Summary
Bu biyolojik olarak parçalanabilir bir polimerik nano-tanecikleri kullanılarak anjiyojenez için tedavi edici faktörler aşırı ifade programlama kök hücrelerin bir yöntem tarif eder. Tarif edilen işlemler in vitro yağ elde edilen kök hücreleri transfekte etmek ve bir murin arka bacak anjiyojenezi, iskemi modelinde desteklemek için programlanmış kök hücrelerin etkinliğini doğrulamak, polimer sentezi içerir.
Abstract
Kontrollü vasküler büyüme başarılı doku rejenerasyonu ve yara iyileşmesi, hem de örneğin, felç, kalp krizi veya periferal arter hastalıklar gibi iskemik hastalıkların tedavisi için kritik önem taşır. Anjiyojenik büyüme faktörleri doğrudan verilmesi, yeni kan damarı büyümesini teşvik etmek için bir potansiyele sahip, ancak genellikle bu tür hedefleme ve in vivo kısa yarı ömrü eksikliği gibi sınırlamalar ile ilişkilidir. Gen tedavisi anjiyojenik faktörleri kodlayan genlerin sunarak alternatif bir yaklaşım sunmaktadır, ancak genellikle virüsü kullanılarak gerektirir ve güvenlik kaygıları ile sınırlıdır. Burada, biyolojik olarak parçalanabilir bir polimerik nano-tanecikleri kullanılarak in situ anjiyojenik faktörlerin aşırı ifade programlama kök hücreler tarafından damar büyümesini teşvik etmek için yeni geliştirilmiş bir strateji tarif eder. Özellikle bizim strateji vivo iskemik dokulara doğru göç etme yeteneğinden yararlanarak teslim araçlar gibi kök hücreleri kullanılmaktadır. Optimize edilmiş polimerik vektörleri, yağ türevi kullanarak,kök hücreler, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) kodlayan bir geni fazla-sentezlemek üzere anjiyojenik modifiye edilmiştir. Biz, polimer sentezi, nanopartikül oluşumu, in vitro olarak kök hücreleri transfekte etmek, hem de bir murin arka bacak iskemi modelinde angiogenesisi teşvik etmek için VEGF ifade eden kök hücrelerin etkinliğini doğrulamak için yöntemleri için işlemleri tarif.
Introduction
Bu tekniğin genel amacı iskemi yerinde tedavi etkenleri aşırı ifade eden non-viral programlanmış kök hücreleri kullanılarak tedavi anjiyojenezi teşvik etmektir. Kök hücreleri laboratuarda sentezlenen nanopartiküller kullanılarak biyolojik ex vivo değiştirilmiş olanlar ve anjiyogenez ve doku kurtarma arttırmak için potansiyellerini doğrulamak için arka bacak iskemisi bir murin modelinde aktarılmıştır.
Kontrollü vasküler büyüme önemli bir başarı doku rejenerasyonu bileşen yanı sıra, inme, uzuv iskemisi, ve miyokard enfarktüsü gibi çeşitli iskemik hastalıkların tedavisi içindir. Birçok strateji büyüme faktörü teslimat ve hücre bazlı tedavisi de dahil olmak üzere vasküler gelişime yardımcı olmak için geliştirilmiştir. 1. hayvan hastalık modellerinde gözlenen etkinliğine rağmen, bu yöntemler, yine de yetersiz gibi büyüme faktörü verilmesi için suprafizyolojik dozları için ihtiyaç duyulması gibi sınırlılıklara yüz ya da parakrinyalnız hücreler tarafından serbest. Yukarıdaki sınırlamalarını aşmak için bir potansiyel strateji kök hücre tedavisi ve kök hücreleri genetik olarak istenen terapötik faktörlerin aşırı ifade için ex vivo transplantasyon öncesinde programlanır, böylece bir gen terapisi, birleştirmektir. Bu yaklaşım, vb arka bacak iskemisi 2, 3 kalp hastalığı, kemik iyileştirme ve 4 sinir yaralanması 5 dahil olmak üzere, çeşitli hastalık modellerinde gösterilmiştir. Ancak, çoğu gen terapi teknikleri, bu tür potansiyel immünojenisite ve araya sokulan mutajenez gibi güvenlik kaygıları ile ilişkili viral vektörler, dayanmaktadır. Non-viral gen teslimi aracılık Biomateryaller bu sınırlamaları aşmak, ancak genellikle, düşük transfeksiyon verimlilik muzdarip olabilir. Etkili bir non-viral gene teslimi için yeni biyomalzeme keşfini hızlandırmak için, son çalışmalar kombinatoryal kimya ve yüksek verimli tarama yaklaşımı kullanmışlardır. Poli (β-amino ES gibi biyolojik olarak parçalanabilir polimer kütüphaneleriTERS) (PBAE) geleneksel polimerik vektör muadillerine kıyasla belirgin gelişmiş transfeksiyon verimliliği ile önde polimerlerin keşfine yol açtı, geliştirilmiş ve tarandı. 6-7
Burada, arka bacak iskemi bir murin modelinde vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) aşırı ifade eden genetik olarak modifiye edilmiş ADSCs sonraki transplantasyonunu takiben, PBAE sentezi ve in vitro olarak adipoz türetilmiş kök hücreler (ADSCs) transfekte etmek için kabiliyetleri doğrulanmasına tarif . Sonuçları, biyolüminesans görüntüleme kullanılarak hücre kaderini takip lazer Doppler perfüzyon görüntüleme (LDPI) kullanarak doku reperfüzyon değerlendirilmesi ve histoloji ile anjiogenez ve doku kurtarma belirlenmesi ile değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Polimer Sentezi
- Bir duman başlığı içinde, butandiol diakrilat (C) 3523 mg tartılır ve bir karıştırma çubuğu içeren bir cam sintilasyon şişesine aktarın.
- Ön ısıtma 5-amino-1-pentanol (32), bir tuzunu çözmek için 90 ° C'ye kadar, daha sonra bir mol oranı ile sonuçlanacaktır bir çeker ocak içinde, 1533 mg ağırlığında ve 32 üzerinden bu yöntem, C ihtiva eden sintilasyon şişesine eklemek C: 32 = 1:1.2.
- Derhal bir karıştırma plakası üzerine iki çözüm içeren şişe yerleştirin. 600 rpm'de karıştırma hızını ayarlayabilirsiniz.
- 90 ° C'de ayarlanmış bir fırına aktarın parıldama ampulünün 4 saat için 1000 rpm'ye ayarlayın karıştırma hızı. Karıştırma çubuğu takılıyor, hızını düşürmek. 4 saat sonra, düşük değerli 300 rpm hız ve başka 12-16 saat boyunca 90 ° C 'de muhafaza.
- Bir karıştırma çubuğu içeren bir cam sintilasyon şişesine susuz tetrahidrofuran (THF) içinde 10 ml C32 5 g ekleyin. Tamamen eriyene kadar yüksek üzerinde folyo ve girdap sarın.
- Ayrı bir cam sintilasyon şişesi içinde contaBir karıştırma çubuğu ining, Tetraethyleneglycoldiamine 10 mM (122) ekleyin. THF içinde 40 ml ilave edilir.
- 5 dk sonra birlikte birleştirmek için bir heyecan plaka üzerine iki şişeleri (C32 ve 122) yerleştirin. Folyo ile örtün ve 24 saat boyunca 400 rpm'de karıştırılarak oda sıcaklığında bırakın. Nihai ürün, C32-122 olarak adlandırılır.
- C32-122, her 5 g parti için 5 x 50 ml Falcon tüpleri dışarı tartılır. Bir defterinizdeki her tüpün kütlesi unutmayın.
- Her bir 50 ml Falcon tüpüne transfer susuz dietil eter içinde 30 ml.
- Aktarım her biri 50 ml Falcon tüpüne C32-122 10 ml.
- Vortex Falcon tüpleri şiddetli bir şekilde, daha sonra 2 dakika boyunca 2500 rpm'de santrifüj. Not: ekstre polimer tüpün tabanında toplayacaktır.
- Üst çözüm atmak ve adımları 1.9 ve 1.11 iki kez daha tekrarlayın.
- Gece boyunca kurutma cihazı ve vakumla ekstre C32-122 ihtiva eden açık tüpleri yerleştirin. Emin olun bütün tüpler ışıktan korunur.
- Nihai kütlesini belirlemek için C32-122 içeren tüm tüpler tartmakekstre polimer.
- 100 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda susuz DMSO içerisinde özü çıkarıldı polimer çözülür.
- Nem ve ışıktan korunan -20 ° C de çözülmüş polimer saklayın.
2. Hücre Serpilmesi
- Ön kaplama,% 0.1 (ağırlık / hacim) jelatin ile bir T-150 doku kültürü şişenin tabanı. Jelatin, 30-45 dakika boyunca bir şişe içinde kalmalıdır. Jelatin kaplama ADSCs yapışmasını sağlar.
- Önceden kaplanmış T-150 şişesi aspire jelatin.
- % 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 10 ng / ml bFGF ihtiva eden DMEM, 20 ml şişeye 4 x 10 6 ADSCs (≤ geçit 3) eklenir.
- 37 ° C, bir gece boyunca% 5 CO2 ile kuluçka makinesi içinde T-150 şişesi yerleştirin.
- Ertesi gün transfeksiyon prosedürü başlayın.
3. Nanopartikül Hazırlama ve transfeksiyonu
- Aşağıdaki prosedür, ortalama 16.1 ug plazmid DNA içeren nano partiküllerin hazırlanması için30:1 ağırlık oranını plazmid için bir polimer olarak 1.0 x 10 6 hücre.
- Plasmid DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, ABD) bir 15 ml Falcon tüpü içinde bir sodyum asetat (25 mM) içinde 120 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar seyreltilir.
- Ikinci bir 15 ml Falcon tüpü içinde bir sodyum asetat (25 mM) içinde 3.6 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar C32-122 (100 mg / ml) seyreltin.
- Hemen 10 saniye için yüksek tek bir 15 ml Falcon tüpü ve girdap her bir Falcon tüpleri birleştirin.
- Tüp ortaya nanopartikül oluşması için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- Kuluçka sırasında, transfekte edilmiş 1.0 x 10 6 hücre başına 7.8 ml tam olarak desteklenmiş DMEM ile doku kültür şişesi içinde orta yerine.
- Doku kültürü şişesine nanoparçacık çözüm aktarın ve öne doğru ve geriye doğru eşit yaymak.
- 37 ° C, 4 saat boyunca% 5 CO2 ile kuluçka makinesi içinde doku kültürü şişesi yerleştirin.
- 2 saat sonra, nanopar değiştirmekDMEM ile medya içeren TICLE.
- 37 ° C,% 5 CO2 de 2 saat daha inkübe edildikten sonra hücreler, in vivo enjeksiyon için hazırdır.
4. Hindlimb İskemi Prosedürü
- Bütün deneyler, Stanford Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Prensiplerine ve onaylanmıştır APLAC protokollere uygun olarak yapıldı. Arka bacak iskemisi sıçangil modelinin üretilmesi daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. 8 ayrıntılı talimatlar için, referansa bakınız. Kısa bir açıklama aşağıda verilmiştir.
- Teneffüs ve 1 l / dk oksijen akış hızı ile% 1-3 doz izofluran ile anestezi altında fare yerleştirin. Ayak tutam, solunum hızında azalma, ve uyuşukluk ile anestezi derinliği sağlamak.
- Tıraş kremi ile fare karın bölgesi ve hem de hindlimb bölgelerden saç çıkarın.
- Orta çizgisine doğru medial uyluk merkezindeki kesi yapar ve sonra eski için üstteki yağ yastığı kestifemoral arter poz.
- Distal sitesi (diz yakın) ve proksimal sitesi (inguinal ligament hemen distalinde): İki siteleri arteri bağlayın.
- Ligasyonları oluşturmak için, damardan arter ayırmak ve arter etrafında 5-0 ipek sütür iplik. Ligasyonu yapmak için iki knot ile arter kapalı kravat.
- İki nokta arasında ligasyon arter çıkarın.
- PBS ile cerrahi bölgeyi yıkayın ve sonra dikin kesi kapatıldı.
- Anestezi artık çıkarılabilir. Yeniden uyanış kadar fare sıcak tutun. Post-operatif bakım, 2-4 mg / kg Lidokain kesi yerinde subkutan yeniden uyanış önce enjekte edilebilir. Daha fazla ağrı yönetimi 12 ve 24 saat sonra 0.05-0.1 mg / kg deri altından Buprenorfin teslim içerebilir. Solunum paterni, açık ağrı veya sıkıntı, ve cilt renk değişiklikleri gözlemleyerek yedi gün boyunca günde bir kez farelerin sağlık durumunu izlemek.
- Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme hindlimb iskemi onaylayın.
5. Hücre Enjeksiyonlar
- Transfekte edilmiş hücreler ile farenin hazır olduğunda, trypsinize, PBS ile transfekte edilmiş hücrelerin santrifüj, yıkama ve ardından sayılır.
- PBS içerisinde ml başına 10 x 10 6 hücre yoğunluğunda hücreler yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonları, 110 ul'lik bir hacimde ayrı bir Eppendorf tüpleri içine ayrılmalıdır. Bu, her bir fare hücre eşit miktarda almasını sağlayacaktır.
- (% 2.5 izofluran, 1 L / dk oksijen akış hızı) anestezi altında her bir fare yerleştirin.
- Alkol mendil ile enjeksiyon yerinde temizleyin.
- 27 G tüberkülin şırınga kullanarak, homojen bir süspansiyon elde sağlamak için şırınga içine yukarı ve aşağı hücreleri çizmek. Enjektöre hücre süspansiyonu hacmi 100 ul kadar çizin.
- Adduktor kas bölgeye yarım hücre süspansiyonu enjekte edilir ve sonra baldır kas bölgeye diğer yarısını enjekte. Enjekte edilmesi üzerine, en az 15-30 saniye için yerinde bırakın şırıngaHücre süspansiyonunun sızmasını önler.
- Hayvan çalışma için uygun kontroller içerir: a kodlayıcı olmayan plazmid (herhangi bir biyolojik etkinliğe sahip, örneğin plazmid) ile transfekte 1) hücreleri, tek başına 2) hücreler ve 3) PBS.
- Enjeksiyonlar tamamlandığında, anestezi fareyi çıkarın ve fare yeniden uyanır kadar sıcak tutun.
6. Biyoparlaklık Görüntüleme
- Biyolüminesans görüntüleme (BLI) başlamak için, yukarıda tarif edildiği gibi fareler anestezi.
- Alkol mendil ile enjeksiyon yerinde temizleyin.
- Kullanarak insülin şırınga, 15 mg / ml D-luciferase (ateşböceği lusiferaz için alt-tabaka) yük 100 ul. Işıktan uzak tabakayı tutun.
- Periton içine enjeksiyonu gerçekleştirmek için, onların ön cilt gergin çekmek, onların arkasında cilt tarafından fareler tutun. Periton karın bölgesi içine iğneyi ve alt-tabaka 100 ul enjekte edilir.
- Anestezi altında IVIS lusiferaz görüntüleme odasında fare yerleştirin.
- Görüntü elde edildiğinde, lusiferaz sinyalini ölçmek için, ilgili bölgeyi işaretleyin. Bu durumda, hücre-enjeksiyon yerinde iskemik ekstremite işaretleyin.
- Sinyali bir zirveye ulaşır ve azalmaya başlayana kadar lusiferaz sinyalini her 3-5 dakikada ölçmek için devam edin. Bu fareler üzerinde ve çeşitli zaman noktalarında fazla karşılaştırılması için kullanılan değerdir.
- Tamamlandığında, odacık ve anesteziden fareler çıkarın. Yeniden uyanış kadar sıcak fareler tutun.
7. Lazer Doppler Perfüzyon Görüntüleme
- Laser Doppler perfüzyon görüntüleme daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirilir. 8 prosedür kısaca tarif edilmektedir.
- Önce fare yüzünden saça objeyi engellemek için arka ayakların ve karın bölgesi hem de örten alanlarda temiz traşlı olmalı görüntüleme Doppler için.
- Doppler görüntü hazır olduğunda, mouyukarıda tarif edildiği gibi anestezi uygulanmış se olmalıdır.
- Rektal termometre ile vücut sıcaklığını izlerken sıcak bir plaka üzerinde 36 ° C fare ısıtın.
- Yansıtıcı olmayan siyah zeminde fare koyun ve burun konisi tarafından anestezi tutmak. Fare bacakları eşit maruz ile dorsal yüzeyinde yer almalıdır.
- Yaklaşık 15 cm fare üzerinde ve fare kasık bölgesine doğru sensörden gelen laser gösterici yönlendiren lazer Doppler sensörü yerleştirin.
- Fare ve Doppler sensör konumunda olduğunda, görüntüler Başlat düğmesine basarak LDPIwin yazılım kullanan alınabilir.
- Bağıl perfüzyon ölçümleri ilgi (ROI) bölge olarak (iskemik ve non-iskemik) hem de arka ayakların belirtilerek alınabilir. Iskemik olmayan hindlimb için ortalama iskemik perfüzyon oranı nispi perfüzyon gösterir.
8. Doku Hasat Prosedürü
- Hasat fare tis hazır olduğundahistoloji ve / veya biyokimyasal işleme dava, fare ötenazi olmalı. Burada, fare, servikal dislokasyon ile fare ötenazi, daha sonra 3-5 dk boyunca 5% izofluran maruz ötenazi edilir.
- Hindlimb için uzak karın bölgesi ve proksimal çevresel hindlimb çevreleyen örten cilt kesin. Cilt cilt ayak için, arka bacağın üzerinde geri çekilebilir, öyle ki dorsal yüzeylere ventral kesilir.
- Cildi geri çekerek üzerine, uzuv pelvik ve femur eklem kesmek için künt diseksiyon makas kullanarak Ampute olabilir.
- İki ana dokular analiz için alınır: medial adduktor kas ve gastrokinemius kasları.
- Histoloji için cryosectioning için optimal kesim sıcaklığında (Ekim) bir veya iki dokuları gömün.
- Biyokimyasal analiz için, bir 1.5 ml Eppendorf içine bir ya da her iki doku toplanması ve en az 2 dakika boyunca sıvı azot banyosu içine daldırın. Numuneler olabilir,gelecekteki işleme için -80 ° C'de saklanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karıştırılarak üzerine, nanopartiküller içine pozitif yüklü polimer (C32-122) ve negatif yüklü DNA plazmid kendini toplanır. C32-122 ve plazmid DNA arasındaki kompleks oluşturma elektroforez sırasında DNA'nın mobilizasyonunu engeller, yani Nanopartikül oluşumu elektroforez analizi ile teyit edilebilir. Polimer hedef hücrelere DNA alımını ve gelişmiş kodlayan proteinlerin takip eden ifadesi (Şekil 2) kolaylaştırmak için bir transfeksiyon tepkin maddesi olarak hizmet vermektedir. Hücreler, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) ve floresan mikroskobu (Şekil 3) kullanılarak yüksek verim ile polimerik vektör tasarım ve transfeksiyon koşullarının hızlı optimizasyonu kolaylaştırmak için, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi herhangi bir terapötik ya da raportör gen DNA ile transfekte edilebilir. ADSCs için,% 20'nin üzerinde bir verim uygun olarak kabul edilir.
Hücre kaderi sonrası transplantasyonunun izlemeyi kolaylaştırmak içintion hücreler, kararlı bir şekilde non-invazif biyoluminesans görüntüleme (BLI) kullanılarak in vivo olarak, hücre canlılığı ve dağılım gerçek zamanlı izleme sağlar: lusiferaz ile transduse edilebilir. BLI görüntüleme implante edilmiş hücreler, birkaç gün boyunca enjeksiyon yerinde kaldı ve 21 boyunca, diğer dokular ya da organlar karşı fark hücre göçü gözlemleyememektedir gösteren, arka bacak (Şekil 4, sol panel) yüksek yoğunluklu parlaklık sinyali gösterdi gün. Genel olarak hücre sinyal mesai azalmış ve en Nakledilen hücreler kadar 2 hafta boyunca iyileştirici faktörler aşın için kullanılabilir düşündüren, 14 gün (Şekil 4, sağ panel) kadar sürdü.
Doppler görüntüleme iskemik ekstremite kan reperfüzyon gerçek zamanlı izleme sağlayan kullanışlı bir araçtır. Şekil 5'in sol panel iskemi indüksiyonundan sonra kan akımı temsili bir resimdir. Karanlık alan başarısını gösterirameliyat sonrası kan akımının sful bloke edilmesi. Şekil 5'in sağ panel 14 gün transfekte edilmiş hücreler ile muamele edildikten sonra uzvun tam reperfüzyon göstermektedir.
Yukarıda tarif edilen teknikler, gerçek zamanlı miktarını belirlemek ve ek uç nokta iyice terapötik etkinliğini incelemek için analizleri ile birlikte olmalıdır. Nakledilen hücreler almış kas dokuları gen ifadesi ve histolojik analizler için, farklı zaman noktalarında hasat edilebilir. RT-PCR ile transfekte olmuş hücrelerde genetik yukarı-regülasyonu onaylamak için arka bacak içinde gen ekspresyonunu ölçmek için kullanılabilecek birkaç gün post-transplantasyon. Şekil 6, PBS enjekte edilmiş ya da VEGF ADSCs ifade enjekte un-muamele ekstremitede VEGF ifadesini gösterir, . Sonuçlar ayrıca nakledilen hücre canlılığı kanıt sağlama, viral olmayan transfekte hücrelerinin dört gün transplantasyon sonrası VEGF upregülasyonunu onaylayın.
Histolorü boyama doku morfolojisi ve doku rejenerasyonu derecesi doğrudan görselleştirme sağlar. Damar yoğunluğu için histolojik analiz kan reperfüzyon etkinliğini (Şekil 7) değerlendirmek için Doppler görüntüleme verileri ile birleştiğinde olabilir. H & E ve Masson trikrom boyamalar olarak doku morfolojisi boyama doku yenilenmesi veya nekroz derecesini değerlendirmek için yararlıdır. Nekrotik doku çoğu zaman önemli fibroz doku ya da makrofajlar gibi iltihaplı hücrelerin artan sayısını göstermektedir, oysa başarıyla yeni yeniden kas dokusu, merkezi bir konumda bulunan çekirdekleri ile kas hücreleri ile karakterize edilir.
Şekil 1. Şematik poli sentezi (β-amino) ester (PBAE)-esaslı vektör C32-122 ile gösterilmiştir. (A) Akrilatlanmış C32-Ac diacrylat olan bir monomer ile bir Michael ekleme reaksiyonu ile oluşturulan sonae uç grupları (C) ve primer amin uç grubuna (32) sahip bir monomer. (B) sonu PBAE tadil edilmiş polimerler, gelişmiş transfeksiyon verimi için amin sonlu monomerlerin eklenmesi ile oluşturulabilir. (C) Tetraethyleneglycoldiamine (122) terminal amin monomer olarak seçildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Biyolojik olarak parçalanabilir polimerik nano partiküllerin oluşumu şematik ve daha sonraki hücre protein ekspresyonu için süreci-alır.
Şekil 3,. Yeşil floresan protein (GFP) aşırı ifade eden insan adipoz türetilmiş kök hücreler. Transfeksiyonu C32-122 ve GFP DNA plasmidi kullanılarak oluşturulmuş polimerik nano-tanecikleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ölçek bar: 200 um.
Şekil 4. Temsilci biyolüminesans görüntüleme (BLI) gün 0 (sol panel) ve fare hindlimb içine GFP-lusiferaz pozitif adipoz kök hücreleri enjekte 14 gün sonra (sağ panel) de fare bacaklarda veri.
Şekil 5,. Gün 0 (sol panel) 'de sıçangil hindlimb bir tarafında iskemi indüksiyonunu gösteren Örnek Doppler görsel ve başarılı kan reperfüzyon 14 gün VEGF-aşırı adipoz türetilmiş kök hücreler (sağ panel) enjeksiyonundan sonra.
Şekil 6,. Hücre hayatta kalma ve yerinde kodlanmış terapötik faktörlerin aşırı ekspresyonunu doğrulamak için, dokular gen İfade için enjeksiyon yerinde hasat edilebilirEssion analiz eder. hiçbir ifade PBS kontrol olarak tespit edilmiştir, oysa RT-PCR, tedavi edilen grupta 4 gün sonra hücre enjeksiyonu (ADSC-VEGF) VEGF'nin başarılı yukarı-regülasyonu, kodlanmış terapötik proteini, doğruladı.
Şekil 7. . 100 um: Ölçek çubuğu cerrahi işlem 28 gün sonra anti-CD31 boyanması yoluyla kılcal yoğunluğunu gösteren Temsili immunohistokimyasal görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada non-viral, biyolojik nanopartiküller kullanılarak iyileştirici faktörler aşın yetişkin kök hücreleri programlamak için bir yöntem rapor. Bu platform, iskemi ve kanser gibi, burada kök hücreler olabilir, doğal olarak ana hastalıkların tedavisi için özellikle yararlıdır. Ayrıca, non-viral gene dağıtım platformu en doku rejenerasyonu ve yara için uygun olan tedavi edici faktörler, geçici aşırı ekspresyonu sağlar 9-10 işlemleri iyileşme. Transfeksiyon işlem hücrelere verimli DNA girişi bağlıdır ve genel olarak bölünmeyen hücrelerin yanı sıra aktif şekilde bölünen hücre tiplerinde de çalışır, ancak. PBAE polimerlerin transfeksiyon verimi hücre türünden hücre türüne göre değişebilir, ve ayrı ayrı optimize edilmesi gerekmektedir ve başka kimyasal yapısı değişiklikleri belirli bir hedef hücre popülasyonlarında optimum transfeksiyon verimi elde etmek için incelenebilir. Yukarıda tarif edilen yöntem ile transfekte edilmiş hücreler, 11-12 tipik olarak i sonuçlar2-4 gün civarında pik elde geni ifadesi ile iki hafta içinde geçici gen ekspresyonu ve protein salgılanması, n. Hayvan deneyleri için,% 20'nin üzerinde transfeksiyon verimi olan ADSCs uygun olarak kabul edilir. Bu FACS analizi bir süreç parametre sırasına tutarlılık (polimerler, plazmid ya da hücrelerin örneğin yeni toplu) korumak değiştiğinde her zaman gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
Bozunmayan böyle PEI ve Lipofectamine 2000 ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karşılaştırıldığında, yukarıda bildirilen platformunda kullanılan PBAE polimerler biyolojik olarak parçalanabilen ve klinik çeviri için daha uygundur. Bu tür polimerik vektörler hydrolytically 13 parçalanabilir ve ışık duyarlı olduğu göz önüne alındığında, dikkatli düzgün PBAE polimerlerin saklamak için (-20 ° C, karanlık, kurutucu) ile istenmeyen hidroliz ve bozulmasını önlemek için alınmalıdır. Elde edilen polimerler molekül ağırlığı dağılımına sahiptir ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) may daha Ayrıca, polimer sentez protokolü içerisinde her bir adımda, nükleer manyetik rezonans (NMR) gerçekleştirmek tavsiye edilir artmış transfeksiyon verimi. 14 PBAEs saflaştırmak için gerçekleştirilebilir. NMR bireysel bileşenlerden C32 oluşumunu doğrulamak için tekrar grupları 122, yani kapatma ucunun başarılı eklenmesini teyit etmek için gerçekleştirilmelidir. Not: uç kapak grupları ilave edildikten sonra, akrilat grupları NMR spektrumundan kaybolur. Nihai polimer içinde fazla amin sona monomerlerin varlığı, bu nedenle yeterli fazla monomerler kaldırılmasını sağlamak için, dietil eter içinde nihai polimerin yıkama için önemlidir, artan hücre toksisitesine yol açabilir. Yukarıda zikredildiği gibi, aynı zamanda SEC saflık nihai ürün için daha fazla kullanılabilir.
Çok sayıda viral bazlı gen verici platformlar farklı olarak, burada kullanılan polimer esaslı gen sağlama sistemi, böylece sokma m potansiyel riski kaçınarak konak genomu içine entegre değildirutagenesis ve immünojeniklik. 15-16
Açıklanan prosedürde, hücreler kodlayan proteinleri ve un-transfekte edilmiş hücrelerin aşırı ifade eden hücrelerden oluşan bir karışımı içeren, transfeksiyon işlemi, hemen sonra sıralama olmadan nakledilir. Bu yöntem, hücrelerin en az ex vivo işleme sağlar ve klinik olarak daha düşük çevrilebilir zaman, maliyet ve bulaşma şansı verilmiş olması muhtemeldir. Hücreler, aynı zamanda in situ olarak sadece daha fazla tedavi edici faktörlerin aşırı ekspresyonu seviyesini artırmak için transfekte edilmiş hücreleri seçmek için daha fazla saflaştırılabilir.
Anjiyogenez için programlanmış kök hücrelerin etkinliği iyice hücresel morfolojik ve fizyolojik içeren çoklu seviyelerde sonuçlarını değerlendirmek için testlerin bir arada kullanarak muayene edilmelidir. Bio-ışıldama, görüntüleme zaman hayatta kalma ve nakledilen hücrelerin dağılım gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Gen ifadesi harv analizleriested dokularının hücre hayatta doğrulama ve yerinde kodlanmış faktörler genetik up-regülasyonunu sağlar. Histolojik boyama damar yoğunluğu, inflamasyon ve doku rejenerasyonu doğrudan görselleştirme sağlar. Bu yeni oluşan damarlar olgunlaşmamış ve fonksiyonel olmayan olabilir gibi artan kan damarı yoğunluğu her zaman, başarılı bir kan reperfüzyon yol değildir unutulmamalıdır. Bu nedenle lazer Doppler perfüzyon görüntüleme kullanarak yeni oluşturulan damarlarının fizyolojik fonksiyonu değerlendirmek için önemlidir. Bir arka bacak anjiyojenezi, iskemi modelinde desteklemek için yağ elde edilen kök hücreleri kullanılarak dikkate yukarıdaki yöntemleri, ilaç verme araçları olarak programlama hücre kavramı geniş çapta uygulanabilir iken. Platform kolayca kanser ve kas-iskelet sistemi hastalıkları gibi diğer hastalıkların tedavi edilmesi için uygun olan tedavi edici etkenleri aşırı ifade eden diğer hücre tipleri programlamak için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar finansmanı için Amerikan Kalp Derneği Ulusal Bilim Geliştirme Hibe (10SDG2600001), Stanford Bio-X Disiplinlerarası Girişimi Programı ve Stanford Tıp Alimler Araştırma Programı kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10082 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| 1,4-Butanediol Diacrylate (90 %) | Sigma Aldrich | 411744 | Acronym: C |
| 5-amino-1-pentanol (97 %) | Alfa Aesar | 2508-29-4 | Acronym: 32 |
| Tetraethyleneglycoldiamine >99 %) | Molecular Biosciences | 17774 | Acronym: 122 |
| Sodium Acetate | G-Biosciences | R010 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| Diethyl Ether Anhydrous (>99 %) | Fisher Scientific | E138-4 | |
| DMSO Anhydrous (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G9391 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| D-luciferin | GoldBio | ||
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) | Tissue-Tek | 4583 | |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rat IgG | Invitrogen | A11007 |
References
- Deveza, L., Choi, J., Yang, F. Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases. Theranostics. 2, 801-814 (2012).
- Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).
- Mangi, A. A., et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).
- Lee, J. Y., et al. Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2. Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).
- Park, K. I., et al. Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury. Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).
- Yang, F., et al. Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors. Gene Ther. 16, 533-546 (2009).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Ceradini, D. J., et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat. Med. 10, 858-864 (2004).
- Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).
- Sunshine, J., et al. Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy. Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).
- Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery. Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(β-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Eltoukhy, A. A., et al. Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity. Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).
- Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans. Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).
- Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science. 303, 333 (2004).
