Summary
In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.
Abstract
In 2001, onderzoekers van de Universiteit van Californië, Los Angeles, beschreef de isolatie van een nieuwe populatie van volwassen stamcellen uit liposuctie vetweefsel dat ze in eerste instantie genoemd Verwerkte Lipoaspirate Cells of PLA cellen. Sindsdien zijn deze stamcellen zijn hernoemd vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC en zijn gegaan naar een van de meest populaire volwassen stamcellen populaties op het gebied van stamcelonderzoek en regeneratieve geneeskunde geworden. Duizenden artikelen beschrijven nu het gebruik van ASC in verschillende regeneratieve diermodellen, zoals botherstel, perifere zenuwen reparatie en cardiovasculaire techniek. Recente artikelen zijn begonnen met de talloze toepassingen te beschrijven voor ASC in de kliniek. De in dit artikel protocol beschrijft de basisprocedure voor het handmatig en enzymatisch ASC isoleren van grote hoeveelheden lipoaspirates verkregen cosmetische ingrepen. Dit protocol kan gemakkelijk worden opgeschaald of omlaag om accomat de hoeveelheid lipoaspirate en kan worden aangepast aan ASC's uit vetweefsel verkregen via abdominoplasties en andere soortgelijke procedures isoleren.
Introduction
In 2001, een vermeende populatie van multipotente stamcellen uit vetweefsel werd beschreven in het tijdschrift Tissue Engineering 1. Deze cellen kregen de naam Verwerkte Lipoaspirate of PLA cellen als gevolg van hun afleiding van verwerkte lipoaspirate weefsel verkregen door middel van cosmetische chirurgie. De isolatiemethode in dit artikel beschreven is gebaseerd op bestaande enzymatische strategieën voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit vetweefsel 2. De SVF is gedefinieerd als een minimaal verwerkt populatie van rode bloedcellen, fibroblasten, endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten en pre-adipocyten die nog moeten voldoen aan een weefselkweek substraat 2, 3. Kweken van deze SVF tijd wordt voorgesteld veel van deze verontreinigende celpopulaties elimineren en resulteren in een hechtende, fibroblastische bevolking. Deze fibroblasten zijn geïdentificeerd in de literatuur voor de laatste 40 jaar als zijnde pre-adipocyten. Echter, onze onderzoeksgroep aangetoond dat deze cellen bezat mesodermale multipotent en omgedoopt tot de adherente SVF bevolking PLA cellen. Latere studies door tal van andere onderzoeksgroepen hebben toegevoegd aan dit potentieel, wat suggereert zowel endodermale en ectodermale potentials (voor review zie 4). Sindsdien talrijke extra termen voor deze cellen zijn verschenen in de literatuur. Om enige vorm van consensus te bieden, werd de term vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC op de 2e jaarlijkse IFATS conferentie aangenomen. Als zodanig zal de term ASC worden gebruikt in dit artikel.
De in dit artikel beschreven protocol is een betrekkelijk eenvoudige procedure die standaard laboratorium apparatuur vereist en gebruikt eenvoudige reagentia zoals fosfo-gebufferde zoutoplossing, standaard weefselkweekmedium reagentia en collagenase. Het kan grote aantallen ASC naargelang de hoeveelheid uitgangsmateriaal vetweefsel volume en vervolgens c producerenultuur tijd. Echter, de verwerking van een grote hoeveelheid vetweefsel fysieke problemen die kunnen worden verminderd tot een mate met dit protocol presenteren. Bovendien is dit protocol vereist steriele weefselkweek faciliteiten en goedgekeurd bioveiligheid kappen, waardoor het gebruik van een goedgekeurde weefselkweek faciliteit noodzakelijk. Deze eis kan verminderen de bruikbaarheid van de ASC bevolking in klinische toepassingen tenzij ze worden geïsoleerd goede fabricagepraktijken (GMP)-erkende installaties ontworpen voor de isolatie en expansie van materialen voor klinisch gebruik. Als alternatief zou geautomatiseerde systemen die ASC kunnen isoleren in een gesloten systeem in de operatiekamer deze belangrijke kwestie voorkomen, terwijl het onmiddellijke gebruik van ASC zonder enige noodzaak voor daaropvolgende in vitro expansie. Tot op heden zijn er zes geautomatiseerde systemen die commercieel beschikbaar zijn voor de isolatie van cellen uit menselijk weefsel. Deze systemen maken het mogelijk isoleren van eenaanzienlijk aantal ASC uit grote hoeveelheden vetweefsel onmiddellijk na de oogst. Deze ASC kunnen daarna opnieuw in de patiënt voor verschillende regeneratieve doelen zonder de patiënt ooit de operatiekamer verlaten. Daarnaast protocol beschrijft de handleiding isolatie van ASC, is een protocol voor isolatie van geautomatiseerde ASC met het Celution systeem eveneens in een begeleidend artikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier getoonde protocol beschrijft de handleiding isolatie van ASC uit lipoaspirates verkregen door middel van cosmetische procedures met behulp van enzymatische spijsvertering en differentiële centrifugatie. Dit protocol werd voor het eerst gepubliceerd in het tijdschrift Tissue Engineering in 2001 1, waarbij de resulterende cellen werden genoemd Verwerkte Lipoaspirate Cells of PLA cellen vanwege hun isolatie van lipoaspirates. Echter, de term PLA cel nu vervangen door de term vet-afgeleide stamcellen of ASC om het veld een soort van overeenstemming op het gebied van nomenclatuur geven. De cellen geïsoleerd door dit protocol is aangetoond door velen mesodermale potentiële bezitten zowel in vitro als in vivo (voor overzicht zie 4). Daarnaast hebben de ectodermale en endodermale potenties van de ASC ook onderzocht 4. De isolatie techniek is eenvoudig en duidelijk en vergt ongeveer een uur in beslag. De resulterende cels worden gekweekt onder standaard weefselkweekomstandigheden. Met cultuur tijd, de ASC bevolking wordt meer homogeen, bestaande uit fibroblastische cellen die gemakkelijk uitbreiden en vertonen een goede levensvatbaarheid op de lange termijn in de cultuur.
Opmerking: De volgende onderdelen van de uitrusting die nodig zijn worden vermeld aan het eind van dit artikel. Alle glaswerk, en reagentia moeten worden gesteriliseerd door autoclaveren of gefiltreerd door 0,22 um filters. Aseptische weefselkweek technieken moeten te allen tijde worden opgevolgd. Om dit te garanderen, moeten alle materialen geplaatst in de bioveiligheid kast worden gesteriliseerd door te besproeien met een 70% ethanol-oplossing en vegen met schone papieren handdoeken.
1. Voorafgaand aan Harvest, Bereid de volgende:
- Steriele 1X-fosfo-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen van de lipoaspirates. Bereid ongeveer 1 L 1x PBS per 100 ml lipoaspirate. Autoclaveer de PBS en alleow afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Optioneel kan antibiotische / antimycotische worden toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 IE / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine en 2,50 ug / ml amfotericine B als de PBS is afgekoeld.
- Steriele 0,075-,1% collagenase type IA (van Clostridium histolyticum) voor enzymatische afbraak van de lipoaspirate. De concentratie zal afhangen van de kwaliteit en de bron van de collagenase - dwz ruwe versus gezuiverd. Andere collagenase types kunnen worden gebruikt (type bijvoorbeeld collagenase II of IV) bij vergelijkbare concentraties. Bereiden in 1x PBS en steriel filter met een 1000 ml filtersysteem met een 0,22 urn filter (Figuur 1A). Echter, steriele glazen flessen voorzien van een dop filter kan ook worden gebruikt. Bereiden en te gebruiken bij kamertemperatuur. Collagenase oplossingen worden opgeslagen korte termijn bij 4 ° C totdat het nodig is. Laat de collagenaseoplossing niet bevriezen omdat het de werking kan verminderen.
- Steriel Controle Medium (CM) voor collagenase inactivatie en het kweken van de ASC bevolking. 500 ml CM, combineren de volgende: 500 ml DMEM (4,5 g / L glucose, met L-glutamine), 50 ml foetaal runderserum (hitte geïnactiveerd), 5 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE penicilline, 10.000 pg / ml streptomycine). Optioneel kan 5 ml amfotericine B (250 ug / ml amfotericine B) worden toegevoegd. Steriele filtratie van het medium is vereist als niet-steriele sera worden gebruikt. Plaats de CM in een 37 ° C waterbad van 30 min voorafgaand aan gebruik opwarmen het medium.
- Steriel uit glas en plastic voor isolatie. Autoclaaf een 1000 ml bekerglas en laat afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Daarnaast hebben de volgende plasticware klaar: aseptische serologische pipetten (5 ml, 10 ml en 25 ml), 50 ml centrifuge buizen, en weefselkweek behandeld cultuur gerechten.
2. Isolatie van ASC uit Lipoaspirates
De meeste lipoaspirates worden verzameld in een aspiratie container (zie figuur 1B) en kunnen bestaan uit drie verschillende lagen: 1) een bovenste olielaag door de lyse van mature adipocyten, 2) een middelste laag van vetweefsel, en 3) een bodem, vloeibare infranatant met zoutoplossing en verontreinigende celtypen zoals rode bloedcellen (RBC). De bovenste olielaag mag niet in significante hoeveelheden aanwezig zijn. Indien aanwezig, moet worden afgezogen olie verontreiniging van de resulterende cultuur ASC de levensvatbaarheid van de cultuur kunnen beïnvloeden. De onderste infranatant moeten worden verwijderd vóór verwerking verontreiniging van de ASC culturen met RBC minimaliseren. Dit zal het midden, vetweefsel laag, die vervolgens zal worden gewassen en enzymatisch verteerd aan zijn cellulaire, stromale vasculaire fractie (SVF) bevrijden vertrekken.
- Het wassen van de lipoaspirate: Open de lipoaspirate container in de weefselkweek hood en zorgvuldig decanteren de lipoaspirate in een steriele 1 L glazen beker. Laat de lipoaspirate lagen te scheiden, totdat het vetweefsel laag goed wordt gescheiden (Figuur 1B).
- Zuig de olie laag (indien aanwezig) in een steriel glazen pipet en de onderste zoutoplossing infranatant met een 10 ml serologische pipet. Dit zal de grote meerderheid van verontreinigende rode bloedcellen en zoutoplossing te verwijderen.
- Beoordeel de omvang van de resulterende vetweefsel laag en voeg steriele 1x PBS bij een gelijk volume. Roer de verzamelbak met de pipet voor aspiratie om de lipoaspirate mengen met PBS. Laat de twee lagen te vestigen. Zoals hierboven opgemerkt, kan de 1x PBS aangevuld met antibiotica / antimycotica.
- Zuig het infranatant met behulp van een 10 ml serologische pipet.
- Blijf de vetweefsel fractie wassen zoals beschreven in stappen 2.1.2. en 2.1.3. totdat de vetlaag heeft een gele / gouden kleur. Aspireren the infranatant een laatste keer, waardoor het vetweefsel fractie in het bekerglas. Om een adequate verwijdering van de infranatant zorgen, zodat de lipoaspirate lagen rusten gedurende 5 minuten na de laatste wasbeurt en vóór de definitieve aspiratie.
- Enzymatische digestie van het lipoaspirate: Bereid steriele collagenase 1A oplossing zoals hierboven aangegeven in een filtereenheid. Bereid een hoeveelheid equivalent aan die van de vet fractie en steriele filter.
- Na filtratie van de collagenase oplossing, gooi de bovenste filter unit, giet de gewassen vet fractie in de collagenase oplossing en goed sluiten van de fles.
- Plaats de collagenase / vet mengsel in een 37 ° C waterbad en verteren 37 ° C gedurende 30 minuten. Zwenk de collagenase / vet mengsel elke 5-10 minuten en plaats terug in het waterbad. Het vetweefsel laag moet op een "soepeler" uiterlijk (Figur nemene 1B) als de vertering verloopt. Aanvullende digestietijden (dwz tot 2 uur) kan worden gebruikt wanneer het vetweefsel laag verschijnt nog zuivere stukken vet daarin.
- Isolatie van ASC: Plaats de verteerde collagenase / vet mengsel terug in de bioveiligheid kast. Zorg ervoor dat de filter unit met 70% ethanol steriliseren voorafgaand aan het plaatsen terug in de kast.
- Pipetteer 25 ml porties van de infranatant met de SVF in steriele 50 ml centrifuge buizen.
- Voeg 25 ml CM aan elke buis. Laat de CM op de collagenase inactiveren door incubatie bij kamertemperatuur in de kast voor 5 minuten.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1200 xg om de SVF als een pellet te verzamelen.
- In de bioveiligheid kast, zuig het supernatant van elke buis. Zorg ervoor dat de bovenste olielaag en een drijvend adipocyten worden opgezogen met dit supernatant (
- Combineer de SVF pellets in een centrifugebuis met behulp van 30 ml CM en verdeel gelijkmatig over twee nieuwe 50 ml centrifuge buizen. Centrifuge als in stap 2.3.3. en zuig de supernatanten van de twee SVF pellets (niet in figuur).
OPTIONEEL: Als RBC lysis gewenst, resuspendeer elk SVF pellet in 10 ml van een RBC lysis buffer (160 mM NH4Cl) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifuge als in stap 2.3.3. en zuig de supernatanten de SVF pellets (niet in figuur) verkregen.- Combineer de twee SVF pellets in een nieuwe centrifugebuis gebruik van 5-10 ml CM (Figuur 1B).
- Uit te filteren grotere weefsel deeltjes, pipet de geresuspendeerde SVF pellet op een 100 um mesh filter geplaatst op de top van een nieuwe 50 ml centrifugebuis en laten filteren door zwaartekracht.
- Pipetteer aliquots van geresuspendeerde(En gefilterd) SVF pellet met de ASC op weefselkweek behandeld cultuur gerechten. Supplement elk gerecht met een geschikt volume van CM.
- Kweek van de cellen in CM 3-4 dagen bij 37 ° C, 5% CO2 onveranderd media.
- Combineer de SVF pellets in een centrifugebuis met behulp van 30 ml CM en verdeel gelijkmatig over twee nieuwe 50 ml centrifuge buizen. Centrifuge als in stap 2.3.3. en zuig de supernatanten van de twee SVF pellets (niet in figuur).
Na deze eerste kweekperiode, kan het kweekmedium worden opgezogen en elke verontreinigende rode bloedcellen voorzichtig verwijderd door wassen met steriele 1XPBS. Vervangen met CM en blijven de cultuur van de ASC's als dat nodig is. Het type weefselkweekplaat gebruikt en hoe de geresuspendeerde pellet SVF verdeeld over deze gerechten zal afhangen van het aantal cellen gewenste volgens conventionele weefselkweek.
3. Karakterisering van de ASC Bevolking: flowcytometrie en multilineage Differentiatie
Eenmaal geïsoleerd, moet karakterisering van de ASC bevolking worden uitgevoerd. Conventionele benaderingen hiervoor zijn stroom cytometrie naar het celoppervlak antigen CD profiel van de cellen te karakteriseren en in vitro differentiatie van hun multilineage differentiatie capaciteit bevestigen. Terwijl meerdere lijnen kan worden beoordeeld ASC Dit protocol beschrijft de differentiatie van ASC in cellen van de adipogene, chondrogene en osteogene geslachten als middel bevestiging multilineage mesodermale potentialen 5.
In vitro multi-lijn Differentiatie van ASC
- Osteogene Differentiatie van ASC: Voorafgaand aan inductie, bereiden Osteogeen Medium (OM) als volgt: Voor een fles van 500 ml DMEM (4,5 g / ml glucose) toe 25,0 ml FBS (5,0% eindconcentratie) en 5,0 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE / ml en 10.000 mg / ml eindconcentraties respectievelijk). Voeg hieraan de volgende osteogene inductie agenten om de aangegeven eindconcentraties: dexamethason (0,1 uM finale), L-ascorbinezuur 2-fosfaat (50,0 uM finale) En β-glycerofosfaat (10,0 mm definitief).
- Voorafgaand aan inductie, oogsten en plaat de gekweekte ASC in de gewenste weefselkweekschaal zodat een confluentie van ongeveer 50% bereikt. Voor elke experimentele gerecht plated, plaat een extra schotel voor een niet-geïnduceerde controle. Cultuur overnachting in CM.
Let op: 50% confluentie wordt aanbevolen om te zorgen voor voortdurende proliferatie die zich kunnen voordoen in de loop van de inductie - Op de dag van inductie, verwijder het medium en voeg de volgende: OM om de gewenste osteogene experimentele putten en CM aan de controles. De hoeveelheid medium zal afhangen van de grootte van de weefselkweekplaat. Voor 12 putjes, 1,0 ml van media per put is voldoende. Voor 6 putjes, 2,0 ml van media per put is voldoende. Voor 100 mm schalen moet 10,0 ml medium per schaal worden gebruikt.
- Kweek van de cellen gedurende minimaal 14 dagen met veranderingen van het geschikte medium elke 3-4dagen. Sterk osteogene ASC populatie kan tekenen van extracellulaire minerale afzetting zien zo vroeg 7 dagen inductie.
- Osteogene differentiatie (dwz extracellulaire minerale afzetting) kan worden bevestigd met behulp van een von Kossa histologische kleuring voor calciumfosfaat. Deze kleurstof een zwart-bruine precipitaat identificeren van de aanwezigheid van extracellulair calcium fosfaat (zie figuur 2) te produceren.
Knoeit von Kossa reagens:- Verwijder de OM uit de experimentele cellen en CM van de controlecellen
- Fixeer de cellen gedurende 60 min in 4,0% paraformaldehyde bereid in 1x PBS.
- Was de cellen tweemaal met 1 x PBS.
- Incubeer de cellen met 2,0% zilvernitraat (bereid in water) in het donker gedurende 30 minuten.
- Verwijder de zilvernitraat, was twee keer met gedestilleerd water en lucht-drogen de cellen.
- Blootstellen van de cellen aan UV-licht gedurende 60 minuten aan de cal ontwikkelencium fosfaat neerslag.
- Was de cellen meerdere malen met 1XPBS.
- Tegenkleuring de cel met hematoxyline indien gewenst.
- Voorafgaand aan inductie, oogsten en plaat de gekweekte ASC in de gewenste weefselkweekschaal zodat een confluentie van ongeveer 50% bereikt. Voor elke experimentele gerecht plated, plaat een extra schotel voor een niet-geïnduceerde controle. Cultuur overnachting in CM.
- Adipogene Differentiatie van ASC: Voorafgaand aan inductie, bereiden adipogene Medium (AM) als volgt: Voor een fles van 500 ml DMEM (4,5 g / ml glucose) toevoegen 50,0 ml FBS (10,0% uiteindelijke concentratie) en 5,0 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE / ml tot 10.000 pg / ml eindconcentraties respectievelijk). Voeg hieraan de volgende adipogene inductie agenten om de aangegeven eindconcentraties: dexamethason (1,0 uM finale), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX - 0,5 mM definitief), indomethacine (0,2 mM finale) en insuline (10,0 uM finale ).
- Voorafgaand aan inductie, oogsten en plaat de gekweekte ASC in de gewenste weefselkweekschaal zodat een confluentie van ongeveer 80% bereikt. Voor elke experimentele gerecht plated, plaat een toevoegingAl schotel voor een niet geïnduceerde controle. . Cultuur overnacht in CM Opmerking: adipogene differentiatie van ASC lijkt efficiënter met verhoogde confluentie te zijn.
- Op de dag van inductie, verwijder het medium en voeg de volgende: AM om de gewenste osteogene experimentele putten en CM aan de controles. De hoeveelheid medium zal afhangen van de grootte van de weefselkweekplaat. Voor 12 putjes, 1.0.ml van media per put is voldoende. Voor 6 putjes, 2,0 ml van media per put is voldoende. Voor 100 mm schalen moet 10,0 ml medium per schaal worden gebruikt.
- Kweek van de cellen gedurende minimaal 14 dagen met veranderingen van het geschikte medium elke 3-4 dagen. Sterk adipogene ASC populatie kan tekenen van lipide vacuole vorming zien zo vroeg 7 dagen inductie.
- ASC ondergaan adipogene differentiatie zal meerdere lipide vacuolen die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd onder de lichtmicroscoop te ontwikkelen. Bovendien kan adipogene differentiatieworden bevestigd met een Oil Red O histologische vlek die zich ophopen in deze vacuolen (zie figuur 2).
Knoeit Oil Red O:- Verwijder het papier uit de experimentele en controle cellen en zet ze gedurende 60 minuten met behulp van een 10% formele calcium fixeermiddel. Om dit fixatief bereiden combineren de volgende: 1,0 g CaCl2, 25,0 ml 16% paraformaldehyde (4,0% eind) en 75,0 ml gedestilleerd water.
- Was de cellen twee keer met 1x PBS.
- Was de cellen kort met 70% ethanol.
- Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met Oil Red O oplossing. Om de Oil Red O oplossing te bereiden, te ontbinden 2,0 g Oil Red O poeder in 50,0 ml 70% ethanol en 50,0 ml aceton.
- Was de cellen met 70% ethanol en vervolgens met kraanwater.
- Visualiseer de cellen snel na kleuring te wijten aan het verbleken van de vlek met de tijd.
- Chondrogene differentiatie van ASC: chondrogene differentiatie wordt bereikt door een aangeduid als "micromassakweek" high-density kweektechniek. Vóór cultuur bereiden Chondrogenische Medium (ChM) als volgt: Aan een 500 ml fles DMEM (4,5 g / ml glucose) voeg 5,0 ml FBS (1% eindconcentratie) en 5,0 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE / ml en 10.000 ug / ml eindconcentraties respectievelijk). Voeg hieraan de volgende chondrogenische inductie agenten om de aangegeven eindconcentraties: L-ascorbinezuur-2-fosfaat (50,0 ug / ml definitief), insuline (6,25 ug / ml definitief), transferrine (6,25 ug / ml definitief) en TGFB1 (10,0 ng / ml).
- Oogst de ASCs en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 xg om de cellen te pelleteren. Tel de cellen om de dichtheid van de celsuspensie bepalen.
- De micromassa pellets bereiden bereiden twee celsuspensies: een experimentele suspensie bereid in ChM bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellens / ml en een controle suspensie bereid in CM bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml.
- Plaats 10,0 gl "druppels" van de cellulaire suspensie in afzonderlijke putjes van een multi-putjes. Laat hechten gedurende 2-3 uur bij 37 ° C.
- Voorzichtig overlay de vergulde druppeltjes met ofwel ChM of CM zorg dat u de cellen niet te distantiëren.
- Kweek van de cellen tot 14 dagen ChM of CM veranderingen in medium elke 3-4 dagen. Cellen gekweekt in ChM zal condenseren in deze tijd een hoge dichtheid Micromass pellet met weinig tot geen cellen in een omringend monolaag vormen. Controle cellen gekweekt zal deze condensatie niet ondergaan en velen zullen worden gevonden als een monolaag.
- Om chondrogenese bevestiging, bevestig de korrels gedurende 15 min in 4,0% paraformaldehyde (bereid in 1x PBS) bij kamertemperatuur. Vlekken op de aanwezigheid van gesulfateerde proteoglycanen met een alcianblauw histologische kleuring.
Om vlekken gebruik Alcian Blue:- Was de pa-raformaldehyde vaste pellets keer in 1x PBS.
- Incubeer de pellets in 0,1 N HCl (pH 1,0) gedurende 5 minuten om de pH te verlagen.
- Verwijder de HCl en voeg 1% alcianblauw reagens (bereid in 0,1 N HCl, pH 1.0). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder de alcianblauw reagens en was de pellets met 0,1 N HCl (pH 1,0) om overtollig vlek te verwijderen.
- Extra wassingen met leidingwater kan worden gebruikt om achtergrondkleuring te verminderen.
- Als alternatief kan de Micromass pellets worden geoogst nacht in 10% formaline gefixeerd, in paraffine ingebed en de secties gekleurd voor Alcian Blue.
4. Flowcytometrische Karakterisering van ASC
Karakterisering van het celoppervlak antigen CD-profiel kan worden bereikt door conventionele flowcytometrie.
- Voorbereiding van ASC voor flowcytometrie: Priorde analyse, bereiden een flowcytometrie Buffer (FCB) bestaat uit de volgende: 1.0% BSA, 2,0% FBS en 0,025% saponine bereid in 1x PBS.
- Oogst de ASCs en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 1200 xg om een pellet te produceren.
- Resuspendeer de cellen in steriele 1XPBS en tel de cellen met een hemocytometer. Bepaal de celdichtheid van de suspensie.
- Verdeel de suspensie boven in hoeveelheden van 5 x 10 5 cellen totaal en centrifugeer tot pellet.
- Verwijder het supernatant PBS en vast de cellen gedurende 60 minuten bij -20 ° C met een overmaat ijskoude 70% ethanol. Indien nodig kunnen deze cellen worden in deze 70% ethanol in een -20 ° C vriezer totdat het nodig is.
- Na fixatie voorzichtig zuigen ethanol en voorzichtig was de pellet twee keer met een overmaat FCB. Te wassen:
- Voeg een overmaat FCB en voorzichtig resuspendeer de pellet.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 xg om de cellen te verzamelen eensa pellet.
- Zuig het FCB supernatant voorzichtig.
- Herhalen.
- Verwijder de laatste FCB wassen supernatant uit elke fractie en resuspendeer in 100 pl van FCB. Voeg de gewenste fluorochroom-geconjugeerde primaire antilichaam met behulp stelde verdunning van de fabrikant. Incubeer de cellen op ijs met het antilichaam gedurende 30 minuten.
Opmerking: Als fluorochroom-geconjugeerde primaire antilichamen niet beschikbaar zijn, kunnen niet-geconjugeerde primaire antilichamen worden gebruikt. - Voor elk fluorochroom (bijv. FITC, PE), incubeer een monster van cellen met 100 ml FCB met isotype-gematchte IgG als negatieve controle.
- Incubeer een aliquot in 100 ml FCB die geen antilichamen als extra controle.
- Was elk monster van cellen twee keer met FCB zoals beschreven in stap 4.1.5. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de fracties in 100 ml van FCB en ga verder met flow-analyse.
Opmerking: Als niet-geconjugeerde primaire antilichamen werden gebruikt: Na deze wasstap incubeer de monsters op ijs gedurende 20 minuten met FCB aangevuld met de fluorochroom-geconjugeerde tweede antilichaam gebruikt zonder verdunning van de fabrikant. Was tweemaal zoals in stap 4.1.5.
- Flow analyse van ASC: Voor flow-analyse, moet een minimum van 10.000 gebeurtenissen worden geteld. Ongekleurd en isotype gematchte controles worden gebruikt om poorten instellen door voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC). Hiertoe moet het geen enkele controle antilichaam (dwz ongekleurde) van stap 4.1.8 worden gebruikt om vuil en dode ASC elimineren. De IgG-isotype-overeenkomende controles van stap 4.1.7. worden gebruikt om gebieden van positieve fluorescentie vastgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hiervoor beschreven protocol beschrijft een handleiding enzymatische methode voor het isoleren van een SVF uit een groot volume lipoaspirate monster. Binnen deze SVF zijn talrijk celpopulaties, waaronder de ASC. Talrijke studies stellen dat het kweken van deze SVF onder standaard weefselkweek voorwaarden zullen kiezen voor een aanhanger fibroblast bevolking die hoofdzakelijk bestaat uit het type ASC. Consistent hiermee hebben we aangetoond, met flowcytometrie en immunofluorescentie, dat gekweekte SVF pellets worden in hoofdzaak vrij van de belangrijkste verontreinigende celtypen, namelijk RBCs, gladde spiercellen en endotheliale cellen van de lijn 1. De resulterende ASC populatie relatief homogeen uiterlijk en uit fibroblast-achtige cellen (Figuur 2). Deze aanhangend ASCs groeien goed in cultuur onder standaard weefselkweek omstandigheden en vertonen een matige populatieverdubbelingstijd 1 waardoor ze geschikt zijn voor tal van moleculaire en cel biology studies in vitro en in vivo studies regeneratieve. Echter, gezien de heterogene aard van de geïsoleerde SVF, validatie van de ASC bevolking noodzakelijk. Talrijke studies hebben doorstroomcytometrie gebruikt om de CD antigene profiel van gekweekte ASC karakteriseren als een potentieel middel ter identificatie van deze cellen zowel in vitro als in vivo 5-9. Tabel 1 vat de resultaten van veel van deze studies. Terwijl de expressie van een aantal van deze CD antigenen blijft controversieel, is het algemeen aanvaard dat gekweekte ASCs zijn CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 en CD140a positief. Aangezien talrijke hematopoietische CD antigenen zoals CD31 en CD45, is in overeenstemming met de mesodermale oorsprong van ASC, hoewel de expressie van specifieke hematopoietische merkers zoals CD34 blijft bestaan op dit moment. Onlangs, ASC antigene profielen, zoals bepaald door flow cytometrie, werden gebruikt om te selecteren specifieke SubPopUlations 10-12 in de hoop van het produceren van ASC met grotere differentiatie capaciteiten.
Als de meest populaire middel van validatie, in vitro inductie van de ASC bevolking met behulp van gedefinieerde kweekomstandigheden resultaten in hun differentiatie in mesodermale, ectodermale en endodermale lijnen (voor een overzicht zie 4) (Figuur 2). Terwijl in vitro tri-kiemlaag potentieel heeft geleid tot het gebruik van ASC voor allerlei regeneratieve modelsystemen, differentiatie tot osteogene, adipogenic en chondrogene cellen in het algemeen voldoende om het ASC identificeren en te bevestigen zijn multipotent. In onze handen, de adipogene differentiatie van ASC resultaten in cellen met heldere lipide vacuolen die vlek met behulp Oil Red O 5. Osteogene differentiatie leidt tot alkalische fosfatase-positieve cellen en de accumulatie van extracellulaire mineraal dat vlekken met calciumfosfaat Von Kossa Stain 5.Chondrogene differentiatie onder hoge dichtheid micromassakweek omstandigheden produceert pellets die gesulfateerde proteoglycanen (gedetecteerd met behulp van een alcianblauw vlek) en die de collageen type 2 5. Zowel skeletspieren en gladde spier differentiatie kan worden gezien met ASC kleuring op skeletspiermyosine en MYOD1 en gladde spier actine 5, 13, 14. Differentiatie in de ectodermale afkomst wordt gesuggereerd door de aanname van een neuronale morfologie door geïnduceerde ASC en de expressie van een groot neuronale markers, waaronder die van Neun, een neuronale transcriptiefactor 5. Tenslotte inductie van ASC naar een lever / endodermale lijn basis van bepaalde voorwaarden 15 resultaten in cellen die expressie alfa-fetoproteïne, een bekende marker lever hepatocyten. Deze markers, samen met talrijke andere gepubliceerd in de afgelopen 10 jaar sterk vermoeden dat het ASC is een pluripotente celpopulatie die gemakkelijk kan worden onderhouden engekweekt in vitro en geïnduceerde cellen naar de drie embryonale kiem lineages. Gekoppeld aan hun regeneratieve potentieel in vivo (voor een overzicht zie 4), kan de ASC een krachtige aanvulling op de instrumenten van een regeneratieve wetenschappelijk onderzoeker of arts zijn.
Figuur 1. Handmatig, enzymatische isolatie van humane ASC uit lipoaspirate monsters. A. Voorbereiding voor isolatie: Voor isolatie de volgende componenten worden bereid: 1) 1x PBS (zonder calcium of magnesium), gesteriliseerd via autoclaaf, 2) een oplossing van 0,075-0,1% collagenase type IA, bereid in 1x PBS en gesteriliseerd door middel van filtratie met behulp van een 0,22 pm filter unit, 3) Controle Medium (CM) voor de latere cultuur van de ASC bevolking. B. Isolatie van ASCs: Een stap-voor-stap handleiding voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit lipoaspirates wordt getoond. Stappen omvatten het wassen van de lipoaspirate met steriele 1x PBS, vertering met behulp van collagenase type IA, de verzameling van de SVF door centrifugeren, en SVF filtratie. Latere kweken van de SVF zal resulteren in een aanhanger fibroblast bevolking met het ASC bevolking. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Multi-lijn differentiatie potentieel van de hechtende ASC bevolking. Gekweekte SVF cellen resulteren in een relatief homogene populatie van aanhanger, fibroblastische ASC. Inductie van de ASC bevolking onder gedefinieerde omstandigheden resultaten in cellen van de adipogene, osteogene, chondrogenische, skelet myogene en glad myogene geslachten.Daarnaast kan ASC worden gedifferentieerd in cellen van ectodermale afkomst, NeuN expressie, een marker van neuronen en alfa-foetoproteïne (AFP) een vastgestelde markering van de endodermale / lever cellijn. Sommige histologie en immunofluorescent's zijn afkomstig uit eerder gepubliceerde resultaten 1,5,6,7,8,9. Differentiatie afkomst, samen met de histologische, immunohistologische of fluorescerende vlek wordt getoond. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
| Expressie profiel | ||
| positieve uitdrukking | negatieve uitdrukking | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD 11, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| voorgestelde fenotype van ASC (Vaak tussen twee of meer studies) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD 11, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| controversieel markers in ASCs (Differentiële resultaten over meerdere studies) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| stromale cell markers | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| hematopoietische markers | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| markers gemeen tussen 2 of meer studies vetgedrukt SMA = gladdespieractine HLA = humane leukocyten antigenen ABCG2 = multi-drug transporter eiwit G2 | ||
Tabel 1. Celoppervlak expressie profielen van menselijke ASC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vetweefsel voor de isolatie van ASC kan komen in vele vormen: van stevige stukjes weefsel verkregen door middel van resectie of lipoplasty om kleinere stukken verkregen via ofwel spuit extractie of-zuig bijgestaan lipoplasty (dwz liposuctie). Of meer SVF cellen (en daarmee ASC's) kan worden verkregen bij gereseceerde of weggezogen vet monsters is onduidelijk tegenstrijdige studies zijn gepresenteerd 16, 17. Het is mogelijk dat beide vormen van vetweefsel is meer dan geschikt voor de isolatie van cellen SVF en ASC zolang de operator bedreven in de isolatietechniek. Echter, liposuctie houdt wel een voordeel ten opzichte resectie in dat het minder invasief en vereist aanzienlijk minder post-operatieve zorg. Hoewel de vormen van liposuctie zijn toegenomen in het afgelopen decennium, met inbegrip van technieken, zoals echografie bijgestaan, power-geassisteerde en laser-assisted liposuctie 18, de meest voorkomende blijft tumescent liposuctie,waarin het vet compartiment wordt overspoeld met grote hoeveelheden steriele zoutoplossing, anesthetica en vaatvernauwers voorafgaand aan aspiratie 19. De keuze van de techniek kan variëren van chirurg chirurg. Hoewel de wijze van extractie onbelangrijk lijken de onderzoeker, is het belangrijk te realiseren dat de techniek een effect op ASC aantal en de levensvatbaarheid kunnen hebben. Bijvoorbeeld, kan het verhogen van liposuctie onderdruk negatief beïnvloeden SVF celopbrengst 20. Bovendien daalt in ASC proliferatie zijn gemeten upon-echografie-assisted liposuctie 17.
Echter verkregen, moet de aspiratie snel worden verwerkt als opslag temperaturen SVF levensvatbaarheid en uiteindelijke ASC opbrengst kunnen beïnvloeden. Onderzoeken van Matsumoto et al.. Gebleken dat ASC opbrengst vermindert als de verzamelbak wordt bewaard bij kamertemperatuur gedurende langer dan 24 uur 21. Indien nodig kunnen 24 uur opslag bij 4 ° C zonder enig schadelijk effect wordens op de biologische eigenschappen van de ASC bevolking, maar, nogmaals, levensvatbaarheid van de cellen kan verminderen als deze bewaartijd wordt verhoogd tot boven dat punt. Het gemak van lipoaspirate verwerking is direct gerelateerd aan de totale omvang. Kleinere volumes verkregen via injectiespuit extractie, zijn relatief gemakkelijk te verwerken. Echter, groter volume aspiraten, verkregen door middel van liposuctie, fysieke uitdagingen presenteren. Bijvoorbeeld kan iets eenvoudig overbrengen het vet uit het streven houder zodat het kan worden gewassen problemen opleveren wanneer de verzamelbak volume groot is. Het protocol in dit artikel is bedoeld om enige van deze problemen te verlichten.
In grote lijnen is de isolatie van ASC bevolking tegen lipoaspirates met de enzymatische methode beschreven in dit artikel niet significant veranderd in de afgelopen 10 jaar. Er zijn tal van protocollen beschikbaar via PubMed die uitstekend zijn in hun beschrijving van de isolatie van ASC uit lipoaspirates. Most van hen schetsen een zeer vergelijkbaar protocol met kleine aanpassingen. In principe is de lipoaspirate gewassen verontreinigingen, enzymatisch gedigereerd de SVF en SVF los gemaakt met het ASC bevolking, verzameld door centrifugatie. De meeste grote volume lipoaspirates komen enig soort vacuümcontainer - waarvan de configuratie kan variëren van chirurg chirurg. Dit protocol raadt het verwijderen van het aspireren in een grote, steriele beker voor het wassen, omdat de houder zelf een bron van besmetting kunnen zijn als ze niet goed schoongemaakt voordat u het in de bioveiligheid kap. Eenmaal overgebracht en bezinken door de zwaartekracht, zal de verzamelbak scheiden in drie lagen: een bovenkant, olielaag die resulteert uit de lysis van mature adipocyten, een middelste vetlaag en een onderlaag van zoutoplossing en verontreinigende rode bloedcellen. De olielaag worden verwijderd wij hebben gemerkt dat toxisch is voor de resulterende celkweken (ongepubliceerde waarnemingen) zijn. Ook deze protocol beveelt de infranatant van zoutoplossing en RBC vóór de eerste wasbeurt om het potentiële aantal contaminerende erytrocyten wanneer de ASC gekweekt verminderen zal verwijderd. Echter, een onderzoek door Francis et al.. Heeft gesuggereerd dat dit infranatant ook een bron van ASC 22 zijn. Het gebruik van een 10 ml serologische pipet maakt de verwijdering van dit infranatant relatief eenvoudig. Wat overblijft is de vetlaag die dan gemakkelijk kan worden gewassen met steriele PBS, of indien gewenst, steriele PBS aangevuld met antibiotica en antimycotische om de kans op besmetting 23-25 verminderen. Na wassen wordt het vetweefsel enzymatisch gedigereerd met een steriele oplossing van collagenase type IA. Het gebruik van een filtratie-eenheid zoals Millipore getoond in deze video combineert een geschikt middel aseptisch filteren van de collagenase in een gesloten reservoir waarin de gewassen vetweefsel kan worden toegevoegd voor verdere waterbad digestie bij 37 ° C.
Het type collagenase gebruikt varieerde per groep met collagenase type IA schijnen het vaker 1, 24, 25 te zijn. Er zijn meer dan 11 verschillende soorten collagenase commercieel verkrijgbaar, elk met spijsvertering affiniteiten voor specifieke weefsels. Voor de digestie van vetweefsel, bedrijven zoals Sigma Aldrich aanbevolen door collagenase type I en II en beide zijn vertegenwoordigd in de huidige literatuur 1, 24-27. In hun oorspronkelijke artikel, Zuk et al.. Gebruiken collagenase type IA verkregen uit runderbronnen in een concentratie van 0,075% 1. Echter, de meeste commerciële bronnen van collagenase type IA nu verkregen door de anaërobe bacterie Clostridium histolyticum of E. coli genetisch gemodificeerd met C. histolyticum genen. Veel bedrijven bieden tal van bereidingen van collagenase type IA, uit ruwe die voorbereid door ammoniumsulfaatprecipitatie. Deprotocol beschreven in dit artikel Jupiter gebruikt een ruw preparaat van type IA collagenase dat niet alleen collagenase activiteiten bevat, maar ook niet-specifiek protease, clostripain en tryptische enzymatische activiteiten. Hoewel deze extra enzymen zijn essentieel voor faatontsluitrendement 28 zijn er mensen die veel rapporteren aan veel variatie aangaande ruwe collagenase type IA 28, 29 en hun concentraties van de collagenase tot 0,2% aan efficiënte vertering 23 verkrijgen. Die groepen met behulp van ruwe collagenase type IA raden ook zijn aanvulling met bovine serum albumine (0.1-1.0% BSA) om de prestaties van het enzym verbeteren en de stabiliteit van de cellen in het vetweefsel matrix. Dit kan echter niet nodig, aangezien het protocol beschreven in dit artikel wordt collagenase zonder suppletie zonder nadelige invloed op de spijsvertering efficiëntie.
Voor diegenen die een meer gedefinieerde collagenase comp gebruikenSTANDPUNT, commerciële bronnen die sterk gezuiverd collagenase samen met een precieze mix van proteasen zijn nu beschikbaar. Deze preparaten zuiveren clostridium collagenase type I en II bij hoge activiteit en combineer ze met bekende neutraal protease activiteiten, zoals dispase en thermolysine. Efficiënte vet digestie met collagenase en thermolysine is gemeld door Zachar et al.. 27. In overeenstemming met dit werk, Pilgaard et al.. 30 melden ook prima spijsvertering efficiëntie met behulp van verschillende mengsels van collagenase en thermolysine. Echter, ze observeren betere spijsvertering efficiëntie gebruik van preparaten van collagenase en dispase.
Digestietijden voor de isolatie van cellen van vetweefsel kan variëren van onderzoek tot onderzoek. Veel gepubliceerde protocollen raden digestietijden van 1-2 uur 27, 30. Het is echter belangrijk te beseffen dat buitensporige digestietijden uiteindelijk beïnvloeden het aantal levensvatbare ASCs en hun stamcel fenotype. Pilgaard en collega's hebben vastgesteld dat 2 uur digestie bij 37 ° C geeft de beste balans tussen weefsel dissociatie en ASC functionaliteit 30, met Zachar et al.. Aanbeveling dat digestie afgelopen 45 min, opgemerkt elke 15 minuten tot 2 uur maximum, spijsvertering wordt gestopt zodra het vetweefsel neemt op een meer homogene uitstraling 27. Wij zijn het eens met deze aanbeveling. Het is echter onze ervaring dat de meeste collagenase type IA preparaten in 0,075-0,1% kunnen verteren grote hoeveelheden lipoaspirates in 30-45 min en dat deze tijden geschikt zijn om een voldoende aantal cellen bevrijden. Daarom is dit protocol adviseert een vertering van 30 minuten. Als er meer tijd nodig is, moet de consistentie van de lipoaspirate worden bewaakt en de spijsvertering gestopt wanneer de lipoaspirate gaat uit van een "romige" of "soeperig" uiterlijk (figuur 1).
Zodra the vertering voltooid, isolatie van het model SVF wordt eenvoudig bereikt met behulp van centrifugatie. Echter, zoals aspiratie druk, de fysieke effecten van centrifugeren kan een effect hebben op SVF levensvatbaarheid en het aantal ASCs beschikbaar voor cultuur. Een studie door Kurita en collega's 31 heeft aangetoond dat snelheden van meer dan 3.000 xg de ASC kunnen beschadigen. Toch moet snelheden groot genoeg om voldoende pelleteren van de SVF waarborgen. In de regel, de meeste protocollen, waaronder deze, raden een centrifugeersnelheid van 1,200-1,500 x g. Zorg moet worden genomen door de onderzoeker om ervoor te zorgen dat ze begrijpen van de relatie tussen middelpuntvliedende kracht (gemeten in g) en centrifugeren snelheden (gemeten als rpm), als de relatie is afhankelijk van de specifieke centrifugerotor. Echter, in de regel, lagere centrifugale krachten, zoals 1200 xg, vaak overeen met centrifugeersnelheid en kunnen veilig onderling uitwisselbaar.
Na het spinnen, verschillende diinstinct lagen waargenomen in de centrifugebuis (figuur 1): een bovenlaag van olie en "zachte" witte adipocyten, een middelste laag en een collagenase celpellet. De pellet zelf kan hebben twee verschillende lagen: een bovenlaag van RBC en een lagere witte SVF pellet, die het ASC. Dit protocol beveelt voorzichtig opzuigen van de olie en adipocyten, zoals de olie giftig voor de celkweek zijn en adipocyten is aangetoond dat naar een meer primitief celtype 32 staat dedifferentiatie zijn. Toch kunnen deze adipocyten worden geoogst op dit punt, indien gewenst. Omwille van deze verontreinigingen, dit protocol raadt een extra wasstap om hun adequate verwijdering te garanderen. Deze stap maakt het ook mogelijk de onderzoeker meerdere SVF pellets voor verdere gemak van filtratie te combineren. Filtratie is waarschijnlijk noodzakelijk zijn vanwege de aanwezigheid van grote stukken materiaal fibrotische en cellulaire aggregaten na digestie. Deze materialen worden gemakkelijk verwijderddoor eenvoudige zwaartekracht gebaseerde filtratie door 70 of 100 um mesh filters. Een aliquot van het filtraat worden genomen om het aantal kernhoudende cellen indien gewenst en het resterende filtraat plated voor ASC hechting en groei tellen.
Ondanks ijverige pogingen om zoveel RBC's te verwijderen als mogelijk worden geen ASC voorbereiding volledig zijn zonder RBC besmetting. In het oorspronkelijke artikel wij de verwijdering van deze RBC door resuspenderen van de pellet in een hypotone oplossing van 160 mM NH4Cl voorgesteld. De meerderheid van de daaropvolgende isolatie artikelen bevatten deze stap en bevelen het gebruik van NH 4 Cl-gebaseerde oplossingen of steriel water 22-24, 27, 33, hoewel zorg moet worden genomen bij gebruik van steriel water, op het moment dat de SVF cellen worden blootgesteld te minimaliseren de hypotonische oplossing 27. Echter, deze stap niet nodig als RBC een niet-hechtende celpopulatie en kan gemakkelijk worden verwijderd na een overnacht cultuur vanASC bevolking. Voorts terwijl anekdotisch hoogstens deze RBC lijken de aanvankelijke expansie van de verkregen hechtende cellen (Zuk, ongepubliceerde waarnemingen) verbeteren. Als zodanig is dit protocol elimineert de RBC lysisstap en stelt voor dat de eerste ASC culturen worden toegestaan om uit te breiden in de aanwezigheid van deze RBC voor de eerste 3-4 dagen zonder enige verandering van kweekmedium. De reden voor deze waarneming kan zijn wegens een van paracrienen vanaf contaminerende bloedcellen of kan gewoon door betere levensvatbaarheid met uitsluiting van de RBC lysis stap. Naar aanleiding van deze, kan het kweekmedium worden afgezogen en de meerderheid van RBC verwijderd door voorzichtig wassen van de platen met steriele 1x PBS. Na verloop van tijd zal een resterende RBC uiteindelijk sterven en uit de kweek worden verwijderd.
Studies van Zachar en Boquest hebben geschat dat 25-50% van de geresuspendeerde SVF pellet zich aan weefselkweekkunststof 23, 27. De resulterende "passage 0" ASC cultures heterogene, uit kleine, ronde cellen vermoedelijk ASCs en onregelmatig gevormde cellen voorgesteld endotheliale oorsprong te zijn. Hoewel studies door vele groepen waaronder ons de afwezigheid van verontreinigende celtypen zoals SMC, hematopoietische cellen en fibroblasten in ASC kweken 1 bevestigd, kan de aanwezigheid van andere celtypen niet worden uitgesloten. . Inderdaad, Tallone et al. heeft passage 0 culturen gekarakteriseerd en waargenomen vier verschillende populaties: 1) kleine, ronde, snel vernieuwen van cellen, 2) spoelvormige fibroblast cellen gedacht dat de ASC zijn, 3) langzaam replicerende grote cellen met een beperkter potentiaal (bijvoorbeeld pre-adipocyten) en 4) kubische endotheelcellen die verloren gaan met een passage 34. Latere studies hebben aangetoond dat de ronde snel verlenging celpopulatie bezit de hoogste multipotentiality en express typische stamcel markers 35, 36. Bovendien kunnen zij 'Steroiden "vormen doorde snelle proliferatie en worden vaak omringd door spoelvormige fibroblasten. Als zodanig is het mogelijk dat de hierboven voorgestelde spoelvormige ASC populatie afkomstig uit deze cellen. Na de eerste uitbreiding van deze passage 0 ASC culturen, wordt gedacht dat de aanhoudende kweken tijd kiest voor het ASC, met de resulterende kweken uitgaande van een fibroblast, homogene samenstelling. Echter, resten van contaminerende cellen niet volledig worden uitgesloten en, bijgevolg, het ASC populatie moet nog steeds heterogeen beschouwd.
Hoewel de in dit artikel beschreven protocol is eenvoudig, goedkoop en geen onderdelen van de uitrusting niet normaal in een weefselkweek inrichting vereisen, heeft het het nadeel dat een dergelijke voorziening. Talrijke studies hebben de translationele toepassingen van ASC onderzocht door middel van diermodellen en klinische studies met behulp van de ASC zijn begonnen te verschijnen (zie voor een overzicht 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs van dit manuscript zijn mede-uitvinders op een patent in handen van de Regenten van de Universiteit van Californië en in licentie gegeven aan Cytori Therapeutics.
Acknowledgments
De auteurs willen erkennen en dank die aanvullende onderzoek personeel die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van het protocol beschreven en de isolatie van ASC, waaronder: dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD , Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, PhD, en Dr John Fraser, PhD. De gepresenteerde resultaten werden gefinancierd, voor een deel, door onderzoek subsidies van de National Institutes of Health, waaronder de NIAMS en NIDCR Instituten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
References
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M.
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
