Programmering stamceller til terapeutiske Angiogenesis Brug Bionedbrydelig Polymere Nanopartikler

Summary

Vi beskriver fremgangsmåden til programmering stamceller at overudtrykke terapeutiske faktorer for angiogenese brug af bionedbrydelige polymere nanopartikler. Beskrevne fremgangsmåder omfatter polymersyntese, transfektion af adipøst afledte stamceller in vitro, og validere effektiviteten af programmerede stamceller til fremme af angiogenese i en murin bagben iskæmi.

Abstract

Kontrolleret vaskulær vækst er kritisk for en vellykket vævsregeneration og sårheling, samt til behandling af iskæmiske sygdomme, såsom slagtilfælde, hjerteanfald eller perifere arterielle sygdomme. Direkte levering af angiogene vækstfaktorer har potentiale til at stimulere nye blodkar vækst, men er ofte forbundet med begrænsninger såsom manglende målretning og korte halveringstid in vivo. Genterapi giver en alternativ tilgang ved at levere gener, der koder angiogene faktorer, men kræver ofte ved hjælp af virus, og er begrænset af sikkerhedsmæssige bekymringer. Her beskriver vi en nyligt udviklede strategi for at stimulere vaskulær vækst ved programmering stamceller at overudtrykke angiogene faktorer in situ ved hjælp af biologisk nedbrydelige polymere nanopartikler. Konkret vores strategi udnyttet stamceller som levering køretøjer ved at udnytte deres evne til at vandre mod iskæmiske væv in vivo. Brug af optimerede polymere vektorer, fedt-afledteStamcellerne blev modificeret til at overudtrykke et angiogent gen, der koder for vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF). Vi beskrev fremgangsmåder til polymersyntese, nanopartikel dannelse, transfektion af stamceller in vitro, såvel som metoder til at validere effektiviteten af VEGF-udtrykkende stamceller til fremme af angiogenese i en murin bagben iskæmi.

Introduction

Det overordnede mål med denne teknik er at fremme terapeutisk angiogenese ved hjælp af ikke-viralt programmerede stamceller overekspression terapeutiske faktorer på stedet for iskæmi. Stamceller blev ændret ex vivo først bruge biologisk nedbrydelige nanopartikler syntetiseret i laboratoriet, og derefter transplanteres i en murin model af bagben iskæmi at validere deres potentiale for at øge angiogenese og væv bjærgning.

Kontrolleret vaskulær vækst er en vigtig komponent i en vellykket vævsregeneration samt til behandling af forskellige iskæmiske sygdomme, såsom slagtilfælde, iskæmi og myokardieinfarkt. Adskillige strategier er blevet udviklet til at fremme vaskulær vækst, herunder vækstfaktor levering og celle-baseret behandling. ^1. På trods af observeret effekt i dyremodeller, disse metoder stadig står begrænsninger såsom behovet for suprafysiologiske doser for vækstfaktor levering eller utilstrækkelig paracrinefrigivelse af celler alene. En mulig strategi til at overvinde de ovennævnte begrænsninger er at kombinere stamceller og genterapi, hvor stamceller genetisk programmeret ex vivo før transplantation at overudtrykke ønskelige terapeutiske faktorer. Denne tilgang er blevet påvist i forskellige sygdomsmodeller, herunder bagben iskæmi ^2, hjertesygdomme ^3, knogleheling ⁴ og nerveskader ^5, osv. Men de fleste genterapiteknikker afhængige virale vektorer, som er forbundet med sikkerhedsproblemer, såsom potentiel immunogenicitet og insertionsmutagenese. Biomaterialer medieret non-viral gen levering kan overvinde disse begrænsninger, men ofte lider af lavt transfektion effektivitet. For at fremskynde opdagelsen af ​​nye biomaterialer til effektiv non-viral genlevering har nylige studier beskæftiget kombinatorisk kemi og højkapacitetsscreening tilgang. Bionedbrydelige polymerpartikler biblioteker såsom poly (β-amino esbreve) (PBAE) er blevet udviklet og screenet, hvilket førte til opdagelsen af ledende polymerer med markant forbedret transfektion effektivitet i forhold til de konventionelle polymere vektor modstykker. ^6-7

Heri beskrives syntesen af PBAE og kontrol af deres evne til at transficere adipøst afledte stamceller (ADSCs) in vitro, efterfulgt af efterfølgende transplantation af genetisk modificerede ADSCs overudtrykker vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) i en murin model af bagben iskæmi . Resultaterne blev evalueret ved at spore celle skæbne ved hjælp bioluminescens billeddannelse, vurderer væv reperfusion ved hjælp af laser Doppler perfusion imaging (LDPI), og bestemmelse af angiogenese og væv bjærgning ved histologi.

Protocol

1.. Polymer Synthesis

1. I et stinkskab afvejes 3.523 mg butandioldiacrylat (C) og overføres til en glasscintillationshætteglas indeholder opsigt bar.
2. Forvarm 5-amino-1-pentanol (32) til 90 ° C at opløse saltet og derefter i et stinkskab afvejes 1.533 mg 32 og føje til scintillationshætteglas indeholdende C. Denne fremgangsmåde vil resultere i et molforhold C: 32 = 1:1,2.
3. Anbring straks hætteglasset indeholdende begge løsninger på opsigt plade. Indstil omrøringshastigheden på 600 omdrejninger i minuttet.
4. Overfør scintillationshætteglas til en ovn indstillet til 90 ° C. Indstil omrøringshastighed til 1.000 rpm i 4 timer. Hvis omrørerstang sidder fast, skal du sænke hastigheden. Efter 4 timer, lavere hastighed til 300 opm og holdes ved 90 ° C i yderligere 12 til 16 timer.
5. Der tilsættes 5 g C32 til 10 ml vandfri tetrahydrofuran (THF) i et glasscintillationshætteglas indeholdende en omrørerstav. Wrap i folie og vortex på høj indtil helt opløst.
6. I en separat glasscintillationshætteglas contalingen en omrører, tilsættes 10 mM Tetraethyleneglycoldiamine (122). Der tilsættes 40 ml THF.
7. Placer begge hætteglas (C32 og 122) på en omrøringsplade i 5 minutter derefter kombinere sammen. Dæk i folie og henstår ved stuetemperatur under omrøring ved 400 rpm i 24 timer. Slutproduktet betegnet C32-122.
8. Afvejes 5 x 50 ml Falcon rør til hver 5 g batch af C32-122. Bemærk massen af ​​hvert rør i en notesbog.
9. Overfør 30 ml vandfri diethylether til hver 50 ml Falcon-rør.
10. Overfør 10 ml C32-122 til hver 50 ml Falcon rør.
11. Vortex Falcon rør kraftigt centrifugeres ved 2.500 rpm i 2 min. Bemærk: Den ekstraherede polymer samles i bunden af ​​glasset.
12. Kassér den øverste løsning og gentage trin 1.9 og 1,11 to gange mere.
13. De åbne rør, der indeholder den udpakkede C32-122 i ekssikkatoren og vakuum natten over. Sørg for at alle rørene er beskyttet mod lys.
14. Alle rør, der indeholder C32-122 afvejes for at bestemme den endelige masse afekstraheret polymer.
15. Opløs ekstraheret polymer i vandfrit DMSO ved en koncentration på 100 mg / ml.
16. Opbevar den opløste polymer ved -20 ° C beskyttet mod lys og fugt.

2. Cellepodning

1. Pre-coat bunden af ​​en T-150 vævskulturkolbe med 0,1% (vægt / vol) gelatine. Gelatinen skal forblive i kolben for 30-45 min. Den gelatineovertræk hjælper vedhæftning af ADSCs.
2. Aspirer gelatine fra præ-belagte T-150-kolbe.
3. Tilsæt 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ passage 3) til kolben i 20 ml DMEM indeholdende 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 10 ng / ml bFGF.
4. T-150-kolbe anbringes i inkubatoren ved 37 ° C, 5% _CO2 natten over.
5. Begynd transfektionsproceduren den følgende dag.

3. Nanopartikel Forberedelse og transfektion

1. Følgende procedure er til fremstilling af nanopartikler, der indeholder 16,1 mg plasmid DNA pr1,0 x 10 ⁶ celler i en polymer til plasmid vægtforhold på 30:1.
2. Fortyndet plasmid DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) til en slutkoncentration på 120 ug / ml i natriumacetat (25 mM) i et 15 ml Falcon-rør.
3. Fortynd C32-122 (100 mg / ml) til en slutkoncentration på 3,6 mg / ml i natriumacetat (25 mM) i en anden 15 ml Falcon-rør.
4. Kombinere indholdet af hver Falcon-rør i en enkelt 15 ml Falcon-rør og vortex umiddelbart på høj i 10 sek.
5. Lad røret stå ved stuetemperatur i 10 min for nanopartikler dannelse at forekomme.
6. Mens inkubere erstatte medium i vævskulturkolbe med 7,8 ml fuldt suppleret DMEM per 1,0 x 10 ⁶ celler transficeret.
7. Overfør nanopartikel løsning på vævsdyrkningskolbe og vippe frem og tilbage til at fordeles jævnt.
8. Vævskultur Kolben anbringes i inkubator ved 37 ° C, 5% _CO2 i 4 timer.
9. Efter 2 timer, udskifte nanoparkel holdige medier med DMEM.
10. Efter yderligere 2 timers inkubation ved 37 ° C, 5% CO ₂ er cellerne klar til in vivo-injektion.

4.. Bagben Iskæmi Procedure

1. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Stanford University Animal Care og brug Retningslinjer og godkendt Aplac protokoller. Generering af musemodel af bagben iskæmi udføres som tidligere beskrevet. ^8. Der henvises til reference for detaljerede instruktioner. En kort beskrivelse nedenfor.
2. Anbring musen under anæstesi med 1-3% dosering isofluran ved indånding og ilt flow på 1 L / min. Sørg for bedøvelse dybde ved tå knibe, reduktion i respirationsfrekvens, og sløvhed.
3. Fjerne hår fra maveregionen og begge bagbenenes områder af musen med barberskum.
4. Lav indsnit i midten af ​​mediale lår mod midterlinjen og derefter skære gennem overliggende fedt pad til exudgøre den femorale arterie.
5. Ligere arterien på to steder: distalt sted (tæt på knæ) og proximale side (lige distalt for lyskeligamentet).
6. For at oprette ligeringer adskille arterie fra venen og tråd en 5-0 silke sutur omkring arterien. Bind off arterien med to knob for at gøre ligatur.
7. Fjern arterien mellem de to ligation punkter.
8. Vask kirurgiske område med PBS og derefter sutur incisionen lukkes.
9. Anæstesien kan nu fjernes. Hold musen varme, indtil re-opvågnen. Til post-operativ pleje, kan 2-4 mg / kg Lidocain injiceres subkutant på incisionssted forud for re-opvågnen. Yderligere smertebehandling kan omfatte subkutane 0,05-0,1 mg / kg Buprenorphin ved 12 og 24 timer. Overvåg sundhedstilstand musene en gang om dagen i syv dage ved at observere ændringer i vejrtrækning mønster, åbenlys smerte og angst, og hudfarve.
10. Bekræft bagben iskæmi ved hjælp af laser Doppler perfusion imaging.

5.. Cell Injektioner

1. Når de transfekterede celler og mus er klar vaskes transficerede celler med PBS, Trypsinisér, centrifuge, og derefter tælle.
2. Resuspender celler ved en densitet på 10 x 10 ⁶ celler pr ml i PBS.
3. Cellesuspensioner skal adskilles i separate Eppendorf-rør ved et volumen på 110 ul. Dette vil sikre, at hver mus modtager et tilsvarende beløb af celler.
4. Placer hver mus under anæstesi (2,5% isofluran, 1 L / min oxygen strømningshastighed).
5. Rens injektionsstedet med spritservietter.
6. Ved hjælp af en 27 G tuberculinsprøjte, trækker cellerne op og ned i sprøjten for at sikre en homogen suspension er opnået. Udarbejder 100 pi suspension cellevolumenet ind i sprøjten.
7. Injicer halvdelen cellesuspensionen i lukkemuskel område og derefter injicere den anden halvdel i lægmuskel regionen. Efter indsprøjtning, forlade sprøjten på plads i mindst 15-30 sek tilforhindre lækage af cellesuspensionen.
8. Korrekt kontroller til dyr undersøgelse omfatter: 1) celler transficeret med en ikke-kodende plasmid (fx plasmid med nogen biologisk aktivitet), 2) celler alene og 3) PBS.
9. Når injektioner er færdig, fjernes musen fra anæstesi og hold dem varme, indtil muse re-vågner.

6.. Bioluminescens Imaging

1. Til at begynde bioluminescens imaging (BLI), bedøver mus som beskrevet ovenfor.
2. Rens injektionsstedet med spritservietter.
3. Utilizing insulinsprøjte belastning 100 ul 15 mg / ml D-luciferin (substratet for ildflueluciferase). Hold substrat væk fra lys.
4. For at udføre intraperitoneale injektioner, hold mus ved huden på ryggen til at trække deres forreste huden stram. Stik nålen intraperitonealt i maveregionen og injicere 100 pi substrat.
5. Placer musen i IVIS luciferase imaging kammer under anæstesi.
6. Når billedet er erhvervet, markere området af interesse at måle luciferase signal. I dette tilfælde, markere den iskæmiske lemmer ved stedet for celle-injektion.
7. Fortsæt med at måle luciferasesignal hver 3-5 min, indtil signalet når et højdepunkt og begynder at falde. Dette er anvendt til sammenligning på tværs af mus og over flere tidspunkter værdi.
8. Når du er færdig, skal du fjerne musene fra kammeret og anæstesi. Hold mus varme, indtil re-opvågnen.

7.. Laser Doppler perfusion Imaging

1. Laser Doppler perfusionsafbildning udføres som tidligere beskrevet. ⁸ Proceduren er kort beskrevet her.
2. Før dopplerundersøgelser musen skal være rent barberet på de områder, overliggende både bagbensknogler og maveregionen at forhindre artefakt grundet hår.
3. Når parat til Doppler billede, mouSE skal bedøves som beskrevet ovenfor.
4. Varm musen til 36 ° C på en varmeplade, mens overvågning af kropstemperatur ved rektal termometer.
5. Placer musen på et ikke-reflekterende sort overflade og holde bedøvet ved næse kegle. Musen skal anbringes på sin ryg overfladen med sine lemmer udsættes jævnt.
6. Placer laser Doppler-sensoren omkring 15 cm over musen og dirigere laser pointer fra sensoren mod skridtregion musen.
7. Når musen og Doppler-sensoren er i position, kan billederne tages udnytte LDPIwin softwaren ved at trykke på Start-knappen.
8. Relative perfusionsmålinger kan tages ved at angive begge bagben (iskæmisk og non-iskæmisk), som regionen interesse (ROI). Forholdet mellem gennemsnitlig perfusion af iskæmisk til den ikke-iskæmiske bagben vil indikere relative perfusion.

8.. Tissue Harvest Procedure

1. Når parat til høst mus tissagsøge for histologi og / eller biokemisk forarbejdning, bør musen aflives. Her mus aflivet ved eksponering til 5% isofluran i 3-5 minutter, derefter euthanizing musen ved cervikal dislokation.
2. Skær den overliggende hud, der omgiver bagbenet omkredsen ved den distale abdominale region og proksimalt til bagbenet. Huden skæres fra ventrale til dorsale overflader, således at huden kan trækkes tilbage over bagbenet til foden.
3. Efter trækker huden tilbage, kunne lemmer amputeres ved at udnytte stump dissektion saks til at klippe på bækken og lårben joint.
4. To vigtige væv er taget til analyse: de mediale lukkemuskler og gastrocnemius muskler.
5. Til histologi, indkapsle en eller begge væv i optimal skæring temperatur (OLT) for cryosectioning.
6. Til biokemisk analyse, indsamle ene eller begge væv i et 1,5 ml Eppendorf og nedsænkes i et bad af flydende nitrogen i mindst 2 minutter. Prøverne kan væreopbevaret ved -80 ° C for fremtidig behandling.

Representative Results

Efter sammenblanding, det positivt ladede polymer (C32-122) og negativt ladede DNA-plasmid selv samler i nanopartikler. Nanopartikel dannelse kan bekræftes ved elektroforese analyse dvs kompleksdannelse mellem C32-122, og plasmid-DNA vil forhindre anvendelse af DNA under elektroforese. Polymeren fungerer som transfektionsreagens at lette forbedret optagelse af DNA i målcellerne, og den efterfølgende ekspression af koder for proteiner (figur 2). Celler kan transficeres med eventuelle terapeutiske gener eller reporter-DNA, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) for at lette hurtig optimering af polymere vector design og transfektion betingelser med høj effektivitet under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og fluorescensmikroskopi (Figur 3). For ADSCs er en virkningsgrad på over 20% anses for egnet.

For at lette sporing af cellens skæbne efter transplantationtion kan celler stabilt transduceret med luciferase, som tillader tidstro overvågning af levedygtighed og fordeling celle in vivo under anvendelse af ikke-invasiv bioluminescens imaging (BLI). BLI billedbehandling viste høj intensitet luminescenssignal fra bagbenet (figur 4, venstre panel), hvilket indikerer, at implanterede celler forblev på injektionsstedet over flere dage, og vi overholder ikke mærkbar cellemigration over for andre væv eller organer i løbet af 21 dage. Celle signal i almindelighed faldt overtid og varede op til 14 dage (figur 4, højre panel), hvilket tyder på, at de fleste transplanterede celler er til rådighed for overekspression terapeutiske faktorer i op til 2 uger.

Dopplerbilledbehandling er et nyttigt værktøj, der giver real-time overvågning af blodreperfusion til det iskæmiske lemmer. Det venstre panel i figur 5 er et repræsentativt billede af blodgennemstrømningen efter induktion af iskæmi. Det mørke område angiver successful blokering af blodgennemstrømningen efter operationen. Det højre panel i figur 5 illustrerer fuldstændig reperfusion af ekstremiteten 14 dage efter behandling med transficerede celler.

De ovenfor beskrevne teknikker tillader real-time kvantificering, og bør kobles sammen med yderligere endepunkt analyser til grundigt at undersøge den terapeutiske virkning. Muskelvæv, der har modtaget transplanterede celler kan høstes på forskellige tidspunkter for genekspression og histologiske analyser. RT-PCR kan bruges til at kvantificere genekspression i bagbenet at bekræfte genetiske opregulering i transfekterede celler flere dage efter transplantationen. Figur 6 viser VEGF udtryk i ubehandlet lem, injiceret med PBS eller injiceres med VEGF udtrykker ADSCs . Resultaterne bekræfter VEGF opregulering i ikke-virale transficerede celler fire dage efter transplantationen, yderligere som bevis for transplanteret celle overlevelse.

Histologiske farvning giver mulighed for direkte visualisering af væv morfologi og graden af ​​vævsregeneration. Histologisk analyse for blodkar tæthed kan kobles med Doppler imaging data til at evaluere effekten af blodreperfusion (figur 7). Vævsmorfologi farvning såsom H & E og Masson Trichrome farvninger er anvendelige til at vurdere graden af ​​vævsregeneration eller nekrose. Succesfuld nyligt regenereret muskelvæv er præget af muskelceller med centralt placerede kerner, mens nekrotiske væv viser ofte væsentlig væv fibrose eller øget antal af inflammatoriske celler, såsom makrofager.

Figur 1. Skematisk illustration af syntesen af poly (β-amino) ester (PBAE)-baseret vektor C32-122. (A) Akryl afsluttes C32-Ac blev dannet ved en Michael-additionsreaktion mellem en monomer med diacrylate endegrupper (C) og en monomer med primær amin-endegruppe (32). (B) End-modificeret PBAE polymerer kan dannes ved tilsætning af amin-terminerede monomerer til forbedret transfektionseffektivitet. (C) Tetraethyleneglycoldiamine (122) blev valgt som den terminale aminmonomer. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Skematisk af dannelsen af bionedbrydelige polymere nanopartikler, og deres efterfølgende celle up-tage processen for protein-ekspression.

Figur 3. Humane adipøst afledte stamceller overudtrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Transfektion blev udført ved anvendelse af polymere nanopartikler dannet ved anvendelse af C32-122 og GFP DNA-plasmid. Scale bar: 200 um.

Figur 4.. Repræsentant bioluminescens imaging (BLI) data af musen lemmer på dag 0 (venstre panel) og dag 14 (højre panel) efter injektion GFP-luciferase positive fedt-stamceller i musen bagben.

Figur 5. Repræsentative Doppler billeder der viser induktion af iskæmi i den ene side af murin bagben på dag 0 (venstre panel), og vellykket blodreperfusion 14 dage efter injektion af VEGF-overekspression adipøst afledte stamceller (højre panel).

Figur 6. For at bekræfte celle overlevelse og overekspression af kodede terapeutiske faktorer in situ, kan væv høstes fra injektionsstedet til gen expression analyser. RT-PCR bekræftede vellykket opregulering af VEGF, det kodede terapeutiske protein i den behandlede gruppe (ADSC-VEGF) 4 dage efter celleinjektion, mens ingen ekspression blev detekteret i PBS-kontrol.

Figur 7. Repræsentant immunhistokemisk billede viser kapillartæthed af anti-CD31 farvning på 28 dage efter den kirurgiske procedure Scale bar:. 100 um.

Discussion

Her rapporterer vi en metode til at programmere voksne stamceller at overudtrykke terapeutiske faktorer ved hjælp af ikke-virale, biologisk nedbrydelige nanopartikler. Denne platform er især nyttig til behandling af sygdomme, hvor stamceller kan naturligvis hjem, såsom iskæmi og cancer. ^9-10 Endvidere non-viral genafgivelse platform giver mulighed for transient overekspression af terapeutiske faktorer, som er velegnet til de fleste vævsregeneration og sår helbredende processer. Den transfektionsproces afhænger effektiv DNA indtrængen i celler, og generelt fungerer godt i aktivt-delende celletyper, men ikke så godt i ikke-delende celler. Transfektionseffektiviteten af PBAE polymerer kan variere fra celletype til celletype og skal optimeres individuelt og yderligere kemisk struktur modifikationer kan undersøges for at opnå optimal transfektionseffektivitet i specifikke målrettede cellepopulationer. ^11-12 Celler transficeret med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde typisk resulterer in transient genekspression og protein sekretion i to uger, med maksimal genekspression opnået omkring dag 2-4. For dyreforsøg er ADSCs med transfektionseffektiviteten over 20% anses for passende. Det anbefales at udføre FACS-analyse, hver gang en proces parameter ændres, således bevare sammenhængen (f.eks ny batch af polymerer, plasmider eller celler).

Sammenlignet med de kommercielt tilgængelige transfektionsreagenser såsom PEI og Lipofectamine 2000, som er ikke-nedbrydelige, de PBAE polymerer, der anvendes i den rapporterede platform ovenfor er bionedbrydelige og mere egnet til klinisk oversættelse. Da sådanne polymere vektorer er hydrolytisk nedbrydelig ¹³ og lysfølsomt, bør der udvises forsigtighed for at gemme PBAE polymerer korrekt (-20 ° C i mørke med tørremiddel) for at forhindre uønsket hydrolyse og nedbrydning. De resulterende polymerer har en fordeling af molekylvægt og gelpermeationskromatografi (SEC) may udføres til yderligere oprensning PBAEs med øget transfektion effektivitet. ^14. Det er også anbefales at udføre kernemagnetisk resonans (NMR) ved hvert trin i polymersyntese protokollen. NMR skal udføres for at bekræfte dannelsen af C32 fra de enkelte bestanddele og igen for at bekræfte succesfuld tilføjelse af endeafdækning grupper, nemlig 122.. Bemærk: efter tilsætning af endeafdækning grupper bør acrylatgrupper forsvinde fra NMR-spektret. Tilstedeværelsen af ​​overskydende amin-terminerede monomerer i den færdige polymer kan føre til øget celletoksicitet, og det er derfor vigtigt, at passende vaske endelige polymer i diethylether for at sikre fjernelse af overskydende monomerer. Som nævnt ovenfor kan SEC også anvendes til at fremme renheden af ​​slutproduktet.

I modsætning til mange virale-baserede gen platforme, er polymer-baserede gentildelingssystem bruges her ikke integrere i værtsgenomet og derved undgå potentielle risiko for insertionel mutagenesis og immunogenicitet. ^15-16

I den beskrevne procedure, er celler transplanteret uden at sortere umiddelbart efter transfektion proces, der indeholder en blanding af celler, der overudtrykker koder for proteiner og un-transficerede celler. Denne procedure giver mulighed for minimal ex vivo manipulation af cellerne, og er tilbøjelige til at være mere klinisk translaterbart givet reduceret tid, omkostninger og chancerne for forurening. Celler kan også renses yderligere at vælge transficerede celler kun for yderligere at øge niveauet af overekspression af terapeutiske faktorer i situ.

Effekten af ​​programmerede stamceller til angiogenese bør undersøges ved hjælp af en kombination af analyser til grundigt vurdere resultaterne på flere niveauer, herunder cellulære, morfologiske og fysiologiske. Bioluminescens billeddannelse muliggør real-time overvågning af overlevelse og distribution af transplanterede celler over tid. Genekspression analyser fra harvinteresserede væv tillader kontrol af celle overlevelse og genetisk opregulering af kodede faktorer in situ. Histologisk farvning muliggør direkte visualisering af blodkar tæthed, inflammation og vævsregeneration. Det skal bemærkes, at øget blodkar massefylde ikke altid fører til en vellykket blodreperfusion, som de nyligt dannede kar kan være umodne og ikke-funktionelle. Det er derfor vigtigt at vurdere den fysiologiske funktion af nyligt genererede fartøjer ved hjælp af laser Doppler perfusionsbilleddannelse. Mens ovennævnte metoder fokus på at bruge fedt stamceller til fremme af angiogenese i et bagben iskæmi model, begrebet programmering celler som drug delivery køretøjer er bredt anvendelige. Platformen kan nemt tilpasses til at programmere andre celletyper til overekspression terapeutiske faktorer, der er relevante for behandling af andre sygdomme som kræft og sygdomme i bevægeapparatet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10082
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronym: 122
Sodium Acetate	G-Biosciences	R010
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007