve vergrößern. Führen Sie eine lineare Anpassung in diese Region, um die Steigung, die in V / nm finden. Der Kehrwert dieser Wert beschreibt die optische Empfindlichkeit des Auslegers-Photodiode Ensemble.
6. Setzen Sie den Spiegel Ausrichtung zu einer freien Auslenkung von 0 V.
7. Kalibrieren der Cantilever Federkonstante. Ein thermischer-tune Verfahren wird verwendet, um die Federkonstante der Ausleger ²⁸ zu bestimmen.
8. Nach der Kalibrierung des InvOLS, erhöhen den Scanner von dem Probentisch derart, dass es keine Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe.
9. Beginnen Erfassung thermischen Daten. Dabei ist die thermische Schwingung des Freiträger Recorded. Die AFM-Software analysiert ein Leistungsspektrum eines solchen thermischen Schwingungen und zeichnet es in einem Datenfenster.
10. Nach ein paar Sekunden der Datenerfassung, führen Sie eine Anpassung an die Daten-Segment an der niedrigsten Frequenz (Grundresonanz) Spitze zu bestimmen, die Federkonstante zentriert.

2. Laden der Probe

1. Installieren Sie die Dish Heizung Zubehör auf dem AFM Bühne, wenn nicht bereits ausgestattet.
2. Die Temperatur auf 37 ° C und für 20 Minuten warten, bis das System eine stabile thermische Gleichgewicht zu erreichen.
3. Legen Sie die Kulturschale auf dem AFM Bühne und sichern Sie es mit der Schelle mit der Schale Heizung vorgesehen. Es ist wichtig, um die Zeit zwischen Entnahme der Schale aus dem Inkubator und der ihn in der Phase, die Traumatisierung der Zellen zu vermeiden, zu minimieren. Für Messungen länger als 30 min sollte CO ₂ eigenständiges Medium verwendet werden, um den normalen Kulturmedium ersetzen.
4. Tragen Sie einen kleinen Tropfen von 37 ° C Kulturmedium an der Spitze von Ter AFM-Cantilever, und senken Sie die AFM Kopf, bis die Spitze gerade in Flüssigkeit eingetaucht.
5. Mit dem Top-View CCD-Kamera, richten Sie den Laserstrahl auf den Cantilever (die Ausrichtung in flüssiger wird anders sein als in der Luft, wegen der Änderung des Brechungsindex des Mediums).
6. Rasten Sie die AFM-Spitze auf einer sauberen Fläche von der Kulturschale.
7. Durchführen der Kalibrierung der InvOLS wie oben für den Ausleger Empfindlichkeit in der flüssigen Umgebung beschrieben.

Hinweis: a) Wenn Zellen auf Hydrogele kultiviert werden, die Kalibrierung der InvOLS sollten im Voraus gegen die Bodenfläche einer Kulturschale mit Zellkulturmedium gefüllt durchgeführt werden. Beim Umschalten auf Zellproben, hat besondere Aufmerksamkeit zu zahlen, um nicht die Laserstrahl Ausrichtung des Auslegers werden. b) InvOLS muss neu kalibriert, wenn es eine Änderung in der Laserausrichtung werden. c) Es wird auch empfohlen, InvOLS als Durchschnitt der Wert nehmen aus mehreren Eichkurven, seit jede Kalibrierung erzeugt eine andere InvOLS. Die Variation in InvOLS ist jedoch gering im Vergleich zu dem Mittelwert. Zum Beispiel, Kalibrieren eines Bruker DNP-10 Freischwinger mit Federkonstante 0,06 N / m in Flüssigkeit durch 100 mal produzieren einen mittleren Wert von 66,3 InvOLS nm / V, mit einer Standardabweichung von nur 0,5 nm / V.

3. Sammeln Kraftkurven of Cell Einzug

1. Markieren Sie eine Zelle für den Einzug. Mit Hilfe des optischen Mikroskops, zum Bewegen der Plattform, um den Ausleger über der Zelle so zu positionieren, daß die Spitze in der peri-Kerne Region befindet. Eine genaue Einstellung der Position des Auslegers kann durch Aufbringen Offsets auf die X-und Y-Scannern durchgeführt werden.
   Hinweis: Die AFM-Cantilever muss von der Probenoberfläche zurückgezogen werden beim Bewegen der Probe Bühne, um eine Zielzelle auszuwählen. Dies schützt den Ausleger von Klopfen in der Probe, da die Probenoberfläche eventuell nicht flach.
2. Wechseln Sie zu Spektroskopie-Modus zu erzwingen. Stellen Sie den EinzugRate im Bereich von 1-10 um / sec, niedrig genug ist, um hydrodynamischen Effekte zu vermeiden.
3. Stellen Sie die Ablenkung Triggerpunkt, der die maximale Eindruckkraft begrenzt, um Schäden an Zellen zu vermeiden. Wählen Sie die Relative Auslösung Option, die für jeden Drift im Ablenksignal korrigieren. Eine maximale Kraft von 2 nN ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Proben. Dieser Wert sollte jedoch nach der Probe Steifigkeit eingestellt werden. Für weiche Proben einen niedrigeren Wert sollte verwendet werden, um übermäßige Vertiefung der Probe zu vermeiden. Für steife Proben einen hohen Wert sollte verwendet werden, um messbare Vertiefung erzeugen.
4. Stellen Sie die Kraft Abstand groß genug, um sicherzustellen, dass die Spitze vollständig aus der Zelle zwischen Kraftmessungen abgenommen werden. Üblicherweise wird die Kraft-Weg bei 5 um eingestellt.
5. Befehl die AFM zu einer einzigen Kraft Kurve zu nehmen.
6. Sammeln mindestens drei unterschiedlichen Kennlinien an verschiedenen Stellen in der peri-Kerne Bereich jeder Zelle. Obwohl es vorteilhaft ist, mehrere nehmenKurven auf jeder Zelle für zuverlässige statistische Daten zu viele Kraftkurven kann zu Veränderungen in der Zelle Steifigkeit aufgrund von Stress aus der AFM-Sonde führen.
7. Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Spitze, und wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6 für so viele Zellen wie für gute statistische Daten über die Zelle Steifigkeit unter einer bestimmten Bedingung Probe benötigt. In der Regel werden 30 Zellen für jede Bedingung gemessen.

Um die Verteilung der Steifigkeit in einer Zelle zu charakterisieren, wird eine Kraft-Karten-Modus angewendet wird. In der Kraft-Karten-Modus, stellen Sie eine Scan-Größe, um die Region in der Nähe sind, eine angemessene Auflösung; setzen die Vertiefung Parameter wie für einzelne Kraft Kurven ausgewählt, die AFM wird dann über den definierten Bereich Probe rastern und nehmen einzelne Kraft Kurven bei jedem Pixel in den Probenbereich.

4. Data Analysis

Die aufgezeichneten Kraft Kurven werden unter Verwendung eines benutzerdefinierten MATLAB Verfahren, um die Zelle Steifigkeit berechnen. Das Folgende ist eine kurze Beschreibung der MATLAB Verfahren:

1. Die MATLAB-Programm identifiziert die Kontaktstelle koordiniert z0 und d0 (siehe Abbildung 1) mit Hilfe eines Algorithmus aus einer publizierten Methode von Lin et al angenommen ^29.:
2. Für jeden Datenpunkt in der Kraft-Kurve, eine lineare Anpassung der Daten auf der linken Seite zur Sehenswürdigkeit und ein Hertz-Modell auf der rechten Seite (mit dem gewählten Punkt als erste Anlaufstelle) passen, bis zu dem Satz maximale Vertiefung (200-300 nm empfohlen).
3. Für jeden Punkt, die Berechnung der relativen RMS Fehler von beiden passt und die Summe dieser Werte.
4. Der Punkt, der die insgesamt mindestens Anpassungsfehler erreicht wird als erste Anlaufstelle ausgewählt.
   Hinweis: Rechenzeit kann durch die Implementierung eines golden-Abschnitt Suche anstatt linear Scannen des gesamten Kraftkurve reduziert werden.
5. Probenverformung δ und Eindruckkraft F werden wie folgt berechnet:
   
6. Eine der kleinsten Quadrate angewendet wird, um die F vs passen δ Daten in der Post-Kontaktbereich, z ≥ z _0, nach Hertz Modell der Elastizitätsmodul, E der Zelle zu extrahieren:
   
   , Wobei v das Poisson-Verhältnis.
   Hinweis: Wenn δ mehr als 10% der Dicke der Probe (Zelle Höhe) ist die gemessene Zelle Steifigkeit wird durch das Substrat Steifigkeit betroffen. Die Dicke der perinukleären Region ist in der Regel in der Größenordnung von wenigen Mikrometern. Daher wird nur die ersten 200-300 nm von F-δ-Kurve nach Hertz-Modell passt.

Ergebnisse

2a zeigt drei repräsentative Kraftkurven von 3T3 Fibroblasten auf Kunststoff-Oberfläche, Polyacrylamidgel von Young-Module 3.000 Pa und 17.000 Pa bzw. kultiviert gemacht. Nach sorgfältiger Ermittlung der Kontaktstellen in den Kurven wird das Einrücken Kraft als Funktion der Zelle Verformung in 2b dargestellt. Unter einer Kraft von Größenordnungen kleiner als 0,3 nN, eine Pyramidenform Spitze Spiegelstriche 3 Mikrometer in einer Zelle auf einer 3 kPa Polyacrylamidgel kultiviert. Im Gegen...

Diskussion

Die AFM Vertiefung Methode hat Vorteile gegenüber mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen zu charakterisieren. Wenn auch weniger empfindlich als die magnetische Verdrehen Durchflusszytometrie und optische Pinzette, die Kräfte auf die Pikonewton Stufe ³² messen kann, kann die AFM Widerstandskraft von Proben im Bereich von zig Pico-Newton, um Hunderte von nano-Newton, vergleichbar zu erfassen, um der Kraft reichen, dass Zellen können unter Verwendung einer Mikropipette ¹⁹ aufgebracht werden. D...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rasterkraftmikroskop	Asylum Research	MFP3D-BIO