Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Zusammenfassung

Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden.

Zusammenfassung

Kultivieren von Zellen in 3D auf entsprechenden Gerüsten wird gedacht, um besser imitieren die In-vivo-Mikroumgebung und erhöhen die Zell-Zell-Interaktionen. Das resultierende 3D-Zellkonstrukt kann oft mehr relevant für die Untersuchung der molekularen Ereignisse und Zell-Zell-Interaktionen als vergleichbare Experimente untersucht in 2D. Um wirksam zu 3D-Kulturen mit hoher Zelllebensfähigkeit in der gesamten Gerüst erstellen die Kulturbedingungen, wie Sauerstoff und pH-Wert müssen sorgfältig wie Gradienten in Analyt-Konzentration gesteuert werden kann in der gesamten 3D-Konstrukt existieren. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren und deren Einbau in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste sowie deren anschließende Herstellung für die Kultur von Säugetierzellen. Die pH anspricht Gerüste können als Werkzeuge zur pH der Mikroumgebung innerhalb eines 3D-Zellkonstrukt bestimmen werden. Darüber hinaus haben wir ausführlich die Lieferung der pH-Wert reagieren nanosensors auf die intrazelluläre Umgebung von Säugerzellen, deren Wachstum durch elektro PLGA Gerüste unterstützt. Die zytoplasmatische Lokalisierung der pH anspricht Nanosensoren können verwendet werden, um intrazellulären pH (pHi) im laufenden Experimenten überwachen.

Einleitung

Eine Schlüsselstrategie im Tissue Engineering ist die Verwendung von biokompatiblen Materialien, um Gerüste, deren Morphologie ähnelt das Gewebe, es geht zu ersetzen und ist auch in der Lage ist das Zellwachstum und Funktion ^1,2 herzustellen. Das Gerüst mechanischen Halt, indem die Zellhaftung und Proliferation ermöglicht Zellmigration noch in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt. Das Gerüst muss auch für den Massentransport von Zelle Nährstoffe zu ermöglichen und Abtransport von Stoffwechsel ³ nicht hemmen.

Elektro wurde als vielversprechendes Verfahren zur Herstellung von polymeren Gerüsten in der Lage ist das Zellwachstum ^4-6 entstanden. Die hergestellten Vlieselektrogesponnenen Fasern sind für das Zellwachstum, wie sie sind oft porös und ermöglichen Zell-Zell-Wechselwirkung als auch die Zellmigration in den Zwischenräumen eines 3D-Zellkonstrukt ^7. Es ist wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen während t überwachener Kulturperiode und diese Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten ist in der gesamten 3D-Konstrukt erhalten. Beispielsweise Kulturbedingungen, wie beispielsweise Sauerstoff und pH erfordern eine sorgfältige Kontrolle, wie Gradienten in Analytkonzentration innerhalb des 3D-Konstrukt vorhanden sind. Bioreaktoren oder Perfusions-Systeme eingesetzt werden, um in vivo-Bedingungen der interstitiellen Fluss und als Ergebnis Anstieg Nährstofftransfer und Stoffwechselabfallbeseitigung ⁸ imitieren. Die Frage, ob solche Systeme eine konstante Mikroumgebungsbedingungen, kann durch die Beurteilung der zellulären Mikroumgebung in Echtzeit behandelt werden.

Schlüssel Mikro Metriken, die in Echtzeit überwacht werden könnten, umfassen: Temperatur, chemische Zusammensetzung der Zellmedien, die Konzentration von gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid, pH-Wert und Feuchtigkeit. Von diesen Messdaten kann die Temperatur am leichtesten überwacht werden unter Verwendung von in situ-Sonden. Methoden für die Überwachung der übrigen aufgeführten Kennzahlen häufig involve Entfernung eines aliquoten für die Probenahme und deshalb stören die Zellkultur und das Kontaminationsrisiko zu erhöhen. Kontinuierliche Echtzeit-Methoden werden gesucht. Aktuelle Überwachungsmethoden der Regel verlassen sich auf Instrumente, die körperlich untersuchen die zelluläre Konstrukt wie einem pH-Monitor oder Sauerstoffsonde. Allerdings können diese invasiven Methoden der zellulären Konstrukt schädigen und stören den laufenden Experiments. Nichtinvasive Überwachung des Analyt-Konzentrationen in der 3D-Konstrukt konnte die Echtzeitüberwachung von verschiedenen Umweltaspekte wie Nährstoffverarmung ⁹ zu ermöglichen. Dies würde Beurteilung der Nährstoffzufuhr in tiefere Regionen innerhalb der Struktur zu ermöglichen und zu bestimmen, ob Stoffwechselschlacken wurde effektiv ^10,11 entfernt. Systeme, die mit der Frage der Invasivität ehen versuchen im allgemeinen die Verwendung eines Durchblutung Kammer, die Kulturmedium sowohl durch das Kulturgefäß und an externe Sensoren geht auf pH-Wert, Sauerstoff-und Glukose-Monitor ^12. DieRe ist ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung Sensoren, die direkt in das Kulturgefäß, das keine Entfernung eines Aliquots zum Abtasten erfordern und als solche in-situ-Überwachung vorsehen würde integriert werden können.

Um solche Mängel zu adressieren in situ und nichtinvasive Überwachung des Mikroumgebungsbedingungen haben wir Analyten reagiert Nanosensoren in die elektro Gerüste eingebaut, um Selbst-Berichterstattung Gerüste ¹³ zu produzieren. Leitschienen, die als Sensoren wirken durch Überwachen Fluoreszenzaktivität vorher hergestellt worden ist, wobei die Erfassungsvorrichtung entweder die tatsächlichen Polymergerüst die durch Elektrospinnen oder durch den Einsatz eines Analyten ansprechenden Farbstoff, der in das Polymer vor der Gerüstbildung ^14,15 aufgenommen wird . Allerdings haben diese Messvorrichtungen das Potenzial, fehlerhafte optische Ausgänge durch mögliche Störungen von anderen Analyten verursacht zu geben. Die Verwendung eines ratiometrischen Erfassungseinrichtung such wie in dem beschriebenen Protokoll hergestellt hält das Potential, diese mögliche Nebenwirkungen zu beseitigen und eine Antwort für den Analyten spezifisch in Frage.

Die hier vorgestellten elektro Gerüste wurden aus dem synthetischen Copolymers Poly (milch-co-Glykolsäure) (PLGA) erstellt wurde, durch ausgewählte, die Food and Drug Administration (FDA) die Genehmigung, die aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit und Biokompatibilität und eine Spur Rekord, das Wachstum und die Funktion der verschiedenen Zelltypen ^16-18. Die vorbereiteten ratiometrischen Analyt reagiert Nanosensoren reagieren auf pH-Wert. Die Nanosensoren sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffe in ein Sol-Gel biokompatiblen Matrix, einen Farbstoff, FAM ist in Reaktion auf pH-Wert und die andere wirkt TAMRA als interner Standard, da es nicht in Reaktion auf pH-Wert. Ferner die Fluoreszenz sowohl des FAM und TAMRA separat analysiert, da sie nicht wesentlich überlappen. Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenz EMISsion beider Farbstoffe bei bestimmten Wellenlängen einen pH-Antwort unabhängig von anderen Umgebungsbedingungen. Die selbst Berichterstattung Gerüste könnten Wiederholungs Beurteilung der pH-Wert in situ und in Echtzeit ermöglichen, ohne dass der entwickelte 3D-Modell. Wir haben gezeigt, dass diese Gerüste sind in der Lage ist die Zellhaftung und-proliferation und weiterhin in Reaktion auf den Analyten in Frage. Die Kinetik der sauren Nebenprodukte in Konstrukte bleibt under und als solche mit den pH anspricht Gerüste könnte erheblich erleichtert diese Untersuchungen ^19. Darüber hinaus stellt die Verwendung der Selbstberichts Gerüste für Tissue-Engineering-Anwendungen die Möglichkeit, vollständig zu verstehen, zu überwachen und optimieren das Wachstum von 3D-Modell in vitro Gewebekonstrukte, nicht-invasiv und in Echtzeit.

Die pH-Nanosensoren reagieren auch auf die intrazelluläre Umgebung von Fibroblasten auf PLGA elektro Gerüsten kultiviert geliefert wordends. Das Verhältnis der Fluoreszenzemission von der Farbstoffe wurden verwendet, um pHi überwachen und im Vergleich zu einem Selbst-Berichterstattung Gerüst Einarbeiten pH Nanosensoren. Die Lieferung von Nano Zellen in einer 3D Umgebung kultiviert konnte Überwachung Analytkonzentration tief innerhalb des Konstrukts in einer zerstörungsfreien Art und Weise zu ermöglichen. Daher Nanosensoren kann eine tragfähige Imaging-Tool, um zerstörungsfrei beurteilen Zellverhalten im gesamten 3D-Konstrukte ermöglicht langfristige Analyse sein. Screening der Analytkonzentration von einzelnen Zellen in einer 3D-Konstrukt könnte sicherstellen, dass sie ausreichend mit Nährstoff-und Sauerstoffkonzentrationen. Überwachungsverfahrensparameter konnte bei der Entwicklung von standardisierten Techniken zur effektiven Massentransport von Sauerstoff und Nährstoffen zu unterstützen. Die Lieferung von Nanosensoren auf die intrazelluläre Umgebung und Einbau von Nanosensoren in polymere Gerüste könnten kombiniert werden, die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen sowie Gerüst Leistung in 3D const ermöglichenructs während der Gewebewachstumsprozess. Dies kann zu mehr Wissen dieser Konstrukte führen und Fortschritte die Herstellung von biologisch relevanten Gewebeersatz.

Protokoll

Überblick

Abschnitt 1 beschreibt die Herstellung von pH-Wert reagieren Nanosensoren und Charakterisierung von Nanosensor Reaktion auf pH-Wert mit Fluoreszenzspektroskopie und ihrer Größe mit SEM.

Abschnitt 2 beschreibt die Herstellung von elektroPolymerGerüsten und Charakterisierung von ihrer Morphologie und Größe mit SEM. Abschnitt 2 beschreibt auch die Herstellung von Selbstberichts Gerüste, die elektro Gerüste mit der Aufnahme der pH-Wert reagieren Nanosensoren sind. Die daraus resultierenden Selbstberichts Gerüste werden von SEM charakterisiert, um zu beurteilen, ob morphologische Veränderungen der elektrogesponnenen Fasern ist aufgetreten. Die Fluoreszenz von den Selbstberichts Gerüste aus den Nanosensoren eingearbeitet resultiert, wird durch konfokale Mikroskopie beurteilt.

Abschnitt 3 beschreibt die Kultur der Zellen auf die elektro Gerüst und die Selbstberichts Schafott. Die Gerüste werden zunächst in preparat sterilisiertIonen für die Zellkultur, die die folgenden Gerüsten werden bewertet, um zu bestimmen, ob die Sterilisation und die Kultur von Zellen auf die Fluoreszenzfähigkeit der Selbstberichts Gerüsten. Das Protokoll beschreibt auch die Lieferung von Nanosensoren auf Zellen, die auf elektro Gerüste kultiviert werden. Lysotracker Farbstoff wird verwendet, um sicherzustellen, dass Nanosensoren nicht in die zellulären sauren Kompartimenten entnommen.

1. Herstellung und Analyse von pH Responsive Sol-Gel-Nanosensoren

1.1 Herstellung von pH Responsive Sol-Gel-Nanosensoren

Hinweis: Diese Vorbereitung sollte in einem Abzug durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Fluorophore zur Verwendung im pH-Nano durch Auflösen von 5 - (und-6)-Carboxyfluorescein, Succinimidylester (FAM-SE) (1,5 mg) in Dimethylformamid (DMF) (1 ml) in einem Rundkolben und 6-Carboxytetramethylrhodamin , Succinimidylester (TAMRA-SE) (1,5 mg) in DMF (1 ml) in einem anderen Rundkolben.In 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) (1,5 ml) zu jedem Kolben und rühren unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre (21 ° C) für 24 Stunden in der Dunkelheit dh wickeln die Proben in Folie.
2. Alle beide der obigen Farbstoffe (250 ul) zu einer Mischung von Ethanol (6 ml) und Ammoniumhydroxid (30 Gew.%, 4 ml) in einem Rundkolben enthalten und rühre 1 Stunde (21 ° C).
3. Langsam Tetraethylorthosilikat (TEOS) (0,5 ml) zu dem Gemisch, weiterhin zugegeben und für weitere 2 Stunden. Die Mischung wird trüb. Die Nanosensoren können durch Rotationsverdampfung gesammelt werden. Nanosensoren können in einem Glasfläschchen bei ^{4 º} C zur weiteren Verwendung gelagert werden.
   
   ACHTUNG: die weitere Handhabung der Nanosensoren in ihrer trockenen Form sollte in einem Abzug oder im Fall der Verwiegung, die Balance sollte beigefügt werden, zum Beispiel in einem Weighsafe durchgeführt werden.

1.2 Nanosensor Antwort auf pH

1. Bereiten Sørensen Phosphatpufferlösungen von pH 5,5 bis 8,0 von mixing spezifische Verhältnisse von Mononatriumphosphat (0,2 M) und Natriumhydrogenphosphat (0,2 M) stock-Lösungen. Überprüfen Sie die endgültige pH-Wert mit einem pH-Meter. Machen keine geringfügige Anpassungen der pH-Wert mit Natriumhydroxid (NaOH) (4 M) oder Salzsäure (HCl) (2 M).
2. Hängen Sie das pH-Nanosensoren in den pH-Puffer (5 mg / ml), indem zunächst die Haltegefäß, das die Nanosensor-Lösung auf einem Vortex 3 min dann das Eintauchen des Schiffes in einem Ultraschallgerät, bis die Lösung trüb wird (ca. 5 min). Wiederholen Sie diese Schritte, um die Nanosensoren in Lösung vollständig auszusetzen.
3. Legen Sie die erste Lösung in einem optischen Küvette und verwenden Anregungswellenlängen von 488 nm für 5 - (und-6)-Carboxy-(FAM) und 568 nm für 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA). Sammeln Sie die Emissionswellenlängen bei 500 bis 530 nm für FAM und 558-580 nm für TAMRA mit einem Fluoreszenz-Spektrometer.
4. Ändern der Lösungen in der optischen Küvette, so daß der pH-Wert kann bei unterschiedlichen pH beobachtet werden und weiterhin collecting die Emissionsspektren.
5. Berechnen des Verhältnisses der bei jedem pH-Wert erzeugt, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen Emissionsmaxima.

1.3 SEM von Nanosensoren

1. Legen Sie eine Probe der Nanosensoren auf eine Kohlenstoff beschichtet Elektronenmikroskop Stub-und Sputter-Mantel mit Gold für 5 min unter Argonatmosphäre.
2. Beobachten durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Während der Bilderzeugung einzustellen den Arbeitsabstand, Spannung und Vergrößerung der Elektronenladung (1) zu minimieren.

2. Herstellung und Analyse von PLGA Scaffolds

2.1 Das Elektro PLGA Scaffolds

1. In einer Abzugshaube lösen Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) in Dichlormethan (DCM) (20% (w / w)) mit Pyridinium-Formiat (PF) (1% (w / w)). Platzieren der Lösung in einen 10-ml-Spritze mit einer 18 G Nadel stumpf Füllung und sicheren Sitz mit einer Spritzenpumpe.
2. Entfernung der Nadelspitze 20 cm von einem 20cm x 15 cm Aluminium-Sammelplatte.
3. Befestigen der Elektrode von einer Hochspannungsstromversorgung mit der Spitze der Spritze und der Erde, um die Aluminiumsammelplatte.
   
   VORSICHT: Achten Sie darauf, wie Hochspannung wird verwendet, dh immer schalten die Stromversorgung aus, bevor Umgang mit einem der Elektrogeräte werden.
4. Geben Sie sich die Lösung unter Verwendung eines konstanten Fließgeschwindigkeit von 3,5 m / h bei 12 kV für 2 Stunden. Elektrospinning mit diesen Bedingungen geben ein Gerüst Tiefe von etwa 60 um.
5. Lassen Sie das Gerüst in einem Abzug für 24 Stunden, damit Lösungsmittelreste zu verdampfen.

2.2 Das Elektro pH Responsive PLGA Scaffolds

1. Bereiten Gerüste Einbeziehung pH-Wert reagieren Nanosensoren wie in Abschnitt 2.1, aber mit der Modifikation, dass Nanosensoren zur Polymerlösung (5 mg / ml) beschrieben. Suspend die Nanosensoren in der PLGA-Lösung mit Hilfe der Ultraschallbehandlung (ca. 5 min) vor dem Platzieren in einen 10-ml-Spritze.

2.3 SEM von PLGA Gerüst-und pH-Responsive Gerüst

1. Legen Sie eine Probe des PLGA-Gerüst-oder pH-Gerüst reagiert auf eine Kohlenstoff beschichtet Elektronenmikroskop Stub und gehen Sie wie bei SEM von Nanosensoren (Abbildung 1) beschrieben.

2.4 Kalibrierung von pH Responsive Gerüst

1. Legen Sie eine Probe der pH-Wert reagieren Gerüst in eine 35 mm Kulturplatte und tauchen in geeigneten Pufferlösungen.
2. Auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 488 nm Argon-Laser, um die FAM und einem 568 nm Krypton-Laser, die in den Nanosensoren TAMRA erregen erregt. Beachten Sie die Fluoreszenzemission für pH reagiert Gerüste bei 500-530 nm für FAM und 558-580 nm für TAMRA. (Abbildung 2). Verwenden sequentielle Scannen Sammlung von Anregungswellenlängen zu vermeiden.

3. Zellkultur auf PLGA Scaffolds und pH-Responsive PLGA Scaffolds

ntent "> Hinweis: Die folgende Beschreibung ist in einem Zellkulturschrank durchgeführt werden.

3.1 Herstellung von PLGA Scaffolds für die Zellkultur

1. Schneiden Sie die PLGA-oder pH-Wert reagieren PLGA Scaffolds in 2 cm ² Stück.
2. Sterilisieren Gerüste durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht (UV) in einem Abstand von 8 cm für 15 min auf jeder Seite.
3. Übertragen Sie die Gerüste zu einer 12-Well-Kulturplatte und legen Sie eine Stahlring an der Spitze. Eine Lösung von Penicillin / Streptomycin (5% v / v) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf der Innenseite und der Außenseite des Stahlrings, über Nacht inkubiert (37 ° C, 5% CO _2). Hinweis der Stahlring wurde an der Universität von Nottingham hergestellt und hat folgende Abmessungen: Außendurchmesser 2 cm, 1 cm Innendurchmesser von 1 cm Tiefe.
4. Entfernen Sie die Sterilisationslösung und waschen mit PBS.
5. Hinzufügen Zellkulturmedien auf die Innenseite (500 ul) und außerhalb (500 ul) des Stahlrings, in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂ ) während der Vorbereitung einer Zellsuspension.
6. Bereiten Sie eine Zellsuspension und führen Sie eine Zellzahl mit einer Trypanblau-Ausschluss-Assay.
7. Erstellen einer Zellsuspension bis zu einer Zellzahl von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml zu erreichen.
8. Entfernen Medien von der Innenseite und Außenseite des Stahlrings.
9. Ersetzen mit vorgewärmtem Zellkulturmedium auf der Außenseite des Stahlrings (1 m).
10. In 300 ul der Zellsuspension auf der Innenseite der Stahlring - Felsplatte hin und her vorsichtig, um Zellen zu verteilen.
11. Setzen Sie den Zellkulturplatte in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎ - sollte die Zellhaftung innerhalb von 24 Stunden genommen haben, aber Kultur weiterhin so lange wie das Experiment erfordert - erfrischend die Medien alle 2-3 Tage.

3.2 Nanosensor Lieferung Cells auf PLGA-Gerüst kultiviert

1. Seed Zellen auf PLGA-Gerüst, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Für diese Studie eine leere PLGA-Gerüst (nicht Containing Nanosensoren) wurde aufgrund der Überlappung der Fluoreszenzemission verwendet bei der Abbildung.
2. Küvette ausgesät Gerüst in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎ für 72 Stunden, damit die Zellen wachsen und in dem Gerüst vor der Auslieferung Nano migrieren.
3. Vor der Auslieferung Nanosensor (37 ° C, 5% CO ₂₎ Waschen Sie die Zellen mit PBS und ändern Sie das Medium aus Standard-Kulturmedien Antibiotika und Serum-freie Medien, Inkubation für 1 Stunde. Hinweis: Standardkulturmedien für 3T3-Zellen besteht aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit fötalem Kälberserum (10% (v / v)), L-Glutamin-Lösung (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1% (v / v)) .
4. Während der Inkubationszeit bereiten die Nanosensor-Liposom-Komplex durch kurzes Beschallen Nanosensoren (5 mg) mit Optimem (50 ul) der Lösung A erstellen
5. Lösung B erstellen, indem Lipofectamine 2000 (5 ul) zu Optimem (45 ul), Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
6. In LösungA zu Lösung B, Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min Lösung C, die der Nanosensor-Liposom-Komplex zu bilden.
7. Lösung C (100 ul) zu den Zellen und inkubiert (37 ° C, 5% CO ₂₎ für 3 Stunden.
8. Entfernen Sie die Zelle ausgesät Gerüste aus dem Inkubator, absaugen Medien und zweimal waschen mit PBS, bevor PBS (1 ml), um Live-Cell-Visualisierung durch konfokale Mikroskopie zu ermöglichen. Hinweis: PBS wurde in diesem Protokoll verwendet, so daß der Indikator Phenolrot in Zellkulturmedium nicht vorhanden Autofluoreszenz verursachen und auch, weil eine Kalibrierung bei verschiedenen pH-Wert durchgeführt wird. Allerdings könnte Phenolrot freien Medien für längerfristige Analyse von Zellkulturen verwendet werden.
9. Tauchen der Zelle seeded Gerüst in Puffern mit unterschiedlichen pH-und überwacht die Reaktion der Nano mit den Zellen verbunden.
10. Überwachen Sie die pHi durch Bestimmung des Verhältnisses der Fluoreszenzintensitäten von FAM und TAMRA durch Beobachtung Fluoreszenz mittels konfokaler Mikroskopie (Figure 3).

3.3 Nanosensor Lage im Säugetierzellen

1. Inkubieren Zellen mit Nanosensoren, die nur die, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben FAM-Farbstoff (das ist, weil die Fluoreszenzemission von TAMRA ist in der gleichen Region wie die LysoTracker Rot). Bereiten Sie diese Nanosensoren wie in Abschnitt 1.1, aber mit dem Wegfall der Vorbereitung und Zugabe TAMRA beschrieben.
2. Nach der Nanosensor Lieferfrist verdünnen LysoTracker Red-Stammlösung zu 50 nM.
3. In einen aliquoten Teil des verdünnten Lösung (2 ul), um Zellen auf PLGA Scaffolds kultiviert.
4. Inkubieren der Zellen mit LysoTracker Red 1 h (37 ° C, 5% CO _2).
5. Nach der Inkubationsperiode entfernen Medien und wasche die Zellen zweimal mit PBS (pH 7,4) vor dem Wechsel der Medien zu PBS (pH 7,4) (2 ml) in Vorbereitung für die Anzeige mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Hinweis: Phenolrot freien Medien könnte anstelle von PBS verwendet werden.
6. Fügen Sie die Kernfärbung Draq5 zum PBS so die Endkonzentration 5 &mgr; M und Inkubation mit den Zellen für 3 min (37 ° C 5% CO _2). Es ist nicht notwendig, um die Medien nach der Inkubationszeit mit DRAQ5 ändern.
7. Verwenden Sie einen 488-nm-Argon-Laser, um die FAM nur Nanosensoren anzuregen, eine 568 nm Krypton-Laser, um die LysoTracker Rote und 633 nm Helium / Neon-Laser zu erregen, um die DRAQ5 Chromophor begeistern und zu beobachten Fluoreszenz bei 500-530 nm, 580 bis 600 nm, 650 -750 Nm (Abbildung 3). Verwenden sequentielle Scannen Sammlung von Anregungswellenlängen zu vermeiden.

Ergebnisse

Die Größenverteilung der hergestellten pH-Wert reagieren Nanosensoren wurde mit SEM, wo die Bevölkerung von Nanosensoren abgebildet wurden gemessen und mit Nanometer-Dimensionen im Bereich von 240 bis 470 nm (Abbildung 1A) gekennzeichnet haben. Das Erreichen einer engen und relativ kleinen Durchmesser ist konsistent mit der Verwendung der Stöber-Methode, um Nanopartikel herzustellen. Es wurde festgestellt, dass mit einem basischen pH-Umgebung während der Synthese von Nanopartikeln, dh Nanoparti...

Diskussion

Tissue Engineering strebt biologischen Ersatz zu schaffen, die sowohl in vivo wie in vitro Gewebemodellen und in Gewebeersatztherapie verwendet werden können, um zu reparieren, zu ersetzen, aufrecht zu erhalten oder zu verbessern die Funktion eines bestimmten Gewebe oder Organ. Synthetische Ersatzstoffe verwendet wurden, für viele Jahre zu Hilfe Reparatur von Gewebe zu ersetzen oder aber diese oft nicht aufgrund der schlechten Integration in das Wirtsgewebe und / oder Infektion, die letztlich zu Ablehn...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ethanol	Fisher	32221
wasserfreies Dimethylformamid (DMF)	Sigma	270547
Ammoniumhydroxid 50% (v/v) wässrige Lösung	Alfa Aesar	35574	verdünnt auf 30% (v/v) mit reinem Wasser
TEOS	Sigma	13190-3
3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES)	Sigma	A3648
5-(und-6)-carboxyfluorescein, succinimidylester (FAM-SE)	Invitrogen	C1311
6-carboxytetramethylrhodamin, succinimidylester (TAMRA-SE)	Invitrogen	C1171
Natriumphosphat monobasisch (0,2 M)	Sigma Aldrich	S-9638
Natriumphosphat zweibasisch (0,2 M)	Sigma Aldrich	S-0876
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich	T4174
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
PBS	Sigma Aldrich	D8537
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
FBS	Quelle Bioscience	Batch-213-101992
L-Glutamin	Sigma Aldrich	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Optimem	Invitrogen	11058-021
LysoTracker Red	Invitrogen	L-7528
Draq5	Biostatus Ltd	DR50050
Stickstoffgas	BOC
DCM	Sigma Aldrich	320269
TFA	Sigma Aldrich	T6508
Konfokalmikroskop	Leica TCS-SP		ausgestattet mit Argon- und Krypton-Lasern und einer 63X 0,9NA Wasserimmersionslinse
	UVLS28 UVP, USA
Rührplatte	SB161-3 Jencons-PLS
pH-Meter	Jenway Modell 3510
Rotationsverdampfer	Büchi Rotary Verdampfer R200
Zentrifuge (Nanosensoren)	Hermle Z300
Zentrifuge (Zellkultur)	Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
Vortex	Wirbelmischer Fisherbrand
Ultraschallgerät	FB11021 Fisherbrand
Aluminiumblech	Nottingham University
35mm Zellkulturplatte	Iwaki	3000035
10 ml Spritze	Becton Dickenson
3T3 Fibroblastenzellen	Europäische Sammlung von Zellkulturen
PLGA	Lakeshore Biomaterials	7525 DLG 7E
Pyridinium Formiat	Sigma Aldrich	P8535
Trypanblau	Sigma Aldrich	T8154
Natriumphosphat einbasisch	Sigma Aldrich	S9638
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma Aldrich	S5136
HCl	Sigma Aldrich	320331