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Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines

Published: September 26, 2013 doi: 10.3791/50585
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4, 3,5
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.

Abstract

En 2001, des chercheurs de l'Université de Californie, Los Angeles, décrit l'isolement d'une nouvelle population de cellules souches adultes à partir de tissu adipeux que Liposuctioned qu'ils appellent d'abord les cellules de lipoaspirat transformés ou des cellules de l'APL. Depuis lors, ces cellules souches ont été renommés que les cellules souches dérivées de tissu adipeux ou CSA et ont continué pour devenir l'un des plus populaires des populations les cellules souches adultes dans les domaines de la recherche sur les cellules souches et la médecine régénérative. Des milliers d'articles décrivent maintenant l'utilisation des CSA dans une variété de modèles animaux de régénération, y compris la régénération osseuse, réparation des nerfs périphériques et de l'ingénierie cardiovasculaire. Des articles récents ont commencé à décrire la multitude d'utilisations pour CSA dans la clinique. Le protocole indiqué dans cet article décrit la procédure de base pour la main et enzymatique isoler CSA de grandes quantités de lipoaspirates obtenus à partir des procédures cosmétiques. Ce protocole peut être facilement agrandie ou réduite à accommodmangé le volume du lipoaspirat et peut être adapté pour isoler à partir de tissu adipeux ASCs obtenus par plasties abdominales et d'autres procédures similaires.

Introduction

En 2001, une population présumée de cellules souches multipotentes à partir de tissu adipeux a été décrite dans la revue Tissue Engineering 1. Ces cellules ont été donné le nom de cellules transformés lipoaspirat ou PLA en raison de leur dérivation à partir de tissu de lipoaspirat traités obtenus par la chirurgie esthétique. Le procédé d'isolement décrit dans cet article est basée sur des stratégies existantes enzymatiques pour l'isolement de la fraction stroma vasculaire (SVF) à partir de tissu adipeux 2. Le SVF a été définie comme une transformation minimale population de globules rouges, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes et des pré-adipocytes qui restent encore à adhérer à un substrat de culture de tissus 2, 3. La culture de cette SVF dans le temps est proposé d'éliminer bon nombre de ces populations de cellules contaminantes et entraîner, une population de fibroblastes adhérent. Ces fibroblastes ont été identifiés dans la littérature pour les 40 dernières années comme étant pré-adipocytes. Toutefois, notre groupe de recherche a démontré que ces cellules possédaient mésodermique multipotency et renommés de la population SVF adhérente que les cellules de l'APL. Des études ultérieures par de nombreux autres groupes de recherche ont ajouté à ce potentiel, suggérant à la fois endodermique et potentiels ectodermiques (pour revue, voir 4). Depuis ce temps, de nombreux termes supplémentaires pour ces cellules ont été publiés dans la littérature. Afin de fournir un certain type de consensus, le terme de cellules souches du tissu adipeux ou CSA a été adopté lors de la deuxième conférence annuelle IFATS 2. En tant que tel, l'ASC terme sera utilisé dans cet article.

Le protocole décrit dans cet article est une procédure relativement simple qui nécessite un équipement de laboratoire standard et utilise des réactifs simples, telles que la phospho-solution saline tamponnée, des réactifs de milieux de culture de tissus standard et de la collagénase. Il peut produire un grand nombre de CSA en fonction de la quantité de départ de volume du tissu adipeux et c ultérieurulture temps. Cependant, le traitement d'une telle quantité de tissu adipeux peut présenter certains problèmes physiques qui peuvent être atténués à un degré en utilisant ce protocole. En outre, ce protocole ne nécessite tissus stériles installations de culture et les hottes de biosécurité approuvées, ce qui nécessite l'utilisation d'une installation de culture de tissus approuvé. Cette exigence peut également diminuer l'utilité de la population de l'ASC dans les applications cliniques, sauf s'ils sont isolés dans de bonnes pratiques de fabrication des installations (GMP) approuvés conçus pour l'isolement et l'expansion des matériaux pour une utilisation clinique. Comme alternative, les systèmes automatisés qui peuvent isoler CSA dans un système fermé dans la salle d'opération permettrait d'éviter cette question clé et permettre l'utilisation immédiate des CSA sans qu'il soit nécessaire pour l'expansion in vitro ultérieure. A ce jour, il existe six systèmes automatisés qui sont commercialement disponibles pour l'isolement de cellules à partir de tissu humain. Ces systèmes peuvent permettre d'isoler unnombre important des CSA de grandes quantités de tissu adipeux immédiatement après sa récolte. Ces CSA pourraient alors être réintroduits dans le patient pour une variété de fins de régénération sans que le patient jamais avoir à quitter la salle d'opération. En plus de ce protocole décrivant l'isolement d'emploi des CSA, un protocole pour l'isolement automatique des CSA à l'aide du système Celution est également donnée dans un article associé.

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Protocol

Le protocole présenté ici décrit l'isolement d'emploi des CSA de lipoaspirates obtenues par des procédures cosmétiques par digestion enzymatique et centrifugation différentielle. Ce protocole a été publiée dans le génie tissulaire de la revue en 2001 1, où les cellules résultantes ont été appelés cellules lipoaspirat transformés ou des cellules de l'APL en raison de leur isolement lipoaspirates. Toutefois, le terme cellule PLA a maintenant été remplacé par le terme de cellules ou CSA pour donner le champ une sorte de conformité en termes de nomenclature souches du tissu adipeux. Les cellules isolées grâce à ce protocole ont été représentés par un grand nombre de posséder un potentiel mésodermique la fois in vitro et in vivo (pour revue voir 4). En outre, les ectodermiques et endodermiques potentiels de l'ASC ont également été explorées 4. La technique d'isolement est simple et directe et nécessite environ une heure à compléter. La cellule résultantes est cultivée dans des conditions de culture de tissu standard. Avec le temps de la culture, la population de l'ASC devient plus homogène, composé de cellules fibroblastiques qui élargissent facilement et présentant une bonne viabilité sur le long terme dans la culture.

Remarque: Les pièces d'équipement qui sont nécessaires suivants sont répertoriés à la fin de cet article. Tous les articles de verrerie, les médias et les réactifs doivent être stérilisés par autoclavage ou par filtration de 0,22 um filtres. Aseptiques techniques de culture de tissus doivent être respectées en tout temps. Pour ce faire, tous les matériaux placés dans l'armoire de biosécurité doivent être stérilisés par pulvérisation d'une solution d'éthanol à 70% et essuyer avec des serviettes en papier propre.

Une. Avant la récolte, préparer la suite de:

  1. 1X stérile phospho-solution saline tamponnée (PBS) pour le lavage des lipoaspirates. Préparer environ 1 L de PBS 1x pour 100 ml de lipoaspirat. Autoclave le PBS et tousow refroidir à température ambiante avant utilisation. En option, l'antibiotique / antifongique peut être ajouté à une concentration finale de: 100 UI / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 2,50 pg / ml d'amphotéricine B, une fois le PBS refroidi.
  2. Stérile de 0,075 à 0,1% collagénase de type IA (à partir de Clostridium histolyticum) pour la digestion enzymatique de la lipoaspirat. La concentration dépend de la qualité et de la source de la collagénase - c.-à-vs brute a été purifiée. Autres types collagénase peuvent être utilisés (par exemple de type de collagénase II ou IV) à des concentrations similaires. Préparer dans du PBS 1x stérile et de filtrage en utilisant un système de filtration de 1 000 ml muni d'un filtre de 0,22 pm (Figure 1A). Toutefois, les bouteilles en verre stérile et munis d'un filtre supérieur de la bouteille peuvent également être utilisés. Préparer et utiliser à température ambiante. solutions de collagénase peuvent être conservées pendant le court terme à 4 ° C jusqu'à utilisation. Ne pas congeler la solution de collagénase comme il peut réduire son activité.
  3. Stérile contrôle moyen (CM) pour la collagénase inactivation et la culture de la population de l'ASC. Pour 500 ml de CM, mélanger ce qui suit: 500 ml de DMEM (4,5 g / L de glucose, L-glutamine), 50 ml de sérum fœtal bovin (inactivé par la chaleur), 5 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI de pénicilline, 10 000 ug / ml streptomycine). En option, 5 ml d'amphotéricine B (250 pg / ml d'amphotéricine B) peut également être ajouté. La filtration stérile de ce média est nécessaire si les réactifs non-stériles sont utilisés. Placer le CM dans un 37 ° C bain d'eau 30 min avant utilisation pour chauffer le milieu.
  4. Verrerie et vaisselle en plastique stérile pour l'isolation. Autoclave un 1000 ml récipient en verre et laisser refroidir à température ambiante avant utilisation. En outre, avoir le matériel en plastique suivant prêt: pipettes sérologiques aseptique (5 ml, 10 ml et 25 ml), 50 ml des tubes de centrifugation, et des plats de la culture de la culture traitée tissus.

2. Isolement des CSA de Lipoaspirates

La plupart des lipoaspirates sont collectées dans un récipient d'aspiration (voir figure 1B), et peuvent être constituées de trois couches distinctes: 1) une couche supérieure d'huile due à la lyse des adipocytes matures, 2) une couche intermédiaire de tissu adipeux, et 3) un en bas, le liquide contenant une solution saline post ultracentrifugation et de contaminer les types de cellules telles que les globules rouges (hématies). La couche d'huile dessus peut ne pas être présent en quantités importantes. S'il est présent, il doit être aspiré en tant que contamination de l'huile de la culture d'ASC résultant pourrait affecter la viabilité de la culture. Le post ultracentrifugation fond doit être retiré avant le traitement afin de minimiser la contamination des cultures de l'ASC avec les globules rouges. Ceci laissera le milieu, la couche de tissu adipeux, qui sera ensuite lavé et digéré par voie enzymatique pour libérer sa fraction cellulaire, stroma vasculaire (SVF).

  1. Lavage de la lipoaspirat: Ouvrez le conteneur de lipoaspirat dans la culture de tissus hood et décanter soigneusement le lipoaspirat dans un bécher de 1 L en verre stérile. Laisser les couches se séparer de lipoaspirat jusqu'à ce que la couche de tissu adipeux est bien séparé (figure 1B).
    1. Aspirer la couche d'huile (le cas échéant) à l'aide, d'une pipette en verre stérile et la solution saline inférieure post ultracentrifugation en utilisant une pipette sérologique de 10 ml. Cela permettra d'éliminer la grande majorité de la contamination des globules rouges et une solution saline.
    2. Évaluer le volume de la couche de tissu adipeux résultant et ajouter du PBS 1x stérile à un volume égal. Incorporer la aspirer avec la pipette utilisée pour l'aspiration afin de mélanger le lipoaspirat avec le PBS. Laisser les deux couches de s'installer. Comme indiqué plus haut, le PBS 1x peut être complété avec des antibiotiques / antimycosiques.
    3. Aspirer le post ultracentrifugation en utilisant une pipette sérologique de 10 ml.
    4. Poursuivre le lavage de la fraction du tissu adipeux, comme indiqué dans les étapes 2.1.2. et 2.1.3. jusqu'à ce que la couche adipeuse a / couleur d'or jaune. E Aspirere post ultracentrifugation une dernière fois, laissant la fraction du tissu adipeux dans le récipient en verre. Pour assurer une élimination suffisante de la post ultracentrifugation, permettre aux couches de lipoaspirat se déposer pendant 5 min après le dernier lavage et avant l'aspiration finale.
  2. Digestion enzymatique du lipoaspirat: Préparer une solution de collagénase 1A stérile tel que décrit ci-dessus dans une unité de filtre. Préparer un volume égal à celui de la fraction de tissu adipeux et le filtre stérile.
    1. Après filtration de la solution de collagénase, jeter le filtre supérieur, versez délicatement la fraction adipeux lavé dans la solution de collagénase et fermer hermétiquement la bouteille.
    2. Placer le mélange de collagénase / adipeux dans un bain d'eau à 37 ° et de digérer à 37 ° C pendant 30 min. Agitez doucement le mélange collagénase / adipeux chaque 5-10 min et remettez dans le bain d'eau. La couche de tissu adipeux doit prendre une apparence "lisse" (Figure 1B) que les produits de digestion. Temps de digestion supplémentaires (à savoir jusqu'à 2 heures) peuvent être utilisées si la couche de tissu adipeux semble toujours avoir des morceaux solides de la graisse qu'il contient.
  3. Isolation des CSA: Placer le mélange collagénase / adipeux digéré fond de l'armoire de biosécurité. Assurez-vous de stériliser l'unité de filtre avec 70% d'éthanol avant de le remettre dans l'armoire.
    1. Pipette 25 ml de la post ultracentrifugation contenant le SVF dans des tubes de 50 ml à centrifuger stériles.
    2. Ajouter 25 ml de CM à chaque tube. Laisser le CM pour inactiver la collagénase par incubation à température ambiante dans l'armoire pendant 5 min.
    3. Centrifuger pendant 10 min à 1200 x g pour recueillir les SVF comme une pastille.
    4. Dans le cabinet de biosécurité, aspirer le surnageant de chaque tube. Assurer la couche d'huile dessus et des adipocytes flottants sont aspirés avec ce surnageant (
    5. Mélanger les granulés SVF dans un tube de centrifugeuse à l'aide de 30 ml CM et répartir également sur ​​deux nouveaux tubes de 50 ml de centrifugeuses. Centrifuger comme à l'étape 2.3.3. et aspirer les surnageants des deux pastilles SVF (non représentées sur la figure).
      FACULTATIF: Si lyse RBC est désiré, la remise en suspension chaque culot SVF dans 10 ml d'un tampon de lyse RBC (160 mM de NH 4 Cl) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Centrifuger comme à l'étape 2.3.3. et aspirer le surnageant pour obtenir les pastilles SVF (non représentées sur la figure).
    6. Combiner les deux pastilles SVF dans un nouveau tube de centrifugation en utilisant 5-10 ml CM (figure 1B).
    7. Pour filtrer les particules de tissu plus grandes, pipeter le culot remis en suspension SVF sur un filtre à mailles de 100 um placé sur le dessus d'un nouveau tube de centrifugation de 50 ml et laisser un filtrage par écoulement par gravité.
    8. aliquotes de pipette de la remise en suspension(Et filtrée) pastille de SVF contenant les CSA sur des tissus de culture des boîtes de culture traités. Compléter chaque plat avec un volume approprié de CM.
    9. Culture des cellules de CM pour 3-4 jours à 37 ° C, 5% de CO 2 sans changement de support.

Après cette période de culture initiale, les milieux de culture peut être aspiré et des globules rouges contaminants doucement éliminé par lavage avec 1XPBS stériles. Remplacer par CM et continuer à la culture des CSA au besoin. Le type de boite de culture tissulaire utilisé et la manière dont le culot resuspendu SVF est réparti entre ces plats dépendra du nombre de cellules désirées suivant culture tissulaire classique.

3. Caractérisation de la population de l'ASC: cytométrie en flux et multilignée différenciation

Une fois isolée, la caractérisation de la population ayant une ASC doit être effectuée. Les approches conventionnelles pour cette comprennent cyto d'écoulementmétrie de caractériser le profil des cellules d'antigène CD à la surface cellulaire et dans la différenciation in vitro afin de confirmer leur capacité de différenciation multilignée. Alors que plusieurs lignées peuvent être évalués dans les CSA, ce protocole définit la différenciation des CSA dans les cellules de la adipogénique, ostéogénique et lignées chondrogènes comme un moyen de confirmer le potentiel du mésoderme multilignée 5.

In vitro de lignées multiples différenciation des CSA

  1. La différenciation ostéogénique des CSA: Avant induction, préparer ostéogénique moyen (OM) de la manière suivante: A une bouteille de DMEM 500 ml (4,5 g / ml de glucose) ajouter 25,0 ml de FBS (5,0% concentration finale) et 5,0 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI / ml et des concentrations finales de 10 000 mg / ml, respectivement). Pour ce faire, ajoutez les agents d'induction ostéogéniques suivants pour obtenir les concentrations finales indiquées: dexaméthasone (0,1 uM final), l'acide L-ascorbique 2-phosphate (50,0 uM finales) Et de β-glycérophosphate (10,0 mM final).
    1. Avant l'induction, de la récolte et de la plaque de culture les CSA dans la boite de culture de tissu souhaitée, de sorte qu'une confluence d'environ 50% est atteint. Pour chaque plat expérimental plaqué, plaque un plat supplémentaire pour un contrôle non induit. nuit de la culture en CM.
      Remarque: 50% de confluence est recommandé, afin de permettre la poursuite de la prolifération qui peuvent se produire au cours de l'induction
    2. Le jour de l'induction, éliminer le milieu et ajoutez la ligne suivante: OM aux ostéogéniques puits expérimentaux souhaités et CM dans les puits de contrôle. Le volume de milieu utilisé dépendra de la taille de la boîte de culture tissulaire. Pour 12 plats ainsi, 1,0 ml de milieu par puits est suffisant. Pour 6 plats ainsi, 2,0 ml de milieu par puits est suffisant. Pour des boîtes de 100 mm, 10,0 ml de milieu par boîte devraient être utilisés.
    3. Culture des cellules pour un minimum de 14 jours avec des changements du milieu approprié chaque 3-4jours. Populations ASC très ostéogéniques peuvent montrer des signes de dépôt minéral extracellulaire dès 7 jours induction.
    4. Différenciation ostéogénique (ie dépôt minéral extracellulaire) peut être confirmé en utilisant une coloration de von Kossa histologique de phosphate de calcium. Cette tache va produire un précipité brun-noir identification de la présence de phosphate de calcium extracellulaire (voir figure 2).
      Pour colorer avec le réactif von Kossa:
      1. Retirer le OM à partir des cellules expérimentales et la CM de cellules témoins
      2. Fixer les cellules pendant 60 minutes dans 4,0% paraformaldéhyde préparé en 1x PBS.
      3. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X.
      4. Incuber les cellules avec 2,0% de nitrate d'argent (préparé dans de l'eau) dans l'obscurité pendant 30 min.
      5. Retirez le nitrate d'argent, laver deux fois avec de l'eau distillée et sécher à l'air les cellules.
      6. Exposer les cellules à une lumière UV pendant 60 min à développer le calcalcium phosphate précipité.
      7. Laver les cellules à plusieurs reprises avec 1XPBS.
      8. Contre-colorer la cellule avec de l'hématoxyline, si désiré.
  1. La différenciation adipogène des CSA: Avant induction, préparer Adipogenic moyenne (AM) de la manière suivante: A une bouteille de DMEM 500 ml (4,5 g / ml de glucose) ajouter 50,0 ml de FBS (10,0% de concentration finale) et 5,0 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI / ml et 10 000 pg / ml des concentrations finales, respectivement). Pour ce faire, ajoutez les agents d'induction adipogéniques suivantes pour donner les concentrations finales indiquées: dexaméthasone (1,0 uM final), 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX - 0,5 mM final), l'indométacine (0,2 mM final) et l'insuline (10,0 uM finale ).
    1. Avant l'induction, de la récolte et de la plaque de culture dans les ASCs la boîte de culture de tissu souhaitée, de sorte qu'une confluence d'environ 80% est atteint. Pour chaque plat expérimental plaqué, plaque un plusplat al pour un contrôle non induit. . Culture d'une nuit en CM Note: la différenciation des CSA Adipogenic semble être plus efficace à une augmentation de la confluence.
    2. Le jour de l'induction, éliminer le milieu et ajoutez la ligne suivante: AM pour les ostéogéniques puits expérimentaux souhaités et CM dans les puits de contrôle. Le volume de milieu utilisé dépendra de la taille de la boîte de culture tissulaire. Pour 12 plats ainsi, 1.0.ml des médias par puits est suffisant. Pour 6 plats ainsi, 2,0 ml de milieu par puits est suffisant. Pour des boîtes de 100 mm, 10,0 ml de milieu par boîte devraient être utilisés.
    3. Culture des cellules pour un minimum de 14 jours avec des changements du milieu approprié tous les 3-4 jours. Populations ASC très adipogéniques peuvent montrer des signes de formation de vacuole lipidique dès 7 jours induction.
    4. CSA en cours de différenciation adipocytaire développeront plusieurs vacuoles lipidiques qui peuvent être facilement visualisés au microscope optique. En outre, la différenciation adipocytaire peutêtre confirmée en utilisant une tache histologique Oil Red O qui va s'accumuler dans ces vacuoles (voir la figure 2).
      Pour colorer avec de l'huile rouge O:
      1. Retirez le support de cellules expérimentales et de contrôle et les fixer pendant 60 minutes en utilisant un fixateur formelle de calcium à 10%. Pour préparer ce fixateur, combiner la suivante: eau 1,0 g de CaCl2, 25,0 ml 16% de paraformaldéhyde (4,0% final) et 75,0 ml d'eau distillée.
      2. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X.
      3. Laver les cellules brièvement avec 70% d'éthanol.
      4. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min avec la solution Oil Red O. Pour préparer la solution Oil Red O, dissoudre 2,0 g de Oil Red O poudre dans 50,0 ml de 70% d'éthanol et 50,0 ml d'acétone.
      5. Laver les cellules avec 70% d'éthanol et ensuite avec de l'eau du robinet.
      6. Visualiser les cellules peu après coloration due à la décoloration de la tache avec le temps.
  1. La différenciation chondrocytaire des CSA: la différenciation chondrocytaire est réalisée par une technique de culture à haute densité dénommé «culture de micromasse". Avant la culture, de préparer Chondrogène moyen (CHM) de la manière suivante: A une bouteille de DMEM 500 ml (4,5 g / ml de glucose) ajouter 5,0 ml de FBS (1% concentration finale) et 5,0 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 UI / ml et 10 000 pg / ml des concentrations finales, respectivement). Pour ce faire, ajoutez les agents d'induction chondrogènes suivants pour obtenir les concentrations finales indiquées: L-ascorbique-2-phosphate (50,0 pg / ml final), insuline (6,25 pg / ml final), la transferrine (6,25 pg / ml final) et TGFβ1 (10,0 ng / ml).
    1. Récolter les ASC et centrifuger pendant 5 min à 1200 x g pour sédimenter les cellules. Compter les cellules pour déterminer la densité de la suspension de cellules.
    2. Pour préparer les granules de micromasse, préparer deux suspensions de cellules: une suspension expérimental préparé dans ChM à une densité de 1 x 10 7 celluless / ml et une suspension témoin préparé en CM à une densité de 1 x 10 7 cellules / ml.
      1. Placer 10,0 pi "gouttelettes" de la suspension cellulaire dans des puits individuels d'une antenne multi-puits. Laisser adhérer pendant 2-3 heures à 37 ° C.
      2. Superposer délicatement les gouttelettes plaqués avec soit ChM ou CM en faisant attention de ne pas dissocier les cellules.
      3. Culture des cellules pour jusqu'à 14 jours dans ChM ou CM avec des changements dans le milieu tous les 3-4 jours. Les cellules cultivées en CHM condenser sur ce temps pour former un culot micromasse à haute densité, avec peu ou pas de cellules en une monocouche environnante. Les cellules témoins cultivées ne subiront pas cette condensation et beaucoup seront trouvés en monocouche.
      4. Pour confirmer chondrogénèse, fixer les boulettes pendant 15 min à 4.0% de paraformaldéhyde (préparés 1x PBS) à température ambiante. Colorer la présence de protéoglycanes sulfatés en utilisant un bleu histologique tache Alcian.
        Pour colorer en utilisant Bleu Alcian:
        1. Laver le paraformaldehyde-fixe granulés une fois dans 1 x PBS.
        2. Incuber les pastilles dans du HCl 0,1 N (pH 1,0) pendant 5 min pour réduire leur pH.
        3. Retirez le HCl et ajouter 1% de réactif bleu Alcian (préparé dans HCl 0,1 N, pH 1,0). Incuber pendant 30 min à température ambiante.
        4. Retirez le réactif bleu Alcian et laver les pastilles avec HCl 0,1 N (pH 1,0) pour éliminer l'excès de colorant.
        5. Lavages supplémentaires avec de l'eau du robinet peuvent être utilisés pour réduire la coloration de fond.
        6. En variante, les pastilles de micromasse peuvent être récoltées, fixées pendant une nuit dans du formol à 10%, noyés dans de la paraffine et des sections colorées pour le Bleu Alcian.

4. La caractérisation par cytométrie en flux des CSA

Caractérisation du profil d'antigène CD à la surface cellulaire peut être réalisée par l'intermédiaire cytométrie en flux conventionnels.

  1. Préparation du CSA pour la cytométrie en flux: Avantà l'analyse, préparer une cytométrie en flux de la mémoire tampon (FCB) constitué des éléments suivants: 1,0% de BSA, 2,0% de FBS et 0,025% de saponine préparé dans du PBS 1x.
    1. Récolter les ASC et centrifuger les cellules pendant 5 min à 1200 xg pour produire une pastille.
    2. Remettre en suspension les cellules dans 1XPBS stérile et compter les cellules en utilisant un hématimètre. Déterminer la densité cellulaire de la suspension.
    3. Diviser la suspension jusqu'à en aliquotes de 5 x 10 5 cellules totales et centrifuger pour sédimenter.
    4. Retirer le surnageant PBS et fixer les cellules pendant 60 min à -20 ° C avec un excès de glace-éthanol à 70% froid. Si nécessaire, ces cellules peuvent être stockées dans cet éthanol à 70% dans un congélateur à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    5. Après la fixation, aspirer délicatement la éthanol et laver délicatement le culot deux fois avec un excès de FCB. Pour laver:
      1. Ajouter un excès de FCB et remettre délicatement le culot.
      2. Centrifuger pendant 5 min à 1200 xg pour recueillir les cellules unesa pastille.
      3. Aspirer délicatement le surnageant FCB.
      4. Répétez.
    6. Retirez la finale surnageant de lavage de FCB de chaque aliquote et remettre en suspension dans 100 ul de FCB. Ajouter l'anticorps primaire conjugué à un fluorochrome désirée en utilisant la dilution suggéré par le fabricant. Incuber les cellules sur de la glace avec l'anticorps pendant 30 minutes.
      Remarque: si des anticorps conjugués à un fluorochrome primaires ne sont pas disponibles, les anticorps primaires non conjugués peuvent être utilisés.
    7. Pour chaque fluorochrome utilisé (par exemple FITC, PE), incuber une partie aliquote de cellules avec 100 ml contenant FCB IgG isotype en tant que témoin négatif.
    8. Incuber une aliquote de 100 ml contenant FCB aucun anticorps comme un contrôle supplémentaire.
    9. Laver chaque aliquote de cellules deux fois avec FCB comme indiqué à l'étape 4.1.5. Après le dernier lavage, remettre en suspension les aliquotes dans 100 ml de FCB et procéder à l'analyse des flux.
      Remarque: si des anticorps primaires non conjugués ont été utilisés: la suite de cette étape de lavage à incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 min avec FCB complétée avec l'anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome approprié en utilisant la dilution suggéré par le fabricant. Laver deux fois, comme indiqué à l'étape 4.1.5.
  2. Analyse des flux de CSA: Pour l'analyse des flux, un minimum de 10 000 événements devrait être prise en compte. Contrôles non colorées et isotype devraient être utilisés pour définir portes par diffusion vers l'avant (FSC) et la diffusion latérale (SSC). Pour cela, les pas de contrôle des anticorps (c'est à dire non colorés de l'étape 4.1.8) doivent être utilisées afin d'éliminer les débris et les CSA mortes. Les contrôles IgG isotype de l'étape 4.1.7. devraient être utilisées pour établir des zones de fluorescence positive.

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Representative Results

Le contour du protocole décrit ci-dessus, un procédé enzymatique manuel pour l'isolement d'un SVF à partir d'un grand échantillon de lipoaspirat de volume. Dans ce SVF sont nombreuses populations de cellules, y compris l'ASC. De nombreuses études suggèrent que la culture de cette SVF dans des conditions de culture de tissus standards choisira pour une population de fibroblastes adhérent susceptible d'être composé principalement de type ASC. Conformément à cela, nous avons montré, en utilisant la cytométrie de flux et immunofluorescence, qui deviennent des pastilles SVF cultivées essentiellement exempt des principaux types de cellules contaminantes, à savoir les globules rouges, les cellules musculaires lisses et des cellules du lignage endothélial 1. La population de l'ASC obtenue est relativement homogène en apparence et composée de cellules de type fibroblaste (Figure 2). Ces ASCs adhérentes poussent bien en culture dans des conditions de culture de tissus standard et présentent une population modérée temps de doublement une rendant aptes à de nombreuses b moléculaire et cellulaireétudes de IOLOGIE in vitro et des études de régénération in vivo. Cependant, à la lumière de la nature hétérogène de la SVF isolé, la validation de la population de l'ASC est nécessaire. De nombreuses études ont utilisé la cytométrie en flux afin de caractériser le profil antigénique des CSA CD cultivées comme un moyen potentiel d'identification de ces cellules à la fois in vitro et in vivo 9.5. Tableau 1 résume les résultats d'un grand nombre de ces études. Bien que l'expression de certains de ces antigènes CD reste controversée, il est généralement admis que les CSA sont cultivées CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 et CD140a positif. L'absence de nombreux antigènes CD hématopoïétiques, tels que CD31 et CD45, est compatible avec l'origine mésodermique des CSA, bien que l'expression de marqueurs spécifiques comme hématopoïétiques CD34 n'est toujours pas résolu à ce stade. Récemment, les profils antigéniques ASC, tel que déterminé par cytométrie de flux, ont été utilisées pour sélectionner les SUBPOP spécifiquelations 10-12 dans l'espoir de produire CSA avec des capacités de différenciation renforcée.

Comme les moyens les plus populaires de validation, dans l'induction in vitro de la population de l'ASC à l'aide définis conditions de culture des résultats dans leur différenciation en mésoderme, ectoderme et endoderme lignées (pour revue, voir 4) (figure 2). Bien que in vitro tri-couche germe potentiel de s'est traduit par l'utilisation des CSA pour une grande variété de systèmes de modèles de régénération, la différenciation en ostéogénique, adipogénique et cellules chondrogéniques est généralement suffisante pour identifier l'ASC et de confirmer son multipotency. Dans nos mains, la différenciation adipocytaire des CSA résultats dans des cellules contenant des vacuoles lipidiques lumineux qui se colorent en utilisant Oil Red O 5. Les résultats de la différenciation des cellules ostéogéniques à de la phosphatase alcaline positifs et l'accumulation de minéral extracellulaire qui colore en utilisant un phosphate de calcium Von Kossa Stain 5.Différenciation chondrocytaire dans des conditions de micromasse haute densité produit des granulés contenant des protéoglycanes sulfatés (détectés à l'aide d'un colorant bleu Alcian) et expriment le collagène de type 2 5. Les deux muscles squelettiques et la différenciation du muscle lisse peuvent être vus avec CSA coloration pour myosine de muscle squelettique et MyoD1 et l'actine musculaire lisse 5, 13, 14. La différenciation en lignée ectodermique est suggéré par l'hypothèse d'une morphologie neuronale comme par les CSA-induites et l'expression de nombreux marqueurs neuronaux, y compris celle de NeuN, un facteur de transcription 5 neuronale. Enfin, l'induction des CSA vers une lignée hépatique / endodermique conditions établies sur la base de résultats de 15 cette expression dans les cellules alpha-foetoprotéine, un marqueur bien connu des hépatocytes du foie. Ces marqueurs, ainsi que de nombreux autres publiés au cours des 10 dernières années suggèrent fortement que l'ASC est une population de cellules souches pluripotentes qui peuvent être facilement mis à jour etpropagées in vitro et induit vers les cellules des trois lignées germinales embryonnaires. Couplé à leur potentiel de régénération in vivo (pour revue, voir 4), l'ASC peut être un plus puissant pour les outils d'un chercheur ou un clinicien régénérative.

Figure 1
Figure 1. Manuel, l'isolement enzymatique des CSA humains à partir d'échantillons de lipoaspirat. A. Préparation pour l'isolement: Avant l'isolement des composants suivants doit être préparé: 1) 1x PBS (sans calcium ou de magnésium), stérilisé par autoclave, 2) une solution de 0,075 à 0,1% de la collagénase de type IA, préparé en 1x PBS et stérilisé par filtration en utilisant une unité de filtre de 0,22 um, 3) Contrôle moyen (CM) pour la culture ultérieure de la population de l'ASC. B. Isolement de l'ASCs: Un guide étape par étape pour l'isolement de la fraction stroma vasculaire (FSV) de lipoaspirates est affiché. Les étapes comprennent le lavage de la lipoaspirat avec stérile 1x PBS, digestion en utilisant la collagénase de type IA, collection de la SVF par centrifugation et la filtration SVF. Culture subséquente de la SVF se traduira par une population de fibroblastes adhérent contenant la population de l'ASC. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 2
Figure 2. Multi-lignage potentiel de différenciation de la population de l'ASC adhérent. Des cellules de la FSV cultivées résultat dans une population relativement homogène de adhérentes, CSA fibroblastiques. Induction de la population dans des conditions ASC résultats définis dans les cellules de la adipogénique, ostéogénique, chondrogénique, myogénique squelettique et lignées myogéniques lisses.En outre, les CSA peuvent également être différenciées en cellules de la lignée ectodermique, exprimant NeuN, un marqueur des neurones et de l'alpha-foetoprotéine (AFP), un marqueur de l'établi endodermique / lignée cellulaire hépatique. Quelques images d'histologie et immunofluorescence sont tirées précédemment publié des résultats 1,5,6,7,8,9. Différenciation lignée, avec la histologique, immunohistologique ou colorant fluorescent est affiché. Cliquez ici pour agrandir la figure.

profil d'expression
expression positive expression négative
CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e,
CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 		CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62E, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146,
HLA-DR, SMA, ABCG2
proposée phénotype des CSA
(Commun entre deux ou plusieurs études) 		CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a,
HLA-ABC, STRO-1 		CD11a, CD11b, CD11c, CD14,
CD31, CD45, CD106, CD144
marqueurs controversés CSA
(Résultats différents sur plusieurs études) 		CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR
stroma CEmarqueurs ll CD29, CD44, CD73, CD90, CD166
marqueurs hématopoïétiques CD31, CD34, CD45, ABCG2
marqueurs en commun entre deux ou plusieurs études indiqués en gras
SMA = actine musculaire lisse
HLA = antigène leucocytaire humain
ABCG2 = multi-drogue protéine transporteuse G2

Tableau 1. les profils d'expression de surface cellulaire de la CSA humaines.

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Discussion

Le tissu adipeux pour l'isolement des CSA peut prendre de nombreuses formes: à partir de morceaux de tissus solides obtenus par résection ou lipoplasty de petits morceaux obtenus soit par extraction de la seringue ou lipoplastie assistée par aspiration (c'est à dire la liposuccion). Que plus de cellules SVF (et donc CSA) peuvent être obtenus à partir d'échantillons de tissu adipeux résection ou aspiration n'est pas clair que les études contradictoires ont été présentées 16, 17. Il est possible que ce soit sous forme de tissu adipeux est plus que convenable pour l'isolement de cellules et les CSA SVF, tant que l'opérateur est compétent dans la technique de leur isolement. Toutefois, la liposuccion ne détient un avantage sur la résection qui est moins invasive et nécessite beaucoup moins de soins post-opératoires. Bien que les types de liposuccion ont augmenté au cours de la dernière décennie, y compris techniques, telles que l'échographie assistée, puissance assistée et la liposuccion assistée par laser 18, la plus courante reste liposuccion,dans lequel le compartiment adipeux est inondé de grandes quantités de solution saline stérile, des anesthésiques et des vasoconstricteurs avant aspiration 19. Le choix de la technique peut varier d'un chirurgien à chirurgien. Cependant, tandis que les moyens d'extraction peuvent sembler sans importance pour le chercheur, il est important de réaliser que la technique peut avoir un effet sur le nombre de ASC et la viabilité. Par exemple, l'augmentation de la pression de vide liposuccion peut avoir un impact négatif sur le rendement des cellules SVF 20. En outre, la diminution de la prolifération ASC ont été mesurés sur la liposuccion assistée par ultrasons 17.

Toutefois obtenu, la ponction doit être traitée rapidement que les températures de stockage peuvent avoir un impact viabilité SVF et le rendement de l'ASC éventuelle. Des études menées par Matsumoto et al. Ont montré que le rendement de l'ASC diminue si la ponction est stocké à la température ambiante pendant plus de 24 h 21. Le cas échéant, le stockage de 24 heures à 4 ° C peut être utilisée sans aucun effet délétères sur les propriétés biologiques de la population de l'ASC, mais, encore une fois, la viabilité des cellules peuvent diminuer si ce temps de stockage est augmentée au-delà de ce point. La facilité de transformation de lipoaspirat est directement liée à son volume global. Des volumes plus petits, obtenus par extraction de la seringue, sont relativement faciles à traiter. Cependant, les grandes aspirations de volume, obtenues par liposuccion, peuvent présenter des défis physiques. Par exemple, quelque chose d'aussi simple transfert de la graisse à partir du récipient d'aspiration de sorte qu'il peut être lavé peut poser des problèmes lorsque le volume d'aspiration est grande. Le protocole décrit dans cet article est destiné à atténuer certains de ces défis.

En gros, l'isolement des populations de l'ASC de lipoaspirates en utilisant la méthode enzymatique décrite dans cet article n'a pas beaucoup changé au cours des 10 dernières années. Il existe de nombreux protocoles disponibles sur PubMed qui sont excellents dans leur description de l'isolement des CSA de lipoaspirates. Most d'entre eux décrivent un protocole très similaire avec des modifications mineures. Fondamentalement, la lipoaspirat est lavé de contaminants, digéré par voie enzymatique pour libérer le SVF et le SVF, contenant la population de l'ASC, est recueilli par centrifugation. La plupart des grandes lipoaspirates de volume arrivent dans un certain type de récipient à vide - dont la configuration peut varier d'un chirurgien à chirurgien. Ce protocole préconise la suppression de l'aspiration dans un grand bêcher stérile avant le lavage, étant donné que le conteneur lui-même peut être une source de contamination si ce n'est pas correctement nettoyé avant de passer dans la hotte de biosécurité. Une fois transféré et on laisse se déposer par gravité, la ponction se sépare en trois couches: une partie supérieure, la couche d'huile qui résulte de la lyse des adipocytes matures, une couche adipeuse du milieu et une couche inférieure de la solution saline et de contaminer les cellules rouges du sang. La couche d'huile doit être enlevé comme nous l'avons remarqué qu'il peut être toxique pour les cultures de cellules résultant (observations non publiées). Aussi ce protocol recommande que le post ultracentrifugation du sérum physiologique des globules rouges et sera éliminée avant le premier lavage dans le but de diminuer le nombre potentiel de contamination des globules rouges, une fois les CSA sont mises en culture. Cependant, une étude réalisée par Francis et al. Ont suggéré que ce post ultracentrifugation peut également être une source de CSA 22. L'utilisation d'une pipette sérologique de 10 ml permet l'enlèvement de ce post ultracentrifugation relativement facile. Ce qui reste est la couche adipeuse qui peuvent ensuite être aisément lavée en utilisant du PBS stérile, ou si on le souhaite, du PBS stérile supplémenté avec des antibiotiques et des antimycotiques pour diminuer le risque de contamination de 23 à 25. Après le lavage, le tissu adipeux est digéré par voie enzymatique à l'aide d'une solution stérile de type collagénase IA. L'utilisation d'une unité de filtration telles que l'unité Millipore représenté sur cette vidéo combine un moyen commode de filtration de façon aseptique la collagénase dans un récipient fermé, à laquelle le tissu adipeux lavée peut être ajoutée pour la digestion subséquente au bain-marie à 37 ° C.

Le type de collagénase utilisée a varié d'un groupe à de la collagénase de type IA semblant être la plus répandue 1, 24, 25. Cependant, il existe plus de 11 types différents de collagénase disponibles dans le commerce, chacun ayant des affinités pour la digestion des tissus spécifiques. Pour la digestion du tissu adipeux, des sociétés telles que Sigma Aldrich recommandent types collagénase I et II et les deux types sont bien représentés dans la littérature d'aujourd'hui 1, 24-27. Dans leur article original, Zuk et al. Utilisent la collagénase de type IA obtenu à partir de sources bovine à une concentration de 0,075% 1. Cependant, la plupart des sources commerciales de la collagénase de type IA sont maintenant obtenus à partir de la bactérie Clostridium histolyticum anaérobies ou E. coli génétiquement modifié avec C. histolyticum gènes. Beaucoup de compagnies offrent de nombreuses préparations de collagénase de type IA, de brut à ceux préparés par précipitation au sulfate d'ammonium. Laprotocole décrit dans cet article JoVE utilise une préparation brute de la collagénase type IA qui contient non seulement des activités collagénase, mais également la protéase non spécifique, la clostripaïne et activités enzymatiques tryptiques. Bien que ces enzymes supplémentaires sont essentiels à l'efficacité de la digestion 28, il ya ceux qui déclarent un lot à la variabilité associée à la collagénase de type brut IA 28, 29 et augmentent leurs concentrations de la collagénase jusqu'à 0,2% pour obtenir une digestion efficace 23. Ces groupes en utilisant la collagénase de type IA brut recommandent également sa supplémentation avec de l'albumine de sérum bovin (0,1-1,0% de BSA) afin d'améliorer la performance de l'enzyme et d'augmenter la stabilité des cellules dans la matrice de tissu adipeux. Toutefois, cela peut ne pas être nécessaire, selon le protocole décrit dans cet article utilise la collagénase sans supplémentation en aucun effet négatif sur l'efficacité de la digestion.

Pour ceux qui souhaitent utiliser une collagénase échantillon plus définiosition, sources commerciales contenant de la collagénase hautement purifiée avec un mélange précis de protéases sont maintenant disponibles. Ces préparations purifient types collagénase de Clostridium I et II de haute activité et les combiner avec les activités de la protéase neutre connus, tels que la dispase et thermolysine. Digestion adipeux efficace en utilisant de la collagénase et de la thermolysine a été rapporté par Zachar et al. 27. En accord avec ce travail, Pilgaard et al. 30 déclarent aussi une excellente efficacité de la digestion en utilisant plusieurs mélanges de collagénase et de la thermolysine. Cependant, ils ne respectent une meilleure efficacité de la digestion en utilisant des préparations de collagénase et de la dispase.

les temps de digestion pour l'isolement de cellules du tissu adipeux peuvent varier d'une étude à l'. De nombreux protocoles publiés recommandent temps de digestion de 1-2 h 27, 30. Cependant, il est important de réaliser que les temps de digestion excessives peuvent en fin de compte affecter le nombre de AS viableCs et leur phénotype de cellule souche. Pilgaard et ses collègues ont déterminé que 2 h digestion à 37 ° C donne le meilleur équilibre entre la dissociation des tissus et la fonctionnalité de l'ASC 30, avec Zachar et al. Recommander que la digestion, passé 45 min, sera observée tous les 15 min jusqu'à maximum 2 h, à la digestion être arrêté une fois que le tissu adipeux prend un aspect plus homogène 27. Nous sommes d'accord avec cette recommandation. Cependant, il est de notre expérience que la plupart de type collagénase IA préparations à de 0,075 à 0,1% sont capables de digérer de grandes quantités de lipoaspirates en 30-45 min et que ces temps sont suffisants pour libérer un nombre suffisant de cellules. Par conséquent, ce protocole recommande un temps de digestion de 30 min. Si plus de temps est requise, la consistance de la lipoaspirat doit être surveillée et la digestion arrêtée lorsque le lipoaspirat assume une "crème" ou l'aspect "soupy" (figure 1).

Une fois èmee la digestion est terminée, l'isolement de la FSV publié s'effectue simplement en utilisant la centrifugation. Cependant, comme la pression de l'aspiration, des effets physiques de centrifugation peuvent avoir un effet sur la viabilité SVF et le nombre des CSA disponibles pour la culture. Une étude menée par Kurita et ses collègues 31 ont montré que des vitesses supérieures à 3000 xg peuvent endommager l'ASC. Cependant, les vitesses doivent être suffisamment importantes pour assurer la granulation adéquate de la FSV. En règle générale, la plupart des protocoles, y compris celui-ci, recommandent une vitesse de centrifugation de 1.200-1.500 x g. Des précautions doivent être prise par le chercheur pour s'assurer qu'ils comprennent la relation entre la force centrifuge (mesurée en g) et la vitesse de centrifugation (rpm) mesurées comme, comme la relation dépend de la centrifugeuse rotor spécifique. Cependant, en règle générale, des forces centrifuges plus faibles, telles que 1200 x g, sont souvent équivalent à la vitesse de centrifugation et en toute sécurité peuvent être utilisés de manière interchangeable.

Après filage, plusieurs diStinct couches sont observées dans le tube de centrifugation (figure 1): une couche supérieure d'huile et les adipocytes blancs "pelucheux", une couche intermédiaire et de la collagénase un culot cellulaire. La pastille elle-même peut avoir deux couches distinctes: une couche supérieure de globules rouges et une pastille de SVF blancs inférieure, contenant les CSA. Ce protocole préconise l'aspiration minutieuse de l'huile et des adipocytes, comme l'huile peut être toxique pour la culture cellulaire et les adipocytes ont été montrés capables de retourner à une dédifférenciation plus primitive type de cellule 32. Cependant, ces adipocytes peuvent être récoltés à ce stade si désiré. En raison de ces contaminants, ce protocole recommande un lavage supplémentaire pour assurer leur élimination adéquate. Cette étape permet également au chercheur de combiner plusieurs pastilles SVF pour faciliter la suite de la filtration. La filtration est susceptible d'être nécessaire en raison de la présence de gros morceaux de matière fibreuse et les agrégats cellulaires suivantes digestion. Ces matériaux sont facilement enlevéspar simple filtration par gravité à travers 70 ou 100 filtres à tamis um. Une aliquote du filtrat peut être prise afin de compter le nombre de cellules nucléées si désiré et le filtrat restant plaqué pour ASC respect et l'expansion.

Malgré les tentatives diligentes pour éliminer autant que possible les globules rouges, pas de préparation de l'ASC sera totalement sans contamination RBC. Dans notre article original, nous avons proposé la suppression de ces globules rouges par la remise en suspension du culot dans une solution hypotonique de 160 mM NH 4 Cl. La majorité des articles d'isolement suivantes contiennent cette étape et de recommander l'utilisation de NH 4 solutions basées sur Cl ou de l'eau stérile 22-24, 27, 33, mais il faut prendre soin en cas d'utilisation de l'eau stérile, de minimiser le temps les cellules de la FSV sont exposés à la solution hypotonique 27. Toutefois, cette étape peut ne pas être nécessaire que les globules rouges sont une population de cellules non-adhérentes et peuvent être facilement enlevés après une culture de nuit dela population de l'ASC. En outre, si au mieux anecdotiques, ces globules rouges semblent améliorer l'expansion initiale des cellules adhérentes résultant (Zuk, observations non publiées). En tant que tel, ce protocole élimine l'étape de lyse RBC et propose que les cultures de l'ASC initiales soient autorisés à se développer dans la présence de ces globules rouges pour les 3-4 premiers jours sans changement de milieu de culture. La raison de cette observation peut être due à un certain type de signalisation paracrine de contaminer les cellules du sang ou peut être simplement due à une meilleure viabilité à l'exclusion de l'étape de lyse RBC. Suite à cela, le milieu de culture peut être aspiré et la majorité des globules rouges éliminé par lavage doucement les plaques avec du PBS 1x stérile. Au fil du temps, des globules rouges restants finiront par mourir et être retiré de la culture.

Des études menées par Zachar et Boquest ont estimé que 25-50% de la pastille SVF remis en suspension adhère à la culture de tissus en plastique 23, 27. Le "passage 0" ASC cu résultantltures sont hétérogènes, composé de petites cellules rondes que l'on croyait CSA et cellules de forme irrégulière plus proposés à être endothéliale à l'origine. Alors que les études par de nombreux groupes, y compris la nôtre ont confirmé l'absence de contamination des types cellulaires tels que les CML, cellules hématopoïétiques et des fibroblastes en cultures ASC 1, la présence de types de cellules supplémentaires ne peut pas être exclue. . Effet, Tallone et al a caractérisé passage 0 cultures et observé quatre populations distinctes: 1) petit, rond, cellules renouvellent rapidement, 2) des cellules fibroblastes fusiformes pensé pour être l'ASC, 3) reproduisant lentement grandes cellules avec un plus restreintes potentielles (par exemple des pré-adipocytes) et 4) cellules endothéliales cubiques qui sont perdus avec le passage 34. Des études ultérieures ont montré que le cycle, le renouvellement rapide de la population de cellules possède le plus haut multipotentialité et exprimer des marqueurs typiques de cellules souches 35, 36. En outre, ils peuvent former des "sphéroïdes" en raison deleur prolifération rapide et sont souvent entouré par des fibroblastes fusiformes. En tant que tel, il est possible que la forme de la broche population ASC proposé ci-dessus peuvent provenir de ces cellules. Suite à l'expansion initiale de ces cultures passage 0 de SVC, on pense que la culture continue dans le temps pour l'ASC sélectionne, avec les cultures obtenues en supposant un plus fibroblastique, composition homogène. Cependant, les restes de cellules contaminantes ne peuvent pas être totalement exclues et, par conséquent, la population de l'ASC devrait encore être considéré comme hétérogène.

Alors que le protocole décrit dans cet article est très simple, peu coûteuse et ne nécessite pas de pièces d'équipement ne trouve normalement pas dans une installation de culture de tissu, elle présente l'inconvénient de nécessiter une telle installation. De nombreuses études se sont penchées sur les applications de translation de CSA par les modèles animaux et des études cliniques utilisant l'ASC ont commencé à apparaître (pour revue voir 4

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Disclosures

Les auteurs de ce manuscrit sont co-inventeurs sur un brevet détenu par les Régents de l'Université de Californie et autorisé à Cytori Therapeutics.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier les personnels de recherche supplémentaires qui ont contribué à l'élaboration du protocole décrit et son isolement du CSA, y compris: le Dr H. Peter Lorenz, MD, le Dr Hiroshi Muzuno, MD, le Dr Jerry Huang, MD , le Dr Adam Katz, MD, le Dr William Futrell, MD, le Dr Zhang Rong, DDS, PhD, le Dr Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, et le Dr John Fraser, PhD. Les résultats présentés ont été financés, en partie, par des subventions de recherche des Instituts nationaux de la santé, y compris les NIAMS et NIDCR Instituts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) Mediatech Cellgro 10-013-CV with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin Mediatech Cellgro 30-002-CI 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B Mediatech Cellgro 30-003-CF 250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline) Mediatech Cellgro 25-053-CI without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA Mediatech Cellgro 20-031-CV 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) Sigma C2674 crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated Gemini Bioproducts 100106 USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-104
25 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes Genesee Scientific 21-106
100 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-202
150 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-203
500 ml Stericup Filter Units Millipore SCGPU05RE PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers FisherBrand 22-363-549 100 μm nylon mesh
dexamethasone - water soluble Sigma D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate disodium salt Sigma G-9422 also known as glycerophosphate
insulin Sigma I-6634 made from bovine pancreas
indomethacin Sigma I-7378
apo-transferrin Sigma T-4382
TGFβ1 R&D Systems 240-B-002 recombinant human
Oil Red O Sigma O-0625
Alcian Blue Sigma A-5268
Silver nitrate Sigma S-0319
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 supplied as a 16 % stock
Name Company Catalog Number Comments
Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood Thermo Scientific ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge Hermle Labnet Z383 Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg
Water bath Fisher Scientific Isotemp S52602Q 5-10L capacity, capable of 37C
Automated Pipette Aids Drummond Pipette Aid XL 4-000-105
CO2 Incubator Thermo Scientific Forma 310 direct heat or water jacketed

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Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates. J. Vis. Exp. (79), e50585, doi:10.3791/50585 (2013).

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