Summary
В 2001 году исследователи из UCLA описано изоляция популяции взрослых стволовых клеток, называется полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС, из жировой ткани. В этой статье описываются изоляцию ИСС от lipoaspirates использованием ручной, ферментативный протокол пищеварения с использованием коллагеназы.
Abstract
В 2001 году исследователи из Университета Калифорнии в Лос-Анджелесе, описано выделение новой популяции взрослых стволовых клеток из liposuctioned жировой ткани, что они изначально называется, Обработанные липоаспирата клеток или PLA клетки. С тех пор, эти стволовые клетки были переименованы в жировой ткани стволовых клеток или ИСС и пошли дальше, чтобы стать одним из самых популярных групп населения взрослые стволовые клетки в области исследования стволовых клеток и регенеративной медицины. Тысячи статей теперь описано использование ИСС в различных регенеративных животных моделях, в том числе регенерации костной ткани, периферической нервной ремонта и сердечно-сосудистых техники. Последние статьи начали описывают множество применений для ИСС в клинике. Протокол показано в этой статье описывается основная процедура для вручную и ферментативно изоляции ИСС от больших количеств lipoaspirates полученных из косметических процедур. Этот протокол может быть легко масштабируется вверх или вниз для Accommodели объем липоаспирата и могут быть адаптированы, чтобы изолировать ИСС из жировой ткани, полученные через abdominoplasties и других подобных процедур.
Introduction
В 2001 году предполагаемый население мультипотентными стволовых клеток из жировой ткани была описана в журнале Tissue Engineering 1. Эти клетки получили название Обработано липоаспирата или PLA клетки из-за их выводе из обработанного липоаспирата ткани, полученные с помощью косметической хирургии. Метод изоляции описано в этой статье было основано на существующих ферментативных стратегий изоляции стромальных сосудистой фракции (SVF) от жировой ткани 2. SVF была определена как минимально обработанного населения эритроцитов, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, перицитами и преадипоцитов, которые еще придерживаются культуры ткани подложки 2, 3. Культивирование этого SVF течением времени предлагается устранить многие из этих загрязняющих клеточных популяций и привести к прикрепленной, фибробластов населения. Эти фибробласты были определены в литературе за последние 40 лет, как быть предварительноадипоциты. Тем не менее, наша исследовательская группа показала, что эти клетки обладают мезодермального мультипотентность и переименовал приверженцем SVF население в НОАК клеток. Последующие исследования многих других исследовательских групп добавили к этому потенциалу, предполагая, как энтодермальных и эктодермальные потенциалов (см. обзор 4). С того времени, многочисленные дополнительные условия для этих клеток появились в литературе. В целях обеспечения некоторый тип консенсуса, термин полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС была принята на й ежегодной конференции 2 IFATS. Таким образом, термин ASC будет использоваться в этой статье.
Протокол, описанный в этой статье, относительно простая процедура, которая требует стандартный лабораторного оборудования и использует простые реагенты, такие как фосфо-солевом буфере, стандартных для культивирования тканей СМИ реагентов и коллагеназы. Он может производить большое количество ИСС в зависимости от количества исходного объема ткани жировой и последующее Culture время. Однако обработка такого большого количества жировой ткани может представить некоторые физические проблемы, которые могут быть уменьшены до такой степени, используя этот протокол. Кроме того, этот протокол требует стерильных культуры ткани объектов и утвержденные капюшоны биобезопасности, возникает необходимость использования утвержденного культуры объекте ткани. Это требование может также уменьшить полезность населения ASC в клинической практике, если они не изолированы в надлежащей производственной практики (GMP), одобренные устройства, предназначенные для изоляции и расширения материалов для клинического использования. В качестве альтернативы, автоматизированные системы, которые могут изолировать ИСС в замкнутой системе в операционной избежал бы этого ключевого вопроса и создать условия для немедленного использования ИСС без какой-либо необходимости в последующей экспансии в пробирке. На сегодняшний день существует шесть автоматизированных систем, которые доступны в продаже для выделения клеток из тканей человека. Эти системы могут сделать возможным изолироватьЗначительное число ИСС из большого количества жировой ткани сразу после его урожай. Эти ИСС может затем быть вновь в организм пациента для различных восстановительных целях без пациента покидая операционную. В дополнение к этому протоколу, описывающей ручной изоляцию ИСС, протокол для автоматизированного выделения ИСС использованием Celution система также приведены в сопутствующей статье.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол показано здесь описывает ручной изоляцию ИСС от lipoaspirates, полученных с помощью косметических процедур с использованием ферментативного пищеварения и дифференциального центрифугирования. Этот протокол был впервые опубликован в журнале тканевой инженерии в 2001 году 1, где полученные клетки называется Обработанные клетки липоаспирата или PLA клетки из-за их изоляции от lipoaspirates. Однако термин НОАК клеток в настоящее время заменен с термином полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС, чтобы дать области какую-то соответствии с точки зрения номенклатуры. Клетки, выделенные через этот протокол, как было показано многими обладать мезодермального потенциал как в пробирке и в естественных (см. обзор 4). Кроме того, эктодермальном и энтодермальные потенциалы ASC были также исследованы четыре. Техника изоляции прост и понятен и требует приблизительно один час, чтобы закончить. Полученный клеточныйс культивируют в стандартных условиях культивирования тканей. Со временем культура, население ASC становится более однородным, состоит из фибробластов клетки, которые расширяют легко и показывают хорошую жизнеспособность в долгосрочной перспективе в области культуры.
Примечание: Следующие части оборудования, которые необходимы перечислены в конце этой статьи. Все изделия из стекла, средства массовой информации и реагенты должны быть стерилизованы через автоклаве или фильтруют через 0,22 мкм фильтры. Асептические тканевых культур следует придерживаться во все времена. Чтобы обеспечить это, все материалы, размещенные в корпусе биологической должны быть стерилизованы путем распыления с 70%-ным раствором этанола и протиранием чистой бумажными полотенцами.
1. До урожая, подготовить следующие:
- Стерильные 1X фосфо-буферный солевой раствор (PBS) для промывки lipoaspirates. Подготовка приблизительно 1 л 1x PBS на каждые 100 мл липоаспирата. Автоклав с PBS и всеOW остыть до комнатной температуры перед использованием. Как вариант, антибиотик / противогрибковым могут быть добавлены к окончательной концентрации: 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2,50 мкг / мл амфотерицина один раз PBS остынет.
- Стерильная 0.075-0.1% Тип коллагеназы И.А. (от Clostridium histolyticum) для ферментативного переваривания липоаспирата. Концентрация будет зависеть от качества и источника коллагеназы - то есть сырой против очистке. Другие коллагеназы типа могут быть использованы (тип например коллагеназы II или IV) при аналогичных концентрациях. Подготовка в 1х PBS и стерильный фильтр с использованием системы фильтрации 1000 мл 0,22 мкм фильтр (фиг.1А). Тем не менее, также могут быть использованы стерильные стеклянные бутылки, снабженные верхним фильтром бутылки. Подготовить и использовать при комнатной температуре. Коллагеназы решения могут храниться в течение краткосрочной перспективе при 4 ° С до использования. Не замораживать коллагеназы решение, как это может уменьшить свою деятельность.
- Стерильная управления Средний (CM) для коллагеназы инактивации и культивирования населения ASC. Для 500 мл CM, комбинировать следующим образом: 500 мл DMEM (4,5 г / л глюкозы, с L-глутамина), 50 мл фетальной бычьей сыворотки (инактивированной нагреванием), 5 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ пенициллин, 10000 мкг / мл стрептомицин). Как вариант, также могут быть добавлены 5 мл амфотерицина В (250 мкг / мл амфотерицина B). Стерильная фильтрация этом СМИ не требуется, если используются нестерильные реагенты. Поместите см в 37 ° С водяной бане 30 мин до использования, чтобы нагреть среду.
- Стерильная посуда и Пластик для изоляции. Автоклав стеклянную мензурку 1000 мл и дайте ему остыть до комнатной температуры перед использованием. Кроме того, имеет место следующая Пластик готов: асептический серологические пипетки (5 мл, 10 мл и 25 мл), 50 мл центрифужные пробирки и культуры ткани обработанных чашки для культивирования.
2. Выделение ИСС от Lipoaspirates
Большинство lipoaspirates собирают в контейнер аспирации (см. рисунок 1b) и может состоять из трех отдельных слоев: 1) верхний слой масла за счет лизиса зрелых адипоцитов, 2) средний слой жировой ткани и 3) дно, жидкость нижний слой, содержащий солевой раствор и загрязнение типы клеток, такие как красных кровяных телец (эритроцитов). Верхний слой масло не может присутствовать в значительных количествах. Если присутствует, он должен быть атмосферный как загрязнение масла полученной культуры ASC может повлиять на жизнеспособность культуры. В нижней нижний слой должен быть удален до обработки, чтобы минимизировать загрязнение ASC культур с БС. Это оставит середину, жировой слой ткани, которые затем будут мыть и ферментативно переваривается, чтобы освободить свой сотовый, стромы сосудистого фракцию (НВФ).
- Мытье липоаспирата: Откройте липоаспирата контейнер в культуре ткани чООД и тщательно слейте липоаспирата в стерильный 1 л стеклянный стакан. Позвольте липоаспирата слои отделить пока жировая слой ткани не хорошо разделены (рис. 1b).
- Аспирируйте от слоя масла (если присутствует) с помощью стерильной пипетки, стекло и нижнюю солевой нижний слой с использованием 10 мл серологической пипеткой. Это позволит удалить большую большинство загрязняющих красных кровяных клеток и физиологический раствор.
- Оценить объем полученной жировой ткани слоем и добавить стерильный 1X PBS в равном объеме. Размешайте аспирируйте с пипетки, используемой для аспирации для того, чтобы смешать липоаспирата с PBS. Разрешить эти два слоя, чтобы обосноваться. Как отмечалось выше, 1X PBS может быть дополнена антибиотик / противогрибковых средств.
- Аспирируйте нижний слой с использованием 10 мл серологической пипеткой.
- Продолжайте промывать долю жировой ткани, как описано в пунктах 2.1.2. и 2.1.3. пока жировая слой не имеет желтый / золотой цвет. Аспирируйте йэ нижний слой в последний раз, в результате чего часть жировой ткани в стеклянный стакан. Для обеспечения достаточной удаление нижний слой, позволяют липоаспирата слои урегулировать в течение 5 мин после последней промывки и перед заключительной аспирации.
- Ферментативного расщепления из липоаспирата: Подготовка стерильного раствора коллагеназы 1A, как описано выше в блоке фильтра. Подготовка объем, равный тому из жировой фракции и стерильный фильтр.
- После фильтрации раствора коллагеназы, отбросить верхний блок фильтра, осторожно влить промытого жировой фракции в коллагеназы решение и плотно закрыть бутылку.
- Поместите коллагеназа / жировой смеси в водяной бане при 37 ° и переварить при 37 ° С в течение 30 мин. Аккуратно водоворот коллагеназы / жировой смеси через каждые 5-10 мин и поместите обратно в водяной бане. Жировая слой ткани должны взять на себя "гладкой" внешний вид (Figurэ 1B) в качестве пищеварения доходов. Дополнительные раз пищеварения (т.е. до 2 часов) может быть использована, если жировая слой ткани еще, кажется, есть твердые кусочки жира в нем.
- Выделение ИСС: Место переваривается коллагеназы / жировая смесь обратно в шкаф биобезопасности. Обязательно стерилизуйте блок фильтра с 70% этанола до размещения обратно в шкаф.
- Пипеток 25 мл аликвоты нижний слой, содержащего СФДВ в стерильные 50 мл центрифужные пробирки.
- Добавить 25 мл CM в каждую пробирку. Разрешить CM для инактивации коллагеназы путем инкубации при комнатной температуре в шкафу в течение 5 мин.
- Центрифуга течение 10 мин при 1200 х г собирать СФДВ как таблетки.
- В кабинете биобезопасности, аспирации супернатант из каждой пробирки. Убедитесь, что верхний слой масла и любые плавающие адипоциты атмосферный с этим супернатанта (
- Объедините SVF гранул в одной центрифуге трубки, используя 30 мл CM и разделить поровну на две новые 50 мл центрифужные пробирки. Центрифуга, как в пункте 2.3.3. и аспирации супернатанты от двух СФДВ гранул (не показаны на рисунке).
ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Если РБК лизис желательно, ресуспендируют каждый SVF осадок в 10 мл в буфере для лизиса РБК (160 мм NH 4 Cl) и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифуга, как в пункте 2.3.3. и аспирации супернатанты уступить СФДВ гранулы (не показаны на рисунке).- Объедините две SVF гранул в одну новую пробирку для центрифугирования с использованием 5-10 мл CM (рис. 1В).
- Чтобы отфильтровывать крупные частицы ткани, пипетки ресуспендировали осадок на SVF сетки фильтра 100 мкм размещенного в верхней части новой 50 мл центрифужную пробирку и позволяют фильтровать самотеком.
- Внесите аликвоты ресуспендировали(И фильтруют) SVF осадок, содержащий ИСС на тканевых культур, обработанных чашек для культивирования. Дополнение каждое блюдо с соответствующим объемом CM.
- Культуры клеток в КМ в течение 3-4 дней при 37 ° С, 5% СО 2 без изменения массовой информации.
- Объедините SVF гранул в одной центрифуге трубки, используя 30 мл CM и разделить поровну на две новые 50 мл центрифужные пробирки. Центрифуга, как в пункте 2.3.3. и аспирации супернатанты от двух СФДВ гранул (не показаны на рисунке).
После этого начального периода культуры, культура СМИ может быть атмосферный и любые загрязняющие эритроциты мягко удаляют промыванием стерильной 1XPBS. Замените CM и продолжают культуры в ИСС по мере необходимости. Тип ткани чашки для культивирования, используемой как и ресуспендировали осадок СФДВ разделена среди этих блюд будет зависеть от числа клеток, требуемых следующее обычной тканевой культуры.
3. Характеристика ASC Население: проточной цитометрии и мультилинейной Дифференциация
После выделения характеристика населения ASC должны быть выполнены. Традиционные подходы для этого включают потока цитометрия охарактеризовать клеточной поверхности CD антиген профиля клеток и дифференциации в пробирке для подтверждения их способности мультилинейной дифференциации. В то время как множественные клоны могут быть оценены в ИСС, этот протокол описывает дифференциацию ИСС в клетки адипогенной, остеогенные и хондрогенных линий как средство подтверждения мультилинейной мезодермальные потенциалы 5.
В пробирке нескольких клонов дифференциации ИСС
- Остеогенной дифференцировки из ИСС: До индукции остеогенной подготовить Средний (OM) следующим образом: К одному 500 мл бутылку DMEM (4,5 г / мл глюкозы) добавить 25,0 мл FBS (5,0% конечная концентрация) и 5,0 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ / мл и конечные концентрации 10000 мг / мл, соответственно). Для этого добавьте следующие остеогенных индукционных агентов с получением указанной конечной концентрации: дексаметазон (0,1 мкМ окончательный), L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата (50,0 мкМ конечные) И β-глицерофосфат (10,0 мМ конечной).
- До индукции, урожай и пластины культивированные ИСС в нужное блюдо культуры ткани таким образом, что сплошности из примерно 50% достигается. Для каждого экспериментального блюдо покрытием, пластины дополнительный блюдо для не-индуцированной контроля. Культура ночь в СМ.
Примечание: 50% слияния рекомендуется для того, чтобы обеспечить продолжение пролиферации, которые могут возникнуть в течение индукции - В день индукции, удалить среды и добавьте следующий: OM к желаемым остеогенных экспериментальных скважин и СМ в контрольных лунках. Объем носителей, используемых будет зависеть от размера блюдо культуры ткани. В течение 12-луночные планшеты, 1,0 мл среды на лунку является достаточным. За 6 блюд также, 2,0 мл СМИ на лунку достаточно. Для 100 мм чашках, следует использовать 10,0 мл среды на чашку.
- Культура клетки в течение как минимум 14 дней с изменениями соответствующей среде каждый 3-4дней. Высоко остеогенные населения ASC может показать признаки внеклеточного отложения минералов уже в 7 дней индукции.
- Остеогенной дифференцировки (т.е. внеклеточного минеральная осаждение) может быть подтверждено с помощью гистологического пятно фон Косса для фосфата кальция. Это пятно будет производить черно-коричневый осадок, идентифицирующий наличие внеклеточного фосфата кальция (см. рисунок 2).
Чтобы окрасить с фон Kossa реагента:- Извлеките ОМ из экспериментальных клеток и см от контрольных клеток
- Fix клетки в течение 60 мин в 4,0% параформальдегиде подготовлен в 1x PBS.
- Промывают клетки два раза 1х PBS.
- Инкубируйте клетки с 2,0% нитрата серебра (полученного в воде) в темноте в течение 30 мин.
- Снимите нитрат серебра, мыть два раза дистиллированной водой и воздушно-сухих клеток.
- Expose клетки к воздействию ультрафиолетового излучения в течение 60 мин, чтобы развивать калбилирубина фосфат осадок.
- Вымойте клетки несколько раз 1XPBS.
- Контрастирующая ячейку гематоксилином если это необходимо.
- До индукции, урожай и пластины культивированные ИСС в нужное блюдо культуры ткани таким образом, что сплошности из примерно 50% достигается. Для каждого экспериментального блюдо покрытием, пластины дополнительный блюдо для не-индуцированной контроля. Культура ночь в СМ.
- Адипогенной Дифференциация ИСС: До индукции, подготовить Adipogenic Средний (AM) следующим образом: Для одного 500 мл бутылку DMEM (4,5 г / мл глюкозы) добавить 50,0 мл FBS (10,0% конечной концентрации) и 5,0 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ / мл и 10000 конечные концентрации мкг / мл, соответственно). Для этого добавьте следующие Adipogenic индукционные агентов, чтобы дать указанные конечные концентрации: дексаметазона (1,0 мкМ финал), 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX - 0,5 мм Конечная), индометацин (0.2 мм окончательные) и инсулин (10,0 мкмоль финал ).
- До индукции, урожай и пластины культивированные ИСС в нужное блюдо культуры ткани таким образом, что сплошности около 80% достигается. Для каждого экспериментального блюдо покрытием, пластины дополнениеаль блюдо для не-индуцированной контроля. . Культура ночь в СМ Примечание: адипогенной дифференциация ИСС представляется более эффективным с повышенным слияния.
- В день индукции, удалить среды и добавить следующее: AM к желаемым остеогенных экспериментальных скважин и СМ в контрольных лунках. Объем носителей, используемых будет зависеть от размера блюдо культуры ткани. За 12-луночные планшеты, 1.0.ml СМИ на лунку достаточно. За 6 блюд также, 2,0 мл СМИ на лунку достаточно. Для 100 мм чашках, следует использовать 10,0 мл среды на чашку.
- Культуры клеток в течение как минимум 14 дней с изменениями соответствующей среде каждые 3-4 дней. Высоко Adipogenic населения ASC может показать признаки формирования липидного вакуолей уже в 7 дней индукции.
- ИСС, проходящие Adipogenic дифференциацию будет развиваться несколько вакуолей липидов, которые могут быть легко визуализированы под световым микроскопом. Кроме того, адипогенной дифференциация можетбыть подтверждена с помощью гистологического пятно нефти Красный O, которая будет аккумулировать в этих вакуолей (см. рисунок 2).
Чтобы окрасить с нефтяной Красной O:- Извлеките носитель из экспериментальных и контрольных клеток и исправить их в течение 60 мин с использованием 10% официального фиксатором кальция. Для подготовки этого фиксатором, объединить следующим образом: 1,0 г CaCl 2, 25,0 мл 16% параформальдегида (4,0% финал) и 75,0 мл дистиллированной воды.
- Промыть клетки два раза 1х PBS.
- Вымойте клетки кратко с 70% этанола.
- Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 5 мин с раствором масла Red вывода. Для приготовления раствора масла Red O, растворить 2,0 г масла Red O порошка в 50,0 мл 70%-ного этанола и 50,0 мл ацетона.
- Промывают клетки с 70% этанола и затем водопроводной водой.
- Визуализация клеток вскоре после окрашивания из-за угасания пятно со временем.
- Хондрогенной Дифференцирование ИСС: хондрогенной дифференциация достигается за счет техники культуры высокой плотности именуемого "Micromass культуры». До культуры, подготовить хондрогенной Средний (МП) следующим образом: К одному 500 мл бутылку DMEM (4,5 г / мл глюкозы) добавить 5,0 мл FBS (1% конечная концентрация) и 5,0 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ / мл и 10000 мкг / мл конечные концентрации, соответственно). Для этого добавьте следующие хондрогенной индукционные агентов, чтобы дать указанные конечные концентрации: L-аскорбиновая-2-фосфат (50,0 мкг / мл конечная), инсулина (6,25 мкг / мл конечная), трансферрина (6.25 мкг / мл конечная) и TGF 1 (10,0 нг / мл).
- Урожай ИСС и центрифуги в течение 5 мин при 1200 мкг в для осаждения клеток. Граф клеток, чтобы определить плотность клеточной суспензии.
- Для приготовления Micromass гранулы, подготовить две клеточные суспензии: один экспериментальный суспензии, приготовленной в ChM при плотности 1 × 10 7 клетокS / мл и один элемент управления Суспензию, полученную в СМ при плотности 1 × 10 7 клеток / мл.
- Наведите 10,0 мкл "капельки" из суспензии клеток в отдельные лунки блюдо с несколькими хорошо. Разрешить придерживаться в течение 2-3 часов при температуре 37 ° С.
- Аккуратно наложения пластинчатые капли с либо ChM или CM стараясь не отделить клетки.
- Культуры клеток на срок до 14 дней в ChM или CM с изменениями в среде каждые 3-4 дней. Клеток, культивируемых в ChM будет конденсироваться за это время сформировать высокой плотности Micromass шарик с практически нет клеток в окружающей монослоя. Контрольные клетки, культивируемые не претерпит этой конденсации и многие будут найдены в виде монослоя.
- Чтобы подтвердить, хондрогенез, исправить гранулы в течение 15 мин в 4,0% параформальдегида (полученного в 1х PBS) при комнатной температуре. Пятно на наличие сульфатированных протеогликанов использованием альциановым голубым гистологическое пятно.
Чтобы окрасить с помощью альциановым Blue:- Вымойте годовыхraformaldehyde фиксированной гранулы раз в 1x PBS.
- Инкубируйте гранулы в 0,1 N НСl (рН 1,0) в течение 5 мин, чтобы снизить рН.
- Снимите HCl и добавить 1% альциановым синий реагента (подготовленный в 0,1 N HCl, рН 1,0). Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Снимите альциановым синий реагент и мыть гранул 0,1 н HCl (рН 1,0), чтобы удалить лишнюю пятно.
- Дополнительные моет с использованием водопроводной воды может быть использован для уменьшения фоновое окрашивание.
- В качестве альтернативы, Micromass гранулы могут быть собраны, фиксировали в течение ночи в 10% формалине, заливали в парафин и срезы окрашивали на альциановым голубым.
4. Цитометрический Характеристика ИСС
Характеристика клеточной поверхности CD профиль антигена может быть осуществлено посредством обычного цитометрии потока.
- Подготовка ИСС для проточной цитометрии: Доанализу, подготовить проточной цитометрии Buffer (FCB), состоящую из следующих действий: 1.0% БСА, 2,0% FBS и 0,025% сапонина, полученного в 1x PBS.
- Урожай ИСС и Центрифуга клетки в течение 5 мин при 1200 мкг в производить осадок.
- Ресуспендируют клеток в стерильной 1XPBS и считать клетки с помощью гемоцитометра. Определить плотность клеток в суспензии.
- Разделите подвеску вверх в аликвотам 5 х 10 5 клеток общего и центрифуг для осаждения.
- Удалить супернатант PBS и фиксации клеток в течение 60 мин при -20 ° С с избытком охлажденного льдом 70% этанола. При необходимости, эти клетки могут быть сохранены в этом 70% этанола в -20 ° C морозильник до необходимости.
- После фиксации, тщательно аспирата этанола и осторожно мыть осадок два раза с избытком FCB. Для мытья:
- Добавить избыток FCB и осторожно ресуспендируют осадок.
- Центрифуга в течение 5 мин при 1200 мкг в собирать клеткиса осадок.
- Тщательно аспирата супернатант FCB.
- Повторите.
- Удалить конечный FCB стирки супернатант из каждой аликвоты и ресуспендируют в 100 мкл FCB. Добавить нужный флуорохромом-сопряженных первичных антител с использованием предложенной разбавление производителя. Инкубируйте клетки на льду с антителом в течение 30 мин.
Примечание: Если конъюгированное с флуорохромом первичные антитела не доступны, могут быть использованы несопр женные первичные антитела. - Для каждого используемого флуорохромом (например, FITC, РЕ), инкубируют аликвоты клеток 100 мл FCB, содержащей изотипа IgG, в качестве отрицательного контроля.
- Выдержите один аликвоты в 100 мл FCB, не содержащей антител в качестве дополнительного контроля.
- Промойте каждую аликвоту клетки два раза FCB, как описано в шаге 4.1.5. После последней промывки ресуспендируйте аликвоты в 100 мл FCB и заполните анализа потока.
Примечание: Если были использованы несопряженные первичные антитела: После этого мыть шаг инкубировать аликвоты на льду в течение 20 мин с FCB дополнен соответствующими флуорохромом-сопряженных вторичными антителами, используя предложенную разбавление производителя. Вымойте два раза как указано в пункте 4.1.5.
- Поток анализ ИСС: Для анализа потока, как минимум, 10000 событий следует учитывать. Неокрашенные и изотипу управления должны быть использованы для установки ворот на рассеяния вперед (FSC) и боковой разброс (SSC). Для этого, нет управления антител (т.е. неокрашенные) стадии 4.1.8 не должны использоваться для устранения мусора и мертвых ИСС. В изотипу IgG управления со стадии 4.1.7. следует использовать для установления области положительной флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
План протокол выше описывает ручной, ферментативный способ выделения из SVF из большого объема образца липоаспирата. В рамках этой СФДВ многочисленные клеточные популяции, в том числе ASC. Многочисленные исследования предполагают, что культивирование этой СФДВ в стандартных условиях культивирования тканей выберет для сцепленным населения фибробластов, вероятно, будет в основном состоит из типа ASC. В соответствии с этим, мы показали, с помощью проточной цитометрии и иммунофлюоресценции, что культивируемые СФДВ гранулы становятся практически не содержит основных загрязняющих видов клеток, а именно эритроцитов, клеток гладкой мускулатуры и клеток эндотелия линии 1. В результате население ASC относительно однородными по виду и состоит из фибробластоподобных клеток (рис. 2). Эти адгезивные ИСС хорошо расти в культуре в стандартных условиях культивирования тканей и обладают умеренной время удвоения популяции 1 делает их пригодными для многочисленных молекулярной и клеточной Biology исследования в пробирке и регенеративных исследований в естественных условиях. Тем не менее, в свете гетерогенной природы изолированной СФДВ, проверка населения ASC необходимо. Многочисленные исследования используются проточной цитометрии для характеристики антигенный профиль CD культивируемых ИСС как потенциальное средство идентификации этих клеток в пробирке и в естественных условиях 5-9. Таблица 1 суммирует результаты многих из этих исследований. В то время как выражение некоторых из этих CD антигенов остается спорным, это общее мнение, что культивируемые ИСС являются CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 и CD140a положительным. Отсутствие многочисленных гемопоэтических CD антигенов, таких как CD31 и CD45, согласуется с мезодермальной природы ИСС, хотя экспрессия специфических гемопоэтических маркеров, таких как CD34 остается нерешенной в это время. Недавно ASC антигенные профили, как определено с помощью проточной цитометрии, были использованы для выбора для конкретного SubPopзаселенностей 10-12 в надежде получить ИСС с расширенными возможностями дифференцировки.
В качестве наиболее популярных средств проверки, в пробирке индукции населения ASC, используя определенные условия культивирования результаты в их дифференциации в мезодермальных, эктодермальных и энтодермальных линий (см. обзор 4) (рис. 2). В то время как в пробирке три-зародыш слой потенциал привело к использованию ИСС для широкого спектра регенеративных модельных систем, дифференцировки в остеогенных, адипогенной и хондрогенные клетки обычно достаточно, чтобы идентифицировать ASC и подтвердить свое мультипотентность. В наших руках, адипогенной дифференциация ИСС результатов в клетках, содержащих яркие липидов вакуоли это пятно с помощью масла Red O 5. Остеогенные результаты дифференциации в щелочной фосфатазы-позитивных клеток и накопление внеклеточного минерал, который окрашивает использованием фосфата кальция фон Косса Stain 5.Хондрогенной дифференциация в условиях высокой плотности Micromass производит гранулы, которые содержат сульфатированные протеогликаны (обнаруженные с помощью Альциановый синевы) и выразить коллагена типа 2 5. Оба скелетных мышц и дифференциации гладких мышц можно увидеть ИСС окрашивание скелетных мышц и миозина MyoD1 и актина гладкой мышцы 5, 13, 14. Дифференциация в эктодермального линии предлагается через предположении нейронов, как морфологии по индуцированных ИСС и выражения многочисленных нервных маркеров, в том числе и NeuN, нейронов транскрипционного фактора 5. Наконец, индукция ИСС по направлению к печени / эндодермального линии на основе установленных условий 15 результатов в клетках, что выражение альфа-фетопротеин, известный маркер гепатоцитов печени. Эти маркеры, вместе с многочисленными другими опубликованных за последние 10 лет наводит на мысль, что ASC является плюрипотентных населения стволовых клеток, которые могут быть легко поддерживать ираспространяется в пробирке и индуцированных к клеткам трех эмбриональных зародышевых линий. В сочетании с их регенераторных способностей в естественных условиях (см. обзор 4), ASC может быть мощным дополнением к инструментам регенеративного научный или врача.
Рисунок 1. Руководство, ферментативная изоляция человека ИСС из образцов липоаспирата. А. Получение для изоляции: перед выделением следующие компоненты должны быть подготовлены: 1) 1X PBS (без кальция или магния), стерилизуют в автоклаве с помощью, 2) раствор 0.075-0.1% коллагеназы типа IA, приготовленного в 1 × PBS и стерилизованного фильтрацией с помощью фильтра блок 0,22 мкм, 3) Контроль Средний (CM) для последующей культуры населения ASC. Б. Выделение ASCs: шаг за шагом руководство для изоляции стромальных сосудистой фракции (SVF) от lipoaspirates показано. Шаги включают промывку липоаспирата стерильной 1x PBS, пищеварение, используя тип коллагеназы IA, сбор СФДВ путем центрифугирования и фильтрации SVF. Последующее культивирование СФДВ приведет к прикрепленной населения фибробластов, содержащей население ASC. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 2. Multi-линия дифференциации потенциал клейкого населения ASC. Искусственный SVF клетки привести в относительно однородной популяции прикрепленных, фибробластов ИСС. Индукционная населения ASC при определенных условиях приводит к клеткам Adipogenic, остеогенные, хондрогенной, скелетной миогенных и гладких миогенных линий.Кроме того, ИСС также могут быть дифференцированы в клетки эктодермы линии, экспрессирующие Neun, маркера нейронов и альфа-фетопротеин (АФП) установлено маркер из эндодермы / печеночной линии клеток. Некоторые гистологии и иммунофлуоресцентные изображения взяты из ранее опубликованных результатов 1,5,6,7,8,9. Дифференциация линия, вместе с гистологическим, immunohistologic или флуоресцентным красителем показано. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
| Профиль Выражение | ||
| положительное выражение | отрицательное выражение | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, СD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62E, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| предложил фенотип ИСС (Общий между двумя или более исследований) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| спорные маркеры в ИСС (Дифференциальные результаты на нескольких исследований) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| стромальных сеLL маркеры | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| гемопоэтические маркеры | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| маркеры общего между 2 или более исследованиях выделены жирным шрифтом SMA = актин гладких мышц HLA = человеческий лейкоцитарный антиген ABCG2 = транспортного белка G2 с множественной лекарственной | ||
Таблица 1. Выражение клеточной поверхности профили человека ИСС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Жировая ткань для выделения ИСС может прийти во многих формах: от цельных кусков ткани, полученных с помощью резекции или липосакции на более мелкие куски, полученных с помощью либо извлечения шприца или всасывания при содействии липосакции (т.е. липосакции). Если больше СФДВ клетки (и тем самым ИСС) может быть получено из резекции или отсасывали образцов жировой неясно, как конфликтующие исследования были представлены 16, 17. Вполне возможно, что либо форма жировой ткани больше подходит для изоляции СФДВ клеток и ИСС тех пор, пока оператор специалистами в технике их изоляции. Тем не менее, липосакция действительно держит преимущество перед резекции в том, что это менее инвазивных и требует значительно меньше послеоперационный уход. В то время как виды липосакции увеличились за последнее десятилетие, в том числе методов, таких как УЗИ-помощь, усилителем и лазерная липосакция 18, наиболее распространенным остается припухшие липосакция,, в котором жировая отсек наводнен большим количеством стерильного физиологического раствора, анестетиков и сосудосуживающих ранее стремлению 19. Выбор метода может варьироваться от хирурга, чтобы хирург. Тем не менее, в то время как средства извлечения может показаться неважным для исследователя, важно понимать, что техника может иметь влияние на числа ASC и жизнеспособности. Например, увеличение липосакция давление вакуума может негативно сказаться на SVF выхода клеток 20. Кроме того, уменьшается в ASC распространения были измерены при ультразвуковой липосакции 17.
Однако получается, аспирации должны быть обработаны быстро, как температура хранения может повлиять SVF жизнеспособность и в конечном итоге выход ASC. Исследования Matsumoto и соавт. Показали, что выход ASC уменьшается, если аспирации хранится при комнатной температуре в течение более 24 ч. 21. Если необходимо, 24-часовой хранение при 4 ° С может быть использован без вредного влиянияс на биологических свойств населения ASC, но, опять же, жизнеспособность клеток может уменьшаться, если на этот раз хранения увеличивается за этой точкой. Легкость обработки липоаспирата напрямую связано с его общего объема. Меньшие объемы, полученные с помощью экстракции шприца, могут быть сравнительно легко обрабатывать. Тем не менее, крупные аспираты громкости, полученные с помощью липосакции, можно представить физические проблемы. Например, то, как простой передачи жир с аспирационной контейнера так, что он может быть промыт может создавать проблемы, когда объем аспирации является большим. Протокол описано в этой статье подразумевается, чтобы облегчить некоторые из этих проблем.
По большому счету, изоляция ASC популяций lipoaspirates с использованием метода ферментативного описанной в этой статье существенно не изменилась за последние 10 лет. Есть многочисленные протоколы, доступные через PubMed, которые являются отличным в их описании изоляции ИСС от lipoaspirates. Мост из них наметить очень похожий протокол с незначительными изменениями. В принципе, липоаспирата промывают от загрязнений, переваривается ферментами выпустить SVF и SVF, содержащий население ASC, собираются с помощью центрифугирования. Большинство крупных lipoaspirates объем прибыть в некотором типе вакуумном контейнере - конфигурация, которая может варьироваться от хирурга, чтобы хирург. Этот протокол рекомендует удаление аспирата в большой, стерильный стакан перед стиркой, поскольку сам контейнер может быть источником загрязнения, если не надлежащим образом очищены до размещения в капюшоне биобезопасности. После передачи и дают отстояться под действием силы тяжести, аспирации будет разделиться на три слоя: лучших, масло слоя, который следует из лизиса зрелые адипоциты, среднего жирового слоя и нижнего слоя раствора и загрязнения красных кровяных телец. Масляный слой должен быть удален, как мы заметили, что это может быть токсичен для полученных культур клеток (неопубликованные данные). Также в этом протоCol рекомендует нижний слой из раствора и эритроцитов будет удалена перед первым мытьем в того, чтобы уменьшить потенциальное количество загрязняющих эритроцитов после того, как ИСС культивируют. Однако исследование, Фрэнсис и соавт. Предположил, что это нижний слой также может быть источником ИСС 22. Использование 10 мл серологические пипетки делает удаление этого нижний слой относительно легко. Остается жировой слой, который затем может быть легко мыть с использованием стерильной PBS, или, если желательно, стерильный PBS с добавлением антибиотиков и противогрибковое чтобы уменьшить вероятность загрязнения 23-25. После промывания, жировую ткань ферментативно гидролизовали с помощью стерильного раствора коллагеназы типа IA. Использование фильтрующей установки, такие как Millipore блока, показанного в этом видео сочетает в себе удобные средства асептически фильтруют коллагеназы в закрытом контейнере в котором жировая ткань промывали могут быть добавлены для последующей водной ванны пищеварения при 37 ° С
Тип коллагеназы используется колебалась от группы к группе с типом коллагеназы И.А. казалось бы более распространенным 1, 24, 25. Тем не менее, существует более 11 различных типов коллагеназы, имеющиеся в продаже, каждая с пищеварением аффинностью к определенным тканям. Для переваривания жировой ткани, такие компании, как Sigma Aldrich рекомендуем коллагеназы типов I и II и оба типа широко представлены в современном литературе 1, 24-27. В своей первоначальной статье, Жук и соавт. Использовать тип коллагеназы IA, полученного из бычьих источников в концентрации 0,075% 1. Тем не менее, большинство коммерческих источников типа коллагеназы IA теперь получается из анаэробных бактерий Clostridium histolyticum или E. палочка генетически модифицированные с С. histolyticum гены. Многие компании предлагают многочисленные препараты типа коллагеназы IA, из нефти для тех, подготовлен на основе сульфата аммония осадков.Протокол описано в этой статье Юпитер использует сырой подготовку типа И.А. коллагеназы, что содержит не только коллагеназы деятельности, но и неспецифическую протеазы, клострипан и триптических ферментативной активности. В то время как эти дополнительные ферменты имеют решающее значение для эффективности пищеварения 28, есть те, которые сообщают много изменчивости партии связаны с типом сырой коллагеназы IA 28, 29 и увеличить свои концентраций коллагеназы до 0,2%, чтобы получить эффективное пищеварение 23. Эти группы, использующие тип сырой коллагеназы IA также рекомендовать его добавки с бычьим сывороточным альбумином (0,1-1,0% BSA), чтобы улучшить производительность фермента и повышения стабильности клеток в жировой матрицы. Однако, это может и не понадобиться, так как протокол описано в этой статье использует коллагеназы без добавок, без негативного влияния на эффективность пищеварения.
Для желающих использовать более определенную коллагеназы компониров, коммерческие источники, содержащие высокоочищенного коллагеназы вместе с точным сочетанием протеаз теперь доступны. Эти препараты очистить клостридий коллагеназы типов я и II к высокой активности и объединить их с известными нейтральных деятельности протеазы, такими как диспазы и термолизина. Эффективное жировой пищеварение с помощью коллагеназы и термолизин была сообщает Захар и др.. 27. В соответствии с этой работы, Pilgaard др.. 30 также сообщают отличную эффективность пищеварения, используя несколько смесей коллагеназы и термолизина. Тем не менее, они наблюдать большую эффективность пищеварения, используя препараты коллагеназы и диспазы.
Раз пищеварения для выделения клеток из жировой ткани может варьироваться от исследования к исследованию. Многие опубликованные протоколы рекомендуем пищеварения времена 1-2 часов 27, 30. Тем не менее, важно понимать, что чрезмерное раз пищеварения в конечном итоге может повлиять на количество жизнеспособных ASCs и их фенотип стволовых клеток. Pilgaard и его коллеги установили, что 2 часа пищеварение при 37 ° С дает наилучший баланс между ткани диссоциации и ASC функциональности 30, с захар и соавт. Рекомендовав пищеварение, мимо 45 мин, будет отмечаться каждый 15 мин до 2 ч максимум, с пищеварением останавливают после того, как жировая ткань приобретает более однородной появления 27. Мы согласны с этой рекомендацией. Тем не менее, это наш опыт, что большинство типа коллагеназы IA препараты при 0.075-0.1% способны переваривать большие объемы lipoaspirates в 30-45 мин и что эти времена являются адекватными, чтобы освободить достаточное количество клеток. Таким образом, этот протокол рекомендует время переваривания 30 мин. Если требуется больше времени, консистенция липоаспирата должны контролироваться и пищеварение прекращается, когда липоаспирата предполагает "сливочный" или "жидкий" внешний вид (рис. 1).
После йэ пищеварение будет завершена, изоляция, опубликованном SVF просто осуществляется с помощью центрифугирования. Однако, как и давление аспирации, физические эффекты центрифугирования может иметь влияние на SVF жизнеспособности и количества ИСС, доступных для культуры. Исследование Курита и его коллеги 31 показал, что скорости, превышающие 3000 мкг может повредить ASC. Тем не менее, скорость должна быть достаточно значительным, чтобы обеспечить адекватное гранулирования СФДВ. Как правило, большинство протоколов, в том числе этот, рекомендуем скорость центрифугирования 1200-1500 х г. Следует проявлять осторожность, исследователем, чтобы убедиться, что они понимают связь между центробежной силы (измеряется в г) и скоростях центрифугирования (измеренных как оборотов в минуту), а отношения зависит от конкретного ротора центрифуги. Однако, как правило, более низкие центробежные силы, такие как 1200 мкг, часто эквивалентна скорости центрифугирования и может безопасно использоваться взаимозаменяемо.
После спиннинг, несколько диstinct слои наблюдаются в центрифуге трубки (рис. 1): верхний слой масла и «пушистых" белых адипоцитов, среднего коллагеназы слоя и клеточного осадка. Сам гранул может иметь две различные слои: верхний слой эритроцитов и нижний белый СФДВ гранул, содержащая ИСС. Этот протокол рекомендует тщательное стремление нефти и адипоциты, как масло может быть токсичными для культуры клеток и адипоциты, как было показано, способны дедифференциации обратно к более простого типа клеток 32. Однако эти адипоциты могут быть собраны на этом этапе, если это желательно. Из-за этих загрязнителей, этот протокол рекомендует дополнительный шаг стиральная обеспечить им необходимый удаление. Этот шаг также позволяет исследователю объединить несколько SVF гранулы для последующего облегчения фильтрации. Фильтрование, вероятно, будет необходимо из-за наличия больших кусков материала фиброзной и клеточных агрегатов следующих пищеварения. Эти материалы легко удаленочерез простой фильтрации тяжести основе через 70 или 100 сетчатых фильтров мкм. Аликвоту фильтрата могут быть приняты для того, чтобы подсчитать количество ядерных клеток при желании, а оставшиеся фильтрата покрытие для ASC приверженности и расширения.
Несмотря добросовестных попытках удалить столько эритроциты, насколько это возможно, никакой подготовки ASC не будет полностью без загрязнения РБК. В нашей оригинальной статьи, мы предложили удаление этих эритроцитов через ресуспендированием крупинки в гипотонического раствора 160 мМ NH 4 Cl. Большинство последующих изоляции статей содержат этот шаг и рекомендуем использовать Cl-решений на базе NH 4 или стерильной водой 22-24, 27, 33, хотя необходимо позаботиться при использовании стерильную воду, чтобы минимизировать время СФДВ клетки подвергаются к гипотонического раствора 27. Однако этот шаг может быть не необходимым, поскольку эритроциты не соблюдают популяция клеток и могут быть легко удалены после ночного культурыASC населения. Более того, в то время как неофициальные, в лучшем случае, эти эритроциты появляются улучшить первоначальный расширение полученных прилипшие клетки (Жук, неопубликованные данные). Таким образом, этот протокол исключает лизиса эритроцитов и шаг предполагает, что начальные культуры ASC допускать расширения в присутствии этих эритроцитов в течение первых 3-4 дней без смены питательной среды. Причина этого наблюдения может быть связано с некоторым типом паракринного сигналов от загрязняющих клетки крови или может быть просто за счет лучшей жизнеспособности с исключению стадии лизиса эритроцитов. После этого культуральную среду могут быть отсасывали и большинство эритроцитов осторожно удаляют промыванием в стерильной пластины 1х PBS. Со временем, все оставшиеся эритроциты в конечном счете умрет и быть удалены из культуры.
Исследования захар и Boquest подсчитали, что 25-50% от ресуспендированного SVF гранул придерживается культуре ткани пластик 23, 27. В результате "проход 0" ASC у.е.ltures неоднородны, состоят из маленьких, круглых клеток, которые считаются ИСС и более неправильной формы клетки предложенные быть эндотелия в происхождении. В то время как исследования, проведенные многими группами, включая наших подтвердили отсутствие загрязнения типы клеток, такие как ГМК, гемопоэтических клеток и фибробластов в ASC культур 1, наличие дополнительных типов клеток не может быть исключена. . Действительно, Tallone др. охарактеризовал проход 0 культур и наблюдается четыре различных группы населения: 1) небольшая, круглые, быстро возобновляют клетки, 2) веретенообразные фибробластические клетки считается ASC, 3) медленно репликации большого клетки с более ограничены потенциальные (т.е. преадипоцитов) и 4) кубовидные эндотелиальные клетки, которые теряются с течением 34. Последующие исследования показали, что круглый, быстро обновляя популяция клеток обладает самой высокой multipotentiality и выразить характерные маркеры стволовых клеток 35, 36. Более того, они могут образовывать "сфероидов" из-заих быстрое распространение и часто окружены веретенообразных фибробластов. Таким образом, вполне возможно, что шпиндель образный ASC население предложено выше, может происходить из этих клеток. После первоначального расширения этих проход 0 ASC культур, считается, что продолжение культивирования в течение долгого времени выбирает для ASC, полученные с культурами допущения более фибробластов, гомогенной композиции. Однако, остатки загрязняющих клеток не могут быть полностью исключены, и, следовательно, население ASC еще следует рассматривать гетерогенными.
В то время как протокол, описанный в этой статье, просто, недорого и не требует никаких единиц оборудования обычно не встречаются в учреждении культуры ткани, у него есть недостаток, что требует такого объекта. Многочисленные исследования исследовали трансляционные применения ИСС через животных моделях и клинические исследования с использованием ASC начали появляться (см. обзор 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы этой рукописи соавторы на патент принадлежащих регентов Калифорнийского университета и лицензию на Cytori Therapeutics.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность и поблагодарить тех дополнительных научных кадров, которые способствовали развитию описанного протокола и его изоляции ИСС, в том числе: д-р Х. Петер Лоренц, доктор медицинских наук, доктор Хироши Muzuno, доктор медицинских наук, доктор Джерри Хуанг, MD , д-р Адам Кац, доктор медицинских наук, доктор Уильям Футрелл, доктор медицинских наук, доктор Жун Чжан, доктор стоматологии, кандидат наук, доктор Лариса Родригес, доктор медицинских наук, доктор Зени Альфонсо, доктор философии, и д-р Джон Фрейзер, кандидат наук. Результаты, представленные финансировались, в частности, путем исследовательских грантов от Национального института здоровья, в том числе NIAMS и NIDCR институтов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
References
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M.
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
