Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verwendung von polymeren Nanopartikeln für die Überexpression therapeutischer Gene in Stammzellen anhand eines marinen Ischämiemodells der Hintergliedmaßen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst biologisch abbaubare Polymere durch eine zweistufige Mikrofon-Editionsreaktion synthetisiert werden, gefolgt von der Herstellung polymerer Nanopartikel, die für therapeutische Gene kodieren. Der zweite Schritt besteht darin, aus humanem Fett gewonnene Stammzellen in vitro auf den überexprimierten vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor zu transfizieren.

Als nächstes werden programmierte Stammzellen intramuskulär in eine ischämische Hintergliedmaße injiziert, um die NC-Produktion von therapeutischen Faktoren zu fördern. Der letzte Schritt besteht darin, das Zellüberleben und die Blutreperfusion in der ischämischen Extremität im Laufe der Zeit mit Hilfe von Biolumineszenz-Bildgebung und Laser-Doppler-Bildgebung zu überwachen. Letztendlich können quantitative Genexpression und Histologie durchgeführt werden, um die lokalisierte Expression therapeutischer Faktoren und die Wirksamkeit der Geweberegeneration zu zeigen.

Der Vorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Methoden der Angiogenese ist die Verwendung von Stammzellen als Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten. Diese Strategie ermöglicht es uns, die natürliche Hackfähigkeit von Stammzellen zu nutzen, um in Richtung Ischämie zu wandern, und ermöglicht auch dynamische Reaktionen auf Mikroumgebungsreize. Die Nanopartikel, die für die Plasma-DNA-Verabreichung verwendet werden, sind hocheffizient und biologisch abbaubar, was eine geringere Zytotoxizität und eine größere Anzahl intrazellulär abgegebener DNA-Kopien ermöglicht.

Diese Technik kann auf viele klinisch relevante zellbasierte Therapeutika angewendet werden, da sie einen biologisch abbaubaren nicht-viralen Vektor verwendet, um Gene in autologe Zellen einzufügen. Wiegen Sie in einem Abzug das Butan-Zifferblatt DLI und übertragen Sie das Material in ein Inhalationsfläschchen aus Glas, das einen Rührstab enthält. Geben Sie als nächstes vorgewärmte fünf Amino-eins-Pentol in dasselbe Fläschchen. Stellen Sie das Fläschchen sofort auf eine Rührplatte und stellen Sie die Drehzahl auf 600 U/min ein.

Stellen Sie das Fläschchen in einen auf 90 Grad Celsius eingestellten Ofen und erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit nach vier Stunden auf 1000 U/min, verringern Sie die Geschwindigkeit auf 300 U/min und rühren Sie weitere 12 bis 16 Stunden lang. Wenn Sie fertig sind, geben Sie 10 Milliliter wasserfreien Tetrahydrouran zu fünf Gramm C 32 in ein Glasfläschchen mit einem Rührstab. Nach dem Einwickeln in Folie auf hoher Stufe in ein separates Glasfläschchen mit einem Rührstab 10 Millimolar Tetraethylenglykoldiamin geben, bis es vollständig aufgelöst ist.

Geben Sie 40 Milliliter THF in dieses Fläschchen, stellen Sie beide Fläschchen fünf Minuten lang auf eine Rührplatte, bevor Sie sie miteinander kombinieren. Decken Sie das Ergebnis mit Folie ab und lassen Sie es 24 Stunden lang Raumtemperatur stehen. Das Endprodukt wird als C 32 1 22 bezeichnet.

Übertragen Sie anschließend 30 Milliliter wasserfreien Dathylether in jedes der fünf 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Nach Zugabe von C 32 1 22 zu wasserfreiem Dylether bildet sich eine weiße, trübe Lösung, die das Röhrchen wirbelt und dann zentrifugiert. Das extrahierte Polymer sammelt sich am Boden des Röhrchens, verwirft die obere Lösung und wiederholt diese Schritte noch zwei weitere Male.

Legen Sie die offenen Röhrchen nach dem Herausziehen in das Trockenmittel und vakuumieren Sie es über Nacht, stellen Sie sicher, dass die Röhrchen vor Licht geschützt sind. Am nächsten Tag werden die Röhrchen mit C 32 1 22 gewogen, um die Endmasse zu bestimmen. Lösen Sie schließlich das extrahierte Polymer in wasserfreiem DMSO in einer Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter auf.

Für die Herstellung von Nanopartikeln. Zuerst wird die Plasma-DNA in einem zweiten Röhrchen auf eine Endkonzentration von 120 Mikrogramm pro Milliliter in Natriumacetat verdünnt, C 32 1 22 auf eine Endkonzentration von 3,6 Milligramm pro Milliliter verdünnt. In Natriumacetat den Inhalt jedes Röhrchens in ein einzelnes 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen mischen und sofort 10 Sekunden lang auf hoher Stufe wirbeln.

Lassen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, damit sich Nanopartikel bilden, während sich die Nanopartikel bilden. Das Medium in einem zuvor sitzenden Gewebekulturkolben wird durch 7,8 Milliliter ersetzt. Vollständig ergänztes DMEM.

Übertragen Sie die Nanopartikellösung in den Gewebekulturkolben und verteilen Sie sie gleichmäßig, bevor Sie sie in den Inkubator geben. Ersetzen Sie nach zwei Stunden das Nanopartikel, das das Medium enthält, durch DMEM. Nach vier Stunden sind die Zellen bereit für die In-vivo-Injektion

Wenn die transfizierten Zellen fertig sind, zählen Sie die Zellen bei einer Dichte von 10 mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter in PBS, um sicherzustellen, dass jede Maus die gleiche Menge erhält. Die Zellsuspensionen werden in Einor-Röhrchen mit einem Volumen von 110 Mikrolitern getrennt. Als nächstes betäuben Sie eine Maus, die zuvor eine Ischämie der Hintergliedmaßen erlitten hat.

Anästhesie durch Zehenkneifen bestätigt haben, reinigen Sie die Injektionsstelle mit einer 27-Gauge-Spritze. Suspendieren Sie die Zellen erneut und ziehen Sie 100 Mikroliter der Suspension auf. Injizieren Sie die Hälfte der Zellsuspension in die Adduktorenmuskelregion und dann die andere Hälfte in die Wadenmuskelregion.

Lassen Sie die Spritze nach der Injektion mindestens 15 bis 30 Sekunden lang an Ort und Stelle, um ein Auslaufen zu verhindern. Wenn die Injektionen abgeschlossen sind, halten Sie das Tier warm, bis es sich vollständig erholt hat. Für die Biolumineszenz-Bildgebung bestätigen Sie die Anästhesie mit einem Zehenkneifen und reinigen Sie dann die Injektionsstelle wie zuvor gezeigt.

Füllen Sie eine Insulinspritze mit 100 Mikrolitern Luzifer und injizieren Sie es intraperitoneal. Bevor Sie das Tier in die ivus-Luciferase-Bildgebungskammer legen, nehmen Sie die Mäuse mit einer Belichtungszeit von einer Minute ab. Wenn das Bild aufgenommen wurde, markieren Sie den gewünschten Bereich.

In diesem Fall misst das ischämische Glied an der Zellinjektionsstelle weiterhin alle drei bis fünf Minuten das Luciferase-Signal, bis das Signal einen Höhepunkt erreicht und zu sinken beginnt. Dies ist der Wert, der für den Vergleich zwischen Mäusen und im Laufe der Zeit verwendet wird, wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Mäuse aus der Kammer und halten Sie das Tier warm, bis es sich vollständig erholt hat. Das Gewebe wird zu einem ausgewählten Zeitpunkt geerntet.

Punkte nach der Transfektion, nach der Euthanasie, schneiden Sie die Haut um die hintere Extremität herum umlaufend im distalen Bauchbereich und proximal zur hinteren Extremität. Nachdem Sie die Haut zurückgezogen haben, amputieren Sie die Gliedmaße zwischen Becken- und Oberschenkelgelenk. Schließlich werden der mediale Adduktor und die Magenmuskulatur isoliert.

Für die weitere Analyse zeigen diese Bilder die Synthese von C 32 1 22. Hier wurde ACR-bezogenes terminiertes C 32 AC durch eine mic-Editionsreaktion zwischen einem Monomer mit DAL-Endgruppen und einem Monomer mit einer primären am-Mittelwert-Endgruppe gebildet. In diesem Beispiel können modifizierte PBAE-Polymere durch Zugabe eines mittelterminierten Monomers gebildet werden, um die Transfektionseffizienz zu verbessern.

Eine erfolgreiche Transfektion zeigt sich an der Überexpression von grün fluoreszierendem Protein, wie hier zu sehen. Diese Biolumineszenz-Bildgebungsdaten zeigen eine Maus am Tag Null und am Tag 14. Nach der Injektion von GFP-Luciferase-positiven Stammzellen aus Fettgewebe in die hintere Extremität zeigen repräsentative Dopplerbilder die Induktion von Ischämie auf einer Seite der spiegelnden Hintergliedmaße am Tag Null und eine erfolgreiche Blutreperfusion.

14 Tage nach der Injektion von VEGF über die Expression von aus Fett gewonnenen Stammzellen. R-T-P-C-R bestätigte die erfolgreiche Hochregulation von VGF, dem kodierten therapeutischen Protein in der behandelten Gruppe vier Tage nach der Zellinjektion, während in der PBS-Kontrolle keine Expression nachgewiesen werden konnte. Andere Methoden, die einen kombinierten Stammzell- und Gentransferansatz anwenden, können durchgeführt werden, um neue therapeutische Ziele zur Förderung der Geweberegeneration zu identifizieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man biologisch abbaubare Polymere für die nicht-virale Gentherapie synthetisiert und diese Polymere verwendet, um Stammzellen für die Behandlung von Ischämie und vivo zu programmieren. Die Verwendung von nicht-viral hergestellten Stammzellen zur Überexpression therapeutischer Faktoren in situ kann für die Behandlung einer Vielzahl von degenerativen Erkrankungen von großem Nutzen sein.