Summary
Nel 2001, i ricercatori della UCLA hanno descritto l'isolamento di una popolazione di cellule staminali adulte, chiamate cellule o ASC staminali derivate da tessuto adiposo, dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive l'isolamento di ASC da lipoaspirato utilizzando un protocollo digestione enzimatica manuale mediante collagenasi.
Abstract
Nel 2001, i ricercatori della University of California, Los Angeles, ha descritto l'isolamento di una nuova popolazione di cellule staminali adulte dal tessuto adiposo liposuzione che inizialmente chiamati celle lipoaspirato trasformati o cellule PLA. Da allora, queste cellule staminali sono stati rinominati in cellule staminali derivate da tessuto adiposo o ASC e sono andati a diventare uno dei più popolari popolazioni di cellule staminali adulte nel campo della ricerca sulle cellule staminali e la medicina rigenerativa. Migliaia di articoli ora descrivono l'uso di ASC in una varietà di modelli animali di rigenerazione, compreso rigenerazione ossea, la riparazione dei nervi periferici e ingegneria cardiovascolare. Articoli recenti hanno cominciato a descrivere la miriade di usi per ASC nella clinica. Il protocollo illustrato in questo articolo è descritta la procedura di base per mano e enzimaticamente isolare ASC da grandi quantità di lipoaspirato ottenuti da procedure cosmetiche. Questo protocollo può essere facilmente scalato verso l'alto o verso il basso per alloggiomangiato il volume di lipoaspirato e può essere adattato per isolare ASC dal tessuto grasso ottenuti attraverso abdominoplasties e in altri procedimenti analoghi.
Introduction
Nel 2001, una popolazione putativo di cellule staminali multipotenti dal tessuto adiposo è stato descritto nella Tissue Engineering 1 rivista. Queste cellule sono stati dati i nomi trasformati lipoaspirato o PLA cellule a causa della loro derivazione dal tessuto lipoaspirato trasformati ottenuti attraverso la chirurgia estetica. Il metodo di isolamento descritto in questo articolo è stato basato sulle strategie enzimatiche esistenti per l'isolamento della frazione stromale vascolare (SVF) dal tessuto adiposo 2. Il SVF è stata definita come una popolazione minimamente trasformati dei globuli rossi, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti e pre-adipociti che devono ancora aderire ad una cultura substrato tessuto 2, 3. Coltura di questa SVF nel tempo si propone di eliminare molte di queste popolazioni cellulari contaminanti e provocare un aderente, popolazione fibroblastica. Questi fibroblasti sono stati identificati in letteratura per gli ultimi 40 anni ad essere pre-adipociti. Tuttavia, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che queste cellule possedevano mesodermal multipotency e rinominato la popolazione SVF aderenti come cellule PLA. Studi successivi da numerosi altri gruppi di ricerca hanno aggiunto a questo potenziale, proponendo sia endodermico e potenziali ectodermica (per la recensione vedi 4). Da allora, numerosi termini supplementari per queste cellule sono apparsi in letteratura. Al fine di fornire un certo tipo di consenso, il termine di cellule staminali derivate da tessuto adiposo o ASC è stata adottata in occasione della conferenza annuale nd IFATS 2. Come tale, il termine ASC verrà utilizzato in questo articolo.
Il protocollo descritto in questo articolo è una procedura relativamente semplice che richiede attrezzature di laboratorio standard e utilizza reagenti semplici come soluzione salina fosfo-buffered, reagenti mezzi di coltura dei tessuti standard e collagenasi. Si può produrre un gran numero di ASC seconda della quantità di volume del tessuto adiposo di partenza e successiva ctempo ulture. Tuttavia, il trattamento di una tale quantità di tessuto adiposo può presentare alcuni problemi fisici che possono essere attenuato utilizzando questo protocollo. Inoltre, questo protocollo richiede tessuti sterili strutture di coltura e le cappe di biosicurezza approvati, richiedano quindi l'uso di un impianto di coltura tissutale approvato. Questo requisito può anche diminuire l'utilità della popolazione ASC in applicazioni cliniche meno che non siano isolati in buone pratiche di fabbricazione (GMP strutture) approvati progettati per l'isolamento e l'espansione di materiali per uso clinico. In alternativa, sistemi automatizzati in grado di isolare ASC in un sistema chiuso in sala operatoria sarebbe evitare questo problema fondamentale e consentire l'utilizzo immediato di ASC, senza necessità di successiva espansione in vitro. Ad oggi, ci sono sei sistemi automatizzati che sono disponibili in commercio per l'isolamento di cellule da tessuto umano. Questi sistemi possono consentire di isolare unnumero significativo di ASC di grandi quantità di tessuto adiposo subito dopo il suo raccolto. Questi ASC potrebbero poi essere reintrodotti nel paziente per una varietà di scopi rigenerativi, senza che il paziente dover mai lasciare la sala operatoria. In aggiunta a questo protocollo descrive l'isolamento manuale di ASC, un protocollo per l'isolamento automatizzato di ASC utilizzando il sistema Celution è data anche in un altro articolo.
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Protocol
Il protocollo qui illustrato descrive l'isolamento manuale di ASC da lipoaspirato ottenuti attraverso procedure cosmetiche usando digestione enzimatica e centrifugazione differenziale. Questo protocollo è stato pubblicato sulla rivista Tissue Engineering nel 2001 1, in cui le cellule risultanti sono stati chiamati celle lipoaspirato trasformati o cellule PLA a causa del loro isolamento da lipoaspirato. Tuttavia, la cella PLA termine è stata sostituita con le derivate da tessuto adiposo Cellule o ASC per dare al settore una sorta di conformità in termini di nomenclatura staminali termine. Le cellule isolate tramite questo protocollo è stato dimostrato da molti disporre di un potenziale mesodermica sia in vitro che in vivo (per recensione vedi 4). Inoltre, i ectodermiche e endodermico potenzialità della ASC sono anche state esplorate 4. La tecnica di isolamento è semplice e lineare e richiede circa un'ora per completare. La cella risultantes sono coltivate in condizioni di coltura tissutale standard. Con il tempo cultura, la popolazione ASC diventa più omogenea, composta da cellule fibroblastiche che si espandono facilmente e mostrano buona vitalità nel lungo termine in coltura.
Nota: I seguenti pezzi di equipaggiamento che sono richiesti sono elencati alla fine di questo articolo. Tutti cristalleria, i media ei reagenti devono essere sterilizzati con autoclave o filtrati attraverso 0.22 micron filtri. Asettiche tessuto tecniche di coltura devono essere seguite in ogni momento. A tal fine, tutti i materiali inseriti nel quadro di biosicurezza devono essere sterilizzati bagnandoli con una soluzione di etanolo al 70% e pulire con tovaglioli di carta puliti.
1. Prima di Harvest, preparare i seguenti:
- Sterile 1X fosfo-buffered saline (PBS) per il lavaggio delle lipoaspirato. Preparare circa 1 l di 1x PBS per ogni 100 ml di lipoaspirato. Sterilizzare il PBS e tuttiome raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. Come opzione, antibiotico / antimicotico può essere aggiunto ad una concentrazione finale di 100 UI / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina e 2,50 ug / ml di amfotericina B una volta che il PBS è raffreddato.
- Sterile 0,075-,1% collagenasi di tipo IA (da Clostridium histolyticum) per la digestione enzimatica della lipoaspirazione. Concentrazione dipenderà dalla qualità e sorgente della collagenasi - cioè vs grezzo purificato. Altri tipi collagenasi possono essere utilizzati (tipo ad esempio collagenasi II o IV) a concentrazioni simili. Preparare in PBS 1x e filtro sterile utilizzando un sistema di filtrazione 1.000 ml con un filtro da 0,22 micron (Figura 1A). Tuttavia, possono essere utilizzati anche bottiglie di vetro sterile dotato di un filtro superiore della bottiglia. Preparare e utilizzare a temperatura ambiente. Le soluzioni Collagenase possono essere conservati per il breve termine a 4 ° C fino al momento dell'uso. Non congelare la soluzione di collagenasi in quanto può diminuire la sua attività.
- Sterile controllo Medium (CM) per collagenasi inattivazione e coltura della popolazione ASC. Per 500 ml di CM, combinare il seguente: 500 ml di DMEM (4,5 g / L di glucosio, con L-glutammina), 50 ml di siero fetale bovino (inattivato con il calore), 5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI penicillina, 10.000 g / ml la streptomicina). Come opzione, può anche essere aggiunto 5 ml di amfotericina B (250 mg / ml di amfotericina B). È necessaria la filtrazione sterile di questo mezzo se si utilizzano reagenti non sterili. Posizionare il CM a 37 ° C in bagno d'acqua 30 minuti prima dell'uso per riscaldare il mezzo.
- Cristalleria Sterile e plasticware per l'isolamento. Autoclave un bicchiere di vetro 1000 ml e lasciar raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. Inoltre, hanno la seguente Plasticware pronto: pipette sierologiche asettico (5 ml, 10 ml e 25 ml), 50 ml provette da centrifuga, e la coltura di tessuti trattati cultura piatti.
2. Isolamento di ASC da Lipoaspirates
La maggior parte lipoaspirato sono raccolti in un contenitore di aspirazione (vedere Figura 1B) e possono essere costituiti da tre strati distinti: 1) uno strato superiore di olio a causa della lisi degli adipociti maturi, 2) uno strato intermedio di tessuto adiposo, e 3) una fondo, liquido sottonatante contenente soluzione salina e contaminando tipi di cellule come i globuli rossi (RBC). Lo strato superiore dell'olio potrebbe non essere presente in quantità significative. Se presente, deve essere aspirato come contaminazione dell'olio della cultura ASC risultante potrebbe influenzare la vitalità della cultura. Il sottonatante fondo deve essere rimosso prima del trattamento per minimizzare la contaminazione delle culture ASC con globuli rossi. Questo lascerà mezzo, strato di tessuto adiposo, che verrà poi lavato e digerito enzimaticamente per liberare suo cellulare, frazione stromale vascolare (SVF).
- Lavare il lipoaspirato: Aprire il contenitore lipoaspirato nella cultura del tessuto hood e decantare con attenzione il lipoaspirato in un bicchiere di vetro da 1 L sterile. Lasciare che gli strati lipoaspirato per separare fino strato di tessuto adiposo è ben separata (Figura 1B).
- Aspirare lo strato dell'olio (se presente) con un ago sterile, pipetta di vetro e il sottonatante salina fondo utilizzando una pipetta 10 ml sierologica. Questo rimuoverà la grande maggioranza dei contaminanti globuli rossi e soluzione salina.
- Valutare il volume dello strato di tessuto adiposo risultante e aggiungere sterile 1x PBS a un volume uguale. Mescolare l'aspirato con la pipetta utilizzata per l'aspirazione per miscelare il lipoaspirato con PBS. Lasciare i due strati di stabilirsi. Come notato sopra, la 1x PBS può essere completata con antibiotici / antimicotici.
- Aspirare il sottonatante con un 10 ml pipetta sierologica.
- Continuare a lavare la frazione di tessuto adiposo, come indicato dal passo 2.1.2. e 2.1.3. finché lo strato adiposo ha un colore giallo / oro. Th Aspiraree sottonatante un'ultima volta, lasciando la frazione tessuto adiposo nel bicchiere di vetro. Per assicurare un'adeguata rimozione del sottonatante, permettono agli strati lipoaspirato di stabilirsi per 5 min dopo l'ultimo lavaggio prima e l'aspirazione finale.
- Digestione enzimatica del lipoaspirato: Preparare una soluzione di collagenasi 1A sterile come sopra in un'unità di filtraggio. Preparare un volume pari a quello della frazione adiposo e filtro sterile.
- Dopo filtraggio della soluzione di collagenasi, scartare l'unità filtro superiore, attenzione versare la frazione adiposo lavati in soluzione di collagenasi e chiudere ermeticamente la bottiglia.
- Posizionare la miscela collagenasi / adiposo in un bagno d'acqua a 37 ° e digerire a 37 ° C per 30 min. Agitare delicatamente la miscela collagenasi / adiposo ogni 5-10 minuti e mettere di nuovo in bagno d'acqua. Lo strato di tessuto adiposo dovrebbe assumere un aspetto "liscia" (Figure 1B), in quanto i proventi digestione. Ulteriori tempi di digestione (cioè fino a 2 ore) possono essere usate se il livello di tessuto adiposo appare ancora avere pezzi solidi di grasso all'interno di esso.
- Isolamento di ASC: Inserire la miscela collagenasi / adiposo digerito indietro nel cabinet biosicurezza. Assicurati di sterilizzare l'unità filtro con il 70% di etanolo prima di rimettere nell'armadio.
- Pipettare 25 ml della sottonatante contenente la SVF in provette da 50 ml per centrifuga sterili.
- Aggiungere 25 ml di CM ad ogni provetta. Lasciare il CM per inattivare la collagenasi incubando a temperatura ambiente nell'armadietto per 5 min.
- Centrifugare per 10 min a 1200 xg per raccogliere la SVF come pellet.
- Nel gabinetto biosicurezza, aspirare il surnatante da ogni provetta. Assicurarsi che lo strato di olio superiore e qualsiasi adipociti galleggianti vengono aspirati con questa surnatante (
- Unire i pellet SVF in una provetta da centrifuga con 30 ml CM e dividere equamente su due nuovi tubi centrifuga da 50 ml. Centrifugare come al punto 2.3.3. e aspirare il surnatante dai due pellet SVF (non mostrati in figura).
OPTIONAL: Se lisi è desiderato, risospendere ogni pellet SVF in 10 ml di un tampone di lisi (160 mM NH 4 Cl) e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare come al punto 2.3.3. e aspirare il surnatante per produrre pellet SVF (non mostrati in figura).- Unire le due palline SVF in una nuova provetta da centrifuga con 5-10 ml CM (Figura 1B).
- Per filtrare le particelle più grandi di tessuto, dispensare il pellet risospeso SVF su un filtro a rete 100 micron posto sulla sommità di una nuova provetta da centrifuga da 50 ml e lasciar filtrare dal flusso di gravità.
- Aliquote pipette di risospeso(E filtrata) pellet SVF contenente le ASC sul tessuto-coltura trattati piatti della cultura. Supplemento ogni piatto con un volume adeguato di CM.
- Coltivare le cellule in CM per 3-4 giorni a 37 ° C, 5% CO 2 senza cambiamento di media.
- Unire i pellet SVF in una provetta da centrifuga con 30 ml CM e dividere equamente su due nuovi tubi centrifuga da 50 ml. Centrifugare come al punto 2.3.3. e aspirare il surnatante dai due pellet SVF (non mostrati in figura).
Dopo questo periodo coltura iniziale, il mezzo di coltura può essere aspirato e eventuali contaminanti globuli rossi delicatamente rimosso mediante lavaggio con 1XPBS sterili. Sostituire con CM e continuare a cultura ASC come necessario. Il tipo di tessuto piatto di coltura utilizzato e il pellet risospeso SVF è diviso tra questi piatti dipenderà dal numero di cellule desiderate seguente coltura tissutale convenzionale.
3. Caratterizzazione del ASC Popolazione: Citometria a flusso e multilineare Differenziazione
Una volta isolato, la caratterizzazione della popolazione ASC deve essere eseguita. Approcci convenzionali per questo includono flusso cytometria di caratterizzare il profilo antigene CD superficie cellulare delle cellule e nella differenziazione vitro per confermare la loro capacità di differenziazione multilineare. Mentre molteplici linee possono essere valutati in ASC, questo protocollo delinea la differenziazione delle ASC in cellule del adipogenico, osteogenico e linee condrogenici come mezzo di conferma multilineage potenziali mesodermici 5.
In vitro multi-lignaggio differenziazione di ASC
- La differenziazione osteogenica di ASC: Prima di induzione, preparare Osteogenica Media (OM) come segue: per una bottiglia da 500 ml di DMEM (4.5 g / ml di glucosio) aggiungere 25,0 ml di FBS (concentrazione finale 5,0%) e 5,0 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml e 10.000 mg / ml concentrazioni finali, rispettivamente). Per questo, aggiungere i seguenti agenti di induzione osteogenici per dare le concentrazioni finali indicate: desametasone (0,1 micron finale), L-acido ascorbico 2-fosfato (50,0 micron finali) E β-glicerofosfato (10.0 mM finale).
- Prima di induzione, raccolta e piastra ASC coltivate nel piatto di coltura di tessuti desiderata, in modo da ottenere una confluenza di circa il 50%. Per ogni piatto sperimentale placcato, piatto un piatto aggiuntivo per un controllo non-indotta. Cultura pernottamento in CM.
Nota: 50% di confluenza è raccomandato per consentire continua proliferazione che possono verificarsi nel corso dell'induzione - Il giorno di induzione, rimuovere il supporto e aggiungere la seguente: OM ai osteogeniche pozzi sperimentali desiderati e CM ai pozzetti di controllo. Il volume di materiale utilizzato dipenderà dalla dimensione del piatto di coltura tissutale. Per 12 piatti così, 1,0 ml di mezzi per pozzetto è sufficiente. Per 6 piatti e, ml 2,0 di media per pozzetto è sufficiente. Per 100 piatti mm, devono essere usati 10,0 ml di supporti per piastra.
- Cultura le cellule per un minimo di 14 giorni con i cambiamenti del mezzo adeguato ogni 3-4giorni. Popolazioni ASC Altamente osteogenici possono mostrare segni di extracellulare deposizione minerale più presto sette giorni induzione.
- Differenziazione osteogenica (cioè deposizione minerale extracellulare) può essere confermata utilizzando una colorazione istologica von Kossa di fosfato di calcio. Questa macchia produrrà un precipitato marrone-nero identificare la presenza di fosfato di calcio extracellulare (vedere Figura 2).
Per macchiare con von Kossa reagente:- Rimuovere la OM dalle cellule sperimentali e la CM dalle cellule di controllo
- Fissare le cellule per 60 min a 4,0% paraformaldeide preparato in 1x PBS.
- Lavare le cellule due volte con PBS 1x.
- Incubare le cellule con nitrato d'argento 2,0% (preparato in acqua) al buio per 30 min.
- Rimuovere il nitrato d'argento, lavare due volte con acqua distillata e asciugare le cellule.
- Esporre le cellule a luce UV per 60 min a sviluppare il calcico precipitato di fosfato.
- Lavare le cellule più volte con 1XPBS.
- Controcolorare la cella con ematossilina, se lo desideri.
- Prima di induzione, raccolta e piastra ASC coltivate nel piatto di coltura di tessuti desiderata, in modo da ottenere una confluenza di circa il 50%. Per ogni piatto sperimentale placcato, piatto un piatto aggiuntivo per un controllo non-indotta. Cultura pernottamento in CM.
- Differenziazione adipogenico di ASC: Prima di induzione, preparare adipogenico Medium (AM) come segue: Per una bottiglia da 500 ml di DMEM (4,5 g / ml glucosio) aggiungere 50,0 ml di FBS (concentrazione finale 10,0%) e 5,0 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml e 10.000 pg / ml concentrazioni finali, rispettivamente). Per questo, aggiungere i seguenti agenti di induzione adipogenico per dare le concentrazioni finali indicate: desametasone (1.0 mM finale), 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX - 0,5 mm finali), indometacina (0,2 mm finali) e insulina (10,0 micron finale ).
- Prima di induzione, raccolta e piastra ASC coltivate nel piatto di coltura di tessuti desiderata, in modo da ottenere una confluenza di circa il 80%. Per ogni piatto sperimentale placcato, piastra un'aggiuntaal piatto per un controllo non-indotta. . Cultura pernottamento in CM Nota: differenziazione adipogenico di ASC sembra essere più efficiente con una maggiore confluenza.
- Il giorno di induzione, rimuovere il supporto e aggiungere la seguente: AM alle osteogeniche pozzi sperimentali desiderati e CM ai pozzetti di controllo. Il volume di materiale utilizzato dipenderà dalla dimensione del piatto di coltura tissutale. Per 12 piatti e, 1.0.ml di supporti per pozzetto è sufficiente. Per 6 piatti e, ml 2,0 di media per pozzetto è sufficiente. Per 100 piatti mm, devono essere usati 10,0 ml di supporti per piastra.
- Cultura le cellule per un minimo di 14 giorni con variazioni del mezzo appropriato, ogni 3-4 giorni. Popolazioni ASC Altamente adipogenico possono mostrare segni di formazione di vacuoli di lipidi più presto sette giorni induzione.
- ASC fase di differenziazione adipogenico svilupperanno più vacuoli lipidici che possono essere facilmente visualizzabili al microscopio ottico. Inoltre, differenziazione adipogenica puòessere confermati utilizzando un colorante istologico Oil Red O che si accumulano all'interno di questi vacuoli (vedi figura 2).
Per macchiare con Oil Red O:- Rimuovere il supporto dalle cellule sperimentali e di controllo e fissarli per 60 minuti con un fissativo calcio formale del 10%. Per preparare questa fissativo, unire la seguente: acqua 1,0 g di CaCl 2, 25,0 ml 16% paraformaldeide (4,0% finale) e 75,0 ml di acqua distillata.
- Lavare le cellule due volte con PBS 1x.
- Lavare le cellule brevemente con etanolo al 70%.
- Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min con la soluzione Oil Red O. Per preparare la soluzione Oil Red O, sciogliere 2,0 g Oil Red O polvere in 50,0 ml di etanolo al 70% e 50,0 ml di acetone.
- Lavare le cellule con etanolo al 70% e poi con acqua di rubinetto.
- Visualizza le cellule subito dopo colorazione dovuta alla dissolvenza della colorazione nel tempo.
- Differenziazione condrogenico di ASC: differenziazione condrogeniche è ottenuta attraverso una tecnica di coltura ad alta densità denominato "cultura Micromass". Prima di cultura, preparare condrogeniche Media (CHM) come segue: per una bottiglia da 500 ml di DMEM (4.5 g / ml di glucosio) aggiungere 5,0 ml di FBS (concentrazione finale 1%) e 5,0 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml e 10.000 mg / concentrazioni finali ml, rispettivamente). Per questo, aggiungere i seguenti agenti di induzione condrogeniche per dare le concentrazioni finali indicate: L-ascorbico-2-fosfato (50,0 mcg / ml finale), insulina (6,25 mg / ml finale), transferrina (6,25 mg / ml finale) e TGFβ1 (10,0 ng / ml).
- Raccogliere le ASC e centrifugare per 5 min a 1200 xg per far sedimentare le cellule. Contare le cellule per determinare la densità della sospensione cellulare.
- Per preparare i pellets MICROMASS, preparare due sospensioni cellulari: una sospensione sperimentale preparato in ChM ad una densità di 1 x 10 7 cellules / ml e una sospensione bianco preparato in CM ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml.
- Posizionare 10,0 microlitri "goccioline" della sospensione cellulare in singoli pozzetti di un piatto multi-pozzetto. Lasciare aderire per 2-3 ore a 37 ° C.
- Sovrapporre delicatamente le gocce placcate sia con ChM o CM facendo attenzione a non dissociare le cellule.
- Coltivare le cellule per un massimo di 14 giorni in ChM o CM con variazioni in terreno ogni 3-4 giorni. Cellule coltivate in ChM condenserà tutto questo tempo per formare un Micromass pellet ad alta densità con poco o nessun cellule in un monostrato circostante. Cellule di controllo coltivate non subire questa condensazione e molti saranno trovati come un monostrato.
- Per confermare condrogenesi, fissare le palline per 15 min a 4,0% paraformaldeide (preparati in 1x PBS) a temperatura ambiente. Colorare per la presenza di proteoglicani solfati utilizzando una macchia blu istologico alcian.
Per colorare usando Alcian Blu:- Lavare il papellets raformaldehyde fisso una volta in 1x PBS.
- Incubare le pellets in 0,1 N HCl (pH 1,0) per 5 min di abbassare il loro pH.
- Rimuovere l'HCl e aggiungere 1% alcian reagente blu (preparato in 0,1 N HCl, pH 1,0). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il alcian reagente blu e lavare il pellet con 0,1 N HCl (pH 1.0) per rimuovere l'eccesso macchia.
- Lavaggi supplementari con acqua di rubinetto può essere utilizzato per ridurre la colorazione di fondo.
- In alternativa, i pellet MICROMASS possono essere raccolti, fissati durante la notte in 10% formalina, inclusi in paraffina e le sezioni colorate per Alcian blu.
4. Citometria a flusso Caratterizzazione di ASC
Caratterizzazione del profilo antigene CD superficie cellulare può essere realizzata mediante citometria a flusso convenzionale.
- Preparazione di ASC per la citometria a flusso: Priorall'analisi, preparare un Citometria a flusso Buffer (FCB), composto dal seguente: 1,0% BSA, 2,0% FBS e il 0,025% saponina preparato in 1x PBS.
- Raccogliere le ASC e centrifugare le cellule per 5 min a 1200 xg per produrre un pellet.
- Risospendere le cellule in sterile 1XPBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Determinare la densità cellulare della sospensione.
- Dividere la sospensione fino in aliquote di 5 x 10 5 cellule totali e centrifugare a pellet.
- Rimuovere il surnatante PBS e fissare le cellule per 60 minuti a -20 ° C con un eccesso di ghiacciata etanolo al 70%. Se necessario, queste cellule possono essere conservate in questo etanolo al 70% in un congelatore a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Dopo la fissazione, aspirare accuratamente l'etanolo e lavare delicatamente il pellet due volte con un eccesso di FCB. Per lavare:
- Aggiungere un eccesso di FCB e risospendere delicatamente il pellet.
- Centrifugare per 5 minuti a 1200 xg per raccogliere le cellule asa pellet.
- Con attenzione aspirare il surnatante FCB.
- Ripeti.
- Rimuovere la finale di lavaggio FCB surnatante da ciascuna aliquota e risospendere in 100 ml di FCB. Aggiungere l'anticorpo primario fluorocromo coniugato desiderato mediante diluizione consigliata del produttore. Incubare le cellule in ghiaccio con l'anticorpo per 30 min.
Nota: Se gli anticorpi primari fluorocromi coniugati non sono disponibili, possono essere utilizzati anticorpi primari non coniugati. - Per ogni fluorocromo utilizzato (ad esempio FITC, PE), incubare una aliquota di cellule con 100 ml contenente FCB IgG isotipo-abbinato come controllo negativo.
- Incubare un'aliquota di 100 FCB ml contenente anticorpi come un ulteriore controllo.
- Lavare ogni aliquota di cellule due volte con FCB come dettagliato nella fase 4.1.5. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le aliquote in 100 ml di FCB e procedere con l'analisi del flusso.
Nota: Se sono stati usati anticorpi primari non coniugati: Dopo questa fase di lavaggio incubare le aliquote in ghiaccio per 20 min con FCB completato con l'anticorpo secondario coniugato con fluorocromo appropriato utilizzando diluizione consigliata del produttore. Lavare due volte come descritto al punto 4.1.5.
- Analisi dei flussi di ASC: Per l'analisi del flusso, un minimo di 10.000 eventi va conteggiato. Controlli senza macchia e isotipici-abbinato devono essere utilizzati per impostare porte da forward scatter (FSC) e side scatter (SSC). Per questo, i controlli presenti anticorpi (cioè non colorati) del passaggio 4.1.8 dovrebbero essere usati per eliminare detriti e ASC morti. I controlli IgG isotipici corrispondenza del passo 4.1.7. dovrebbero essere utilizzati per stabilire le aree di fluorescenza positiva.
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Representative Results
Lo schema di protocollo di cui sopra descrive un metodo enzimatico manuale per l'isolamento di un SVF da un ampio campione lipoaspirato volume. All'interno di questo SVF sono numerose popolazioni cellulari, tra cui il ASC. Numerosi studi suggeriscono che la coltura di questo SVF in condizioni di coltura di tessuti normali selezionerà per una popolazione fibroblasti aderenti rischia di essere composta principalmente di tipo ASC. Coerentemente con questo, abbiamo dimostrato, mediante citometria a flusso ed immunofluorescenza, che pellet SVF coltivate diventano praticamente priva dei principali tipi di cellule contaminanti, ossia globuli rossi, cellule muscolari lisce e cellule della linea endoteliale 1. La popolazione ASC risultante è relativamente omogenea in aspetto e composto da cellule fibroblasto-simili (Figura 2). Questi ASC aderenti crescono bene in coltura in condizioni di coltura tissutale standard e mostrano una popolazione moderata tempo 1 raddoppio che li rende adatti per numerose b molecolare e cellulareiology studi in vitro e in vivo studi rigenerative. Tuttavia, alla luce della natura eterogenea del isolato SVF, convalida della popolazione ASC è necessario. Numerosi studi hanno utilizzato citometria a flusso, al fine di caratterizzare il profilo antigenico CD di ASC coltivate come un potenziale mezzo di identificazione di queste cellule sia in vitro che in vivo 5-9. Tabella 1 riassume i risultati di molti di questi studi. Mentre l'espressione di alcuni di questi antigeni CD rimane controverso, è generalmente accettato che ASC coltivate sono CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 e CD140a positivo. L'assenza di numerosi antigeni CD ematopoietici, come CD31 e CD45, è coerente con l'origine mesodermica di ASC, sebbene l'espressione di specifici marcatori ematopoietici come CD34 rimane irrisolto in questo momento. Recentemente, profili antigenici ASC, come determinato mediante citometria di flusso, sono stati utilizzati per selezionare per Subpop specificomentari 10-12 nella speranza di produrre ASC con capacità di differenziazione avanzate.
Mentre i mezzi più popolari di convalida, in induzione vitro della popolazione ASC utilizzando definite condizioni di coltura risultati nella loro differenziazione in mesodermiche, ectodermici e endodermici lignaggi (per una rassegna vedi 4) (Figura 2). Mentre in vitro tri-germe potenziale strato ha comportato l'uso di ASC per un'ampia varietà di sistemi modello rigenerativi, differenziazione in osteogenico, adipogenico e cellule condrogeniche è generalmente sufficiente per identificare il ASC e confermare la sua multipotency. Nelle nostre mani, la differenziazione adipogenico di ASC risultati in celle contenenti vacuoli lipidici luminosi che macchia con Oil Red O 5. Risultati differenziazione osteogenica in cellule fosfatasi alcalina-positivo e l'accumulo di minerale extracellulare che macchia usando un fosfato di calcio Von Kossa Stain 5.Differenziazione condrogenica in condizioni Micromass ad alta densità produce pellet che contengono proteoglicani solfati (rilevati utilizzando una macchia Alcian Blu) ed esprimono il collagene di tipo 2 5. Sia il muscolo scheletrico e il differenziamento muscolare liscia possono essere visti con ASC colorazione per la miosina del muscolo scheletrico e MyoD1 e liscia actina del muscolo 5, 13, 14. La differenziazione nel lignaggio ectodermica è suggerito attraverso l'assunzione di un neuronale simile morfologia da ASC indotti e l'espressione di numerosi marcatori neuronali, compreso quello di NeuN, un fattore di trascrizione neuronale 5. Infine, l'induzione di ASC verso un lineage epatica / endodermico base delle condizioni stabilite 15 risultati in cellule che espressione alfa-fetoproteina, un marker noto di epatociti del fegato. Questi marcatori, insieme a numerosi altri pubblicati negli ultimi 10 anni suggerisce fortemente che l'ASC è una popolazione di cellule staminali pluripotenti che possono essere facilmente mantenuta epropagati in vitro e indotta verso cellule delle tre linee germinali embrionali. Accoppiato a loro potenzialità rigenerative in vivo (per una rassegna vedi 4), l'ASC può essere una potente aggiunta agli strumenti di un ricercatore rigenerativa o clinico.
Figura 1. Manuale, isolamento enzimatica di ASC umani da campioni lipoaspirato. A. Preparazione per l'isolamento: prima di isolare i seguenti componenti deve essere preparato: 1) 1x PBS (senza calcio o magnesio), sterilizzato mediante autoclave, 2) una soluzione di 0,075-0,1% collagenasi di tipo IA, preparato in PBS 1x e sterilizzato attraverso la filtrazione con un gruppo filtro 0,22 micron, 3) controllo del mezzo (CM) per la successiva cultura della popolazione ASC. B. Isolamento di ASCs: viene visualizzata una guida step-by-step per l'isolamento della frazione stromale vascolare (SVF) dal lipoaspirato. Passi comprendono lavaggio del lipoaspirato con sterile 1x PBS, la digestione con collagenasi di tipo IA, la raccolta delle SVF mediante centrifugazione e filtrazione SVF. Coltura successiva della SVF si tradurrà in una popolazione fibroblasti aderente contenente la popolazione ASC. Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Multi-lignaggio potenziale di differenziazione della popolazione ASC aderente. Cellule coltivate SVF risultato in una popolazione relativamente omogenea di aderenti, ASC fibroblastiche. Induzione della popolazione ASC sotto definite condizioni risultati in cellule del adipogenico, osteogenico, condrogenico, miogeno scheletrico e lignaggi miogenici lisce.Inoltre, ASC possono anche essere differenziate in cellule della linea ectodermica, esprimendo NeuN, un marcatore di neuroni e di alfa-fetoproteina (AFP) un indicatore costante della linea cellulare endodermico / epatica. Alcune immagini istologia ed immunofluorescenza sono tratte da precedentemente pubblicato i risultati 1,5,6,7,8,9. Differenziazione lignaggio, insieme alla istologico, immunohistologic o macchia fluorescente viene mostrato. Clicca qui per ingrandire la figura.
| Profilo di espressione | ||
| espressione positiva | espressione negativa | |
| CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 | |
| proposto fenotipo di ASC (Comune tra due o più studi) | CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 | CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 |
| marcatori controverse in ASC (Risultati differenziali su più studi) | CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR | |
| stromale cell marcatori | CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 | |
| marcatori ematopoietici | CD31, CD34, CD45, ABCG2 | |
| marcatori in comune tra due o più studi in grassetto SMA = actina del muscolo liscio HLA = antigene leucocitario umano ABCG2 = multi-farmaco proteina trasportatrice G2 | ||
Tabella 1. Profili di espressione sulla superficie cellulare di ASC umani.
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Discussion
Il tessuto adiposo per l'isolamento di ASC può venire in molte forme: da pezzi solidi di tessuto ottenuti con la resezione o liposuzione in piccoli pezzi ottenuti attraverso sia l'estrazione siringa o liposuzione aspirazione assistita (cioè liposuzione). Se le cellule più SVF (e quindi ASC) possono essere ottenuti da campioni adiposi resecati o aspirati non è chiaro come gli studi contrastanti sono stati presentati 16, 17. E 'possibile che sia sotto forma di tessuto adiposo è più adatto per l'isolamento di cellule SVF e ASC finché l'operatore è esperto nella loro tecnica di isolamento. Tuttavia, la liposuzione sia in possesso di un vantaggio rispetto la resezione in quanto è meno invasiva e richiede molto meno post-operatoria. Mentre i tipi di liposuzione sono aumentati negli ultimi dieci anni, comprese le tecniche, come l'ecografia assistita, servoassistito e laser-assistita liposuzione 18, il più comune rimane la liposuzione tumescente,in cui il compartimento adiposo è invaso da grandi quantità di soluzione fisiologica sterile, anestetici e vasocostrittori prima all'aspirazione 19. La scelta della tecnica può variare da chirurgo a chirurgo. Tuttavia, mentre i mezzi di estrazione possono sembrare poco importante per il ricercatore, è importante rendersi conto che la tecnica può avere un effetto sul numero ASC e vitalità. Ad esempio, aumentando la pressione liposuzione vuoto può influire negativamente sulla produzione di cellule SVF 20. Inoltre, diminuisce in ASC proliferazione sono stati misurati su eco-assistita liposuzione 17.
Tuttavia ottenuto, l'aspirato deve essere trattato rapidamente temperature di conservazione possono influenzare la redditività SVF e l'eventuale rendimento ASC. Studi di Matsumoto et al. Hanno dimostrato che il rendimento ASC diminuisce se l'aspirato è conservato a temperatura ambiente per più di 24 ore 21. Se necessario, stoccaggio 24 ore a 4 ° C può essere utilizzato senza alcun effetto deleterios sulle proprietà biologiche della popolazione ASC ma, di nuovo, la vitalità cellulare possono diminuire se questo tempo di stoccaggio viene aumentata oltre tale punto. La facilità di lavorazione lipoaspirato è direttamente correlata al volume complessivo. Volumi più piccoli, ottenuti attraverso l'estrazione della siringa, sono relativamente facili da lavorare. Tuttavia, aspirati di quantitativi maggiori, ottenuti attraverso la liposuzione, possono presentare sfide fisiche. Ad esempio, qualcosa di semplice trasferimento del grasso dal contenitore aspirazione in modo che possa essere lavato può presentare problemi quando il volume aspirato è grande. Il protocollo descritto in questo articolo è destinato ad alleviare alcune di queste sfide.
In generale, l'isolamento delle popolazioni ASC dal lipoaspirato utilizzando il metodo enzimatico descritto in questo articolo non è cambiato molto negli ultimi 10 anni. Ci sono numerosi protocolli disponibili attraverso PubMed che sono eccellenti nella loro descrizione di isolamento di ASC da lipoaspirato. Most di loro delineare un protocollo molto simile con piccole modifiche. Fondamentalmente, il lipoaspirato viene lavato di contaminanti, digerito enzimaticamente per rilasciare la SVF e la SVF, contenente la popolazione ASC, raccolte tramite centrifugazione. La maggior parte lipoaspirato voluminosi arrivano in qualche tipo di contenitore vuoto - la cui configurazione può variare da chirurgo a chirurgo. Questo protocollo raccomanda la rimozione del aspirato in un grande, becher sterile prima del lavaggio, poiché il contenitore stesso può essere fonte di contaminazione, se non adeguatamente puliti prima dell'immissione nella cappa di biosicurezza. Una volta trasferiti e lasciati riposare per gravità, l'aspirato separerà in tre strati: uno strato superiore, olio risultante dalla lisi degli adipociti maturi, uno strato intermedio adiposo e uno strato inferiore di soluzione salina e contaminando globuli rossi. Il livello olio deve essere rimosso come abbiamo notato che potrebbe essere tossico per le colture cellulari derivanti (osservazioni non pubblicate). Anche questo protoCol raccomanda che il sottonatante di soluzione salina e RBC sarà rimosso prima del primo lavaggio, al fine di diminuire il numero potenziale di contaminazione RBC volta ASC sono coltivate. Tuttavia, uno studio di Francis et al. Ha suggerito che questo sottonatante può anche essere una fonte di ASC 22. L'uso di un ml pipetta sierologica 10 rende la rimozione di questo sottonatante relativamente facile. Ciò che rimane è lo strato adiposo che possono poi essere facilmente lavato con PBS sterile, o se lo si desidera, sterile PBS integrato con antibiotici e antimicotici per ridurre la possibilità di contaminazione 23-25. Successivamente al lavaggio, il tessuto adiposo viene digerito enzimaticamente utilizzando una soluzione sterile di collagenasi di tipo IA. L'uso di un'unità di filtrazione come l'unità Millipore mostrato in questo video combina un mezzo conveniente asetticamente filtrando la collagenasi in un contenitore chiuso per cui il tessuto adiposo lavato può essere aggiunto per la successiva digestione bagnomaria a 37 ° C.
Il tipo di collagenasi utilizzato è variato da un gruppo all'altro con collagenasi di tipo IA che sembra essere il più diffuso 1, 24, 25. Tuttavia, ci sono più di 11 differenti tipi di collagenasi disponibili in commercio, ciascuno con affinità digestione per tessuti specifici. Per la digestione del tessuto adiposo, aziende come Sigma Aldrich consigliano i tipi di collagenasi I e II ed entrambi i tipi sono ben rappresentati nella letteratura di oggi 1, 24-27. Nel loro articolo originale, Zuk et al. Usano collagenasi di tipo IA ottenute da fonti bovina ad una concentrazione di 0,075% 1. Tuttavia, la maggior parte delle fonti commerciali di tipo collagenasi IA sono ora ottenuti dalla batteri anaerobi histolyticum Clostridium o E. coli geneticamente modificato con C. histolyticum geni. Molte aziende offrono numerose preparazioni di collagenasi di tipo IA, da greggio a quelli preparati con solfato di ammonio precipitazione. Ilprotocollo descritto in questo articolo JoVE utilizza una preparazione cruda di tipo IA collagenasi che contiene non solo le attività collagenasi, ma anche non specifici proteasi, clostripain e attività enzimatiche triptici. Mentre questi enzimi supplementari sono fondamentali per l'efficienza digestione 28, ci sono quelli che riportano lotto a lotto variabilità associata con collagenasi greggio tipo IA 28, 29 e aumentano le loro concentrazioni di collagenasi allo 0,2% per ottenere digestione efficiente 23. Tali gruppi utilizzando collagenasi di tipo grezzo IA consigliano anche la sua integrazione con albumina di siero bovino (0,1-1,0% BSA) al fine di migliorare le prestazioni degli enzimi e aumentare la stabilità delle cellule all'interno della matrice adiposo. Tuttavia, ciò può non essere necessario, come il protocollo descritto in questo articolo utilizza collagenasi senza integrazione senza effetti negativi sulla efficienza digestione.
Per chi volesse utilizzare un collagenasi comp più definitaosizione, fonti commerciali contenenti collagenasi altamente purificato con una precisa miscela di proteasi sono ora disponibili. Queste preparazioni purificano clostridi tipi collagenasi I e II ad alta attività e combinarle con note attività di proteasi neutri, come dispasi e termolisina. Digestione adiposo efficiente usando collagenasi e termolisina è stata riportata da Zachar et al. 27. In accordo con questo lavoro, Pilgaard et al. Del 30 riportano anche un'eccellente efficienza digestione utilizzando diverse miscele di collagenasi e termolisina. Tuttavia, essi osservano una maggiore efficienza digestione con preparazioni di collagenasi e dispasi.
Tempi di digestione per l'isolamento di cellule dal tessuto adiposo può variare da studio a studio. Molti protocolli pubblicati consigliano tempi di digestione di 1-2 ore 27, 30. Tuttavia, è importante rendersi conto che i tempi eccessivi di digestione possono infine influenzare il numero di vitale ASCs e il loro fenotipo di cellule staminali. Pilgaard e colleghi hanno determinato che 2 ore di digestione a 37 ° C dà il miglior equilibrio tra dissociazione dei tessuti e la funzionalità ASC 30, con Zachar et al. Raccomandando che la digestione, oltre 45 minuti, osservare ogni 15 min fino a 2 ore al massimo, con la digestione essere fermati volta che il tessuto adiposo assume un aspetto più omogeneo 27. Siamo d'accordo con questa raccomandazione. Tuttavia, è la nostra esperienza che la maggior parte di tipo collagenasi IA preparati presso 0,075-,1% sono in grado di digerire grandi quantità di lipoaspirato in 30-45 min e che questi tempi sono adeguati per liberare un numero sufficiente di cellule. Pertanto, questo protocollo raccomanda un tempo di digestione di 30 min. Se è necessario più tempo, la consistenza del lipoaspirato deve essere monitorata e digestione arrestato quando il lipoaspirato assume una "crema" o aspetto "denso" (Figura 1).
Una volta the digestione è completa, l'isolamento della SVF rilasciato viene semplicemente eseguita utilizzando centrifugazione. Tuttavia, come la pressione di aspirazione, gli effetti fisici di centrifugazione possono avere un effetto sulla vitalità SVF e il numero di ASC disponibili per cultura. Uno studio condotto da Kurita e colleghi 31 ha dimostrato che velocità superiori a 3.000 xg possono danneggiare l'ASC. Tuttavia, la velocità dovrebbe essere abbastanza significativo per garantire un adeguato pellet della SVF. Come regola generale, la maggior parte dei protocolli, compreso questo, consigliano una velocità di centrifugazione di 1.200-1.500 x g. Cura dovrebbe essere presa dal ricercatore per garantire che essi capire il rapporto tra la forza centrifuga (misurata in g) e velocità di centrifugazione (misurata come rpm), come il rapporto dipende dal rotore di centrifuga specifico. Tuttavia, come di regola, forze centrifughe inferiori, come 1.200 xg, sono spesso equivalenti a velocità di centrifugazione e possono essere tranquillamente usati in modo intercambiabile.
Seguendo la filatura, di varistrati istinto si osservano nella provetta da centrifuga (Figura 1): uno strato superiore di olio e "soffici" adipociti bianchi, uno strato collagenasi mezzo e un pellet di cellule. Il pellet si può avere due strati distinti: uno strato superiore di globuli rossi e di una minore pellet SVF bianco, contenente le ASC. Questo protocollo raccomanda l'attenta aspirazione dell'olio e adipociti, come l'olio può essere tossico per la coltura cellulare e adipociti hanno dimostrato di essere in grado di dedifferentiation nuovo ad un tipo cellulare più primitiva 32. Tuttavia, questi adipociti possono essere raccolte a questo punto se desiderato. A causa di questi contaminanti, questo protocollo raccomanda un lavaggio supplementare per garantire loro un'adeguata rimozione. Questo passo permette anche al ricercatore di combinare più pellets SVF per la successiva facilità di filtrazione. La filtrazione è probabile che sia necessario per la presenza di grandi pezzi di materiale fibroso e aggregati cellulari seguenti digestione. Questi materiali possono essere facilmente rimossiattraverso la semplice filtrazione a gravità attraverso 70 o 100 filtri a rete micron. Un'aliquota del filtrato può essere presa per contare il numero di cellule nucleate se desiderato e filtrato residuo placcato per ASC aderenza ed espansione.
Nonostante i tentativi diligente per rimuovere il maggior numero di globuli rossi possibile, senza preparazione ASC sarà totalmente senza contaminazioni RBC. Nel nostro articolo originale, abbiamo proposto la rimozione di questi globuli rossi mediante risospensione del pellet in una soluzione ipotonica di 160 mM NH 4 Cl. La maggior parte degli articoli successivi isolamento contiene questo passaggio e raccomanda l'uso di NH 4 soluzioni basate Cl o acqua sterile 22-24, 27, 33, anche se occorre fare attenzione se si utilizza acqua sterile, per ridurre al minimo il tempo le cellule SVF sono esposte alla soluzione ipotonica 27. Tuttavia, questo passo può non essere necessario come globuli rossi sono una popolazione cellulare non aderente e possono essere facilmente rimossi a seguito di una coltura overnightpopolazione ASC. Inoltre, mentre aneddotica nella migliore delle ipotesi, questi globuli rossi sembrano migliorare l'espansione iniziale delle risultanti cellule aderenti (Zuk, osservazioni non pubblicate). Come tale, questo protocollo elimina la fase di lisi RBC e propone che le culture ASC iniziali poter espandere in presenza di questi globuli rossi per i primi 3-4 giorni senza alcuna variazione di terreno di coltura. La ragione di questa osservazione può essere causa di qualche tipo di segnalazione paracrina contamini globuli o può semplicemente essere dovuto a una migliore redditività con l'esclusione della fase di lisi RBC. Successivamente il terreno di coltura può essere aspirato e la maggioranza dei GR rimosso lavando delicatamente le piastre con PBS 1x sterile. Nel corso del tempo, tutti i globuli rossi restanti alla fine muoiono e possono essere rimossi dalla cultura.
Gli studi di Zachar e Boquest hanno stimato che il 25-50% del sedimento risospeso SVF aderisce alla coltura di tessuti plastica 23, 27. La risultante "passaggio 0" ASC cultures sono eterogenei, composto da piccole cellule rotonde ritenuti ASC e cellule di forma più irregolare proposte siano endoteliale in origine. Mentre gli studi di molti gruppi tra cui la nostra hanno confermato l'assenza di contaminanti tipi cellulari, quali SMC, cellule ematopoietiche e fibroblasti nelle culture ASC 1, la presenza di tipi di cellule supplementari non si può escludere. . Infatti, Tallone et al ha caratterizzato il passaggio 0 culture e osservato quattro popolazioni distinte: 1) piccolo, rotondo, le cellule in rapida rinnovando, 2) le cellule fibroblastiche fusiformi ritenuti ASC, 3) lentamente replicando grandi cellule con un più limitato potenziali (cioè pre-adipociti) e 4), cellule endoteliali cubica che si perdono con il passaggio 34. Studi successivi hanno dimostrato che il tondo, rapidamente rinnovando popolazione cellulare possiede la massima multipotenzialità ed esprimere tipici marcatori di cellule staminali 35, 36. Inoltre, essi possono formare "sferoidi" a causa dila loro proliferazione rapida e sono spesso circondato da fibroblasti fusiformi. Come tale, è possibile che la popolazione ASC fusiforme sopra proposta può provenire da queste cellule. Seguendo espansione iniziale di tali passaggio 0 culture ASC, si ritiene che la coltura continua nel tempo seleziona per la ASC, con le culture risultanti assumendo una più fibroblastica, composizione omogenea. Tuttavia, resti di cellule contaminanti possono non essere totalmente escluso e, quindi, la popolazione ASC dovrebbe ancora essere considerata eterogenea.
Mentre il protocollo descritto in questo articolo è semplice, poco costoso e non richiede parti di apparecchiatura non si trovano normalmente in un impianto di coltura tissutale, si ha lo svantaggio di richiedere una tale struttura. Numerosi studi hanno indagato le applicazioni traslazionali di ASC attraverso modelli animali e studi clinici che utilizzano il ASC hanno cominciato a comparire (per una rassegna si veda 4
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Disclosures
Gli autori di questo manoscritto sono co-inventori su un brevetto di proprietà di The Regents dell'Università della California e in licenza a Cytori Therapeutics.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare e ringraziare quei personale di ricerca aggiuntivi che hanno contribuito allo sviluppo del protocollo descritto e il suo isolamento di ASC, tra cui: Dr. H. Peter Lorenz, MD, il dottor Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, e il dottor John Fraser, PhD. I risultati presentati sono stati finanziati, in parte, da borse di ricerca dal National Institutes of Health, compresi i NIAMS e NIDCR Istituti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone - water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
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