Summary
Effectuer des essais de culture cellulaire pour étudier l'adhésion bactérienne et l'invasion dans des conditions aérobies est généralement représentatif de la
Abstract
Les interactions des bactéries pathogènes avec les cellules hôtes ont été étudiés largement en utilisant des méthodes de culture cellulaire in vitro. Cependant, comme ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies, ces modèles in vitro peuvent ne pas représenter exactement l'environnement in vivo dans lequel les interactions hôte-pathogène du lieu. Nous avons développé un modèle in vitro de l'infection qui permet la co-culture des bactéries et des cellules hôtes dans des conditions différentes de gaz moyenne et. La Chambre de diffusion verticale (VDC) modèle reproduit les conditions de vie dans l'intestin humain où les bactéries seront dans des conditions de très faible teneur en oxygène des tissus, tout sera alimenté en oxygène du sang. Placer cellulaires monocouches épithéliales intestinales polarisées (IEC) cultivés dans des inserts Snapwell dans un VDC crée compartiments apical et basolatéral séparés. Le compartiment basolatéral est rempli avec un milieu de culture cellulaire, étanche et perfusé avec de l'oxygène WHILST le compartiment apical est rempli avec du bouillon, maintenu ouvert et incubés dans des conditions micro-aérobies. Les deux Caco-2 et T84 les IEC peuvent être maintenus dans le VDC dans ces conditions, sans aucun effet nocif apparent sur la survie de la cellule ou à l'intégrité de la monocouche. expériences de co-culture réalisées avec différents C. souches de type sauvage jejuni et les différentes lignes d'IEC dans le modèle VDC avec des conditions microaérobies dans le compartiment apical résultent reproductible par une augmentation du nombre d'interagir (près de 10 fois) et des bactéries intracellulaires (presque 100 fois) par rapport aux conditions de culture aérobies 1. L'environnement créé dans le modèle VDC rapproche le plus de l'environnement rencontrés par C. jejuni dans l'intestin humain et souligne l'importance d'effectuer des essais d'infection in vitro dans des conditions qui imitent de plus près la réalité dans vivo. Nous proposons que l'utilisation du modèle VDC permettra de nouvelles interprétations des interactions parierWeen bactéries pathogènes et des cellules hôtes.
Introduction
Les interactions des bactéries pathogènes avec les cellules hôtes ont été étudiés largement en utilisant des méthodes de culture cellulaire in vitro. L'utilisation de ces tests en culture cellulaire, l'adhérence des bactéries aux cellules hôtes, l'identification des récepteurs de la cellule hôte, la cellule hôte voies de signalisation et l'invasion bactérienne des cellules hôtes ont tous été étudiés en détail, ce qui entraîne de nombreuses observations importantes. Cependant, ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies qui peuvent ne pas être représentatifs de l'environnement in vivo. Une limite importante de modèles in vitro utilisés pour étudier les infections gastro-intestinales est que les conditions de culture, y compris des niveaux élevés d'oxygène sont généralement favorables à la survie des cellules eucaryotes. Toutefois, les conditions dans la lumière intestinale seront presque anaérobie. Pathogènes entériques dans un environnement très pauvre en oxygène expriment des gènes de virulence dont l'expression change dans des conditions aérobies 2. Ainsi, les données obtenues en utilisant la norme de culture cellulaire modèles may donner une indication inexacte des interactions bactériennes avec des cellules hôtes.
Campylobacter jejuni est la principale agent causal de la gastro-entérite aiguë bactérienne dans le monde entier, avec des symptômes allant de la diarrhée légère à grave entérite inflammatoire. La majorité des C. jejuni infections suite à une gastro-entérite sans complication, cependant C. jejuni est également agent infectieux le plus souvent mentionné dans les neuropathies périphériques, y compris le syndrome de Guillain-Barré (SGB). Au Royaume-Uni, on estime qu'il ya plus de 500.000 cas d'entérite causées par C. jejuni chaque année avec un coût prévu de l'économie britannique de 580 millions de livres sterling. Dans le monde en développement, C. jejuni est la principale cause de mortalité chez les enfants. Malgré l'importance incontestable de l'infection à Campylobacter et des décennies de recherche, y compris l'analyse fondée sur la génomique complète, C. jejuni pathogénie est encore mal understood, contrairement à d'autres pathogènes entériques tels que Salmonella, Escherichia coli, Shigella et Vibrio cholerae. L'absence d'un modèle pratique des petits animaux est l'une des principales raisons de cette 3. Aussi le largement utilisé dans les modèles d'infection in vitro sont plus inapproprié pour étudier microaerophilic C. jejuni que pour d'autres pathogènes entériques qui sont anaérobies facultatives. Alors que C. jejuni est reconnu comme un pathogène invasif, les mécanismes de C. jejuni invasion des cellules épithéliales intestinales (SAVA) sont encore peu claire 4,5. C. invasion jejuni a été montré pour être dépendant soit microfilaments, microtubules, une combinaison des deux, ou ni 5. La confusion dans ce domaine est très probablement dû à l'utilisation d'inapproprié dans des conditions d'essai in vitro.
Un certain nombre d'essais de culture de cellules ont été utilisées pour étudier les interactions de C. jejuniavec des cellules hôtes. Caco-2 6 INT 407 7, 8 et T84 lignées cellulaires ont été utilisées pour étudier les capacités d'adhérence et l'invasion de différentes C. souches jejuni. Toutefois, les niveaux d'adhérence bactérienne et l'invasion de C. jejuni avec les IEC sont considérablement inférieurs à ceux des autres pathogènes entériques 9. La co-culture de C. jejuni avec les IEC est normalement effectuée dans un incubateur à CO 2 dans des conditions proches de la teneur en oxygène dans l'atmosphère, nécessaire pour la survie des CEI. C. l'expression du gène jejuni sera très différent dans l'environnement pauvre en oxygène de la lumière intestinale par rapport aux conditions de l'oxygène atmosphérique.
L'utilisation d'un système de chambre de diffusion verticale (VDC) a été développé qui permet la co-culture des bactéries et des cellules hôtes dans des conditions différentes de gaz 1,10,11 et moyennes. Ce système imite les conditions de vie dans l'intestin humain où les bactéries seront nonder conditions de très faible d'oxygène des tissus tout en seront alimentés en oxygène du sang. IEC monocouches polarisées cultivées dans des filtres de 0,4 um spéciaux ont été placés dans un VDC créant un compartiment apical et basolatéral, qui ont été remplis individuellement avec le bouillon bactérien et un milieu de culture de cellules, respectivement (figure 1). Le VCC a été placée dans l'atmosphère variables incubateur contenant 85% de N 2, 5% de O 2, et 10% de CO2 à 37 ° C, ce qui représente les conditions optimales pour C. jejuni. Le compartiment apical a été laissée ouverte et exposée à l'atmosphère microaérobies à l'intérieur de l'atmosphère variables incubateur, tandis que le compartiment basolatéral scellé a été alimenté avec de l'oxygène par l'administration constant de 5% de CO 2 / O mélange gazeux de 95% 2, avec un tube de sortie empêchant l'accumulation de pression . Caco-2 survie cellulaire et l'intégrité de la monocouche dans ces conditions ont été confirmées par le suivi élément transepithelialrésistance ctrical (TEER) à travers la monocouche de plus de 24 h de démontrer la survie des cellules Caco-2, la monocouche cellulaire et la séparation physique des compartiments basolatéral et apical dans des conditions pauvres en oxygène dans le compartiment apical. Le TEER de monocouches dans CDV entretenues dans l'atmosphère incubateur variable (conditions microaérobies) et dans une culture cellulaire CO 2 incubateur standard (conditions aérobies) n'a pas montré de différences significatives, ce qui indique l'intégrité de la monocouche cellulaire sous différentes conditions atmosphériques 1. Dans des conditions microaérobies, jonctions serrées sont restés présents et répartis uniformément entre les bordures de cellules avec un motif de coloration occludine similaire à des cellules maintenues dans des conditions aérobies 1.
Les interactions de C. jejuni avec Caco-2 et T84 cellules dans le VDC a été étudiée en évaluant l'interaction bactérienne (adhésion et l'invasion) et l'invasion. Deux différente C. jejuni de type sauvage strains ont été utilisés 1. C. jejuni 11168H est un dérivé hypermotile de la souche de la séquence originale NCTC11168. La souche 11168H montre les niveaux de colonisation beaucoup plus élevées dans un modèle de colonisation de poussin et est donc considérée comme une souche appropriée à utiliser pour les études sur les interactions hôte-pathogène. 81-176 est d'isoler un humain et est l'une des souches de laboratoire largement étudiés les plus envahissantes. C. souches jejuni ont été ajoutés au compartiment apical d'un VDC vertu soit des conditions micro-aérobies ou aérobie. Nous avons observé des taux plus élevés pour les deux interaction et l'invasion ont été enregistrées pour C. jejuni dans des conditions microaérobies 1. L'augmentation C. interactions jejuni n'étaient pas dues à une augmentation du nombre de bactéries dans des conditions microaérobies 1. Ces données confirment notre hypothèse que l'environnement faible en oxygène dans le compartiment apical de la VDC améliore les interactions bactéries-hôte et indique que les propriétés invasives de C. jejuni sont incrassouplies dans ces conditions. Ce fut le premier rapport de l'utilisation du modèle VDC pour étudier une bactérie pathogène invasif et souligne l'importance d'effectuer des essais d'infection in vitro dans des conditions qui imitent de plus près la situation in vivo. Le modèle VDC pourrait être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène pour de nombreuses espèces bactériennes différentes.
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Protocol
1. La croissance de monocouches CEI sur spéciaux 0.4 Filtres um
- Cellules Caco-2 Culture en milieu essentiel modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 1% (v / v) les acides aminés non essentiels dans un incubateur de culture tissulaire standard à 37 ° C dans 5% de CO 2 et 95% d'air. Seed 4 x 10 5 cellules Caco-2 par les IEC 0,4 um filtrent et poussent à la polarisation pendant 21 jours, en changeant les médias tous les 2-3 jours.
- Mesurer la TEER pour confirmer l'état de polarisation de la monocouche en utilisant un appareil de mesure de résistance Volt-Ohm. Dans nos études, le TEER de 21 jours Caco-2 des cellules cultivées dans ces filtres de 0,4 um est 700-800 Qcm2.
2. Préparation de C. jejuni et le milieu bactérien pour le test de co-culture
- 24 heures avant le point de départ souhaitée du test de co-culture VDC, préparer une plaque de gélose au sang frais de C. jejuni et incuber à 37 ° C dans des conditions microaérobies (85% de N 2, 5% de O 2, et 10% de CO 2) dans l'atmosphère variables incubateur.
- Dans le même temps, préincuber 30 ml de bouillon Brucella à 37 ° C dans des conditions microaérobies dans une atmosphère incubateur variable.
3. Préparation et stérilisation de la moitié Chambers VDC avant l'essai
- Chambres immerger complètement VDC demi ainsi que les joints toriques et les bouchons dans la solution de stérilisation.
- Utilisation d'une seringue de 20 ml stérile, rincer la solution de stérilisation à travers les arrivées de gaz dans les deux demi-chambres. Ne pas le faire peut entraîner la contamination des échantillons au cours de co-culture.
- Laisser tous les composants immergés dans la solution de stérilisation à> 1 h.
- Rincer tous les composants avec de l'eau stérile frais, en utilisant une autre seringue de 20 ml stérile pour rincer les entrées de gaz.
4. Préparationde l'inoculum bactérien
- Récolter un demi-plaque de C. croissance jejuni à partir de la plaque de gélose au sang préparé la veille dans 1 ml de bouillon de brucella préincubé. Ceci devrait vous donner ~ 10 10 UFC / ml.
- Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à 600 nm à semiquantify unités formatrices de colonies bactériennes (UFC).
- Régler la suspension bactérienne au niveau de l'inoculum désiré dans 4 ml de bouillon de brucella préincubé.
- Effectuer une dilution en série de cette suspension bactérienne finale suivie par placage des dilutions appropriées sur des plaques de gélose au sang en trois exemplaires, puis incuber à 37 ° C dans l'atmosphère variables incubateur pendant 48 heures afin de quantifier le nombre d'UFC bactériennes présentes dans l'inoculum.
5. Mise en place du VDC
- Placez la moitié inférieure de la chambre un appartement VDC sur le banc. Monter un joint torique sur la demi-chambre basse.
- Détacher un filtre portant les IEC de til porte et laver trois fois avec 400 pi de PBS stérile. Placer le filtre sur la moitié chambre basse, en s'assurant que le joint torique reste en place.
- Abaissez doucement la demi-chambre supérieure en place. Une fois les deux demi-chambres sont assemblées, serrer ensemble à l'aide des plaques de serre-joints. Placez le VDC horizontalement sur la paillasse, avec les deux ouvertures vers le haut.
- Ajouter les 4 ml d'inoculum bactérien dans la moitié apicale chambre.
- Ajouter 4 ml de milieu de culture de cellules dans la demi-chambre basolatérale.
- Placer les pièces d'extrémité dans les ouvertures sur les deux demi-chambres.
6. Fixation du VDC pour le collecteur de gaz au sein de l'incubateur d'Atmosphere variable
- Placer le VCC dans l'atmosphère variables incubateur à proximité du collecteur de gaz.
- Ouvrir le régulateur d'alimentation en gaz relié au collecteur de gaz. Fixer le tube à partir du collecteur dans l'entrée de gaz sur la demi-chambre basolatérale de la VDC. Fixez le gas tuyau de sortie menant hors de l'atmosphère variables incubateur à l'une des sorties de l'embout sur la demi-chambre basolatérale.
- Fermez l'autre sortie dans l'embout sur la demi-chambre basolatérale. Ouvrez le flux de gaz sur le collecteur de gaz, en prenant soin de l'ouvrir très lentement pour éviter de surpression de gaz, car cela peut conduire à l'expulsion du milieu basolatéral.
- L'objectif est un débit de gaz de 1 bulle toutes les 2-5 secondes. Vérifiez périodiquement le débit de gaz au cours de l'expérience et de l'ajuster si nécessaire.
7. Démontage de la VDC après Coculture
- Après la période de co-culture approprié, fermer le régulateur d'alimentation en gaz relié au collecteur de gaz. Fermez le flux de gaz dans le VDC au niveau du collecteur. Déconnecter l'entrée de gaz, la sortie de gaz et le bouchon du VDC.
- Retirez le VDC d'une atmosphère incubateur variable. Retirer le surnageant apical et basolatéral et conserver à -80 ° C pour subsequenanalyse t.
- Enlevez les colliers de serrage et de prendre doucement à la VDC. Retirez le filtre de la chambre de moitié et le transfert d'une boîte de culture de cellules de 6 puits stérile. Laver les IECS trois fois avec 400 pi de PBS stérile.
- Pour le dénombrement du nombre total de bactéries interagissent, ajouter 400 pi de PBS stérile contenant 0,1% (v / v) de Triton X-100 à les IEC et incuber pendant 20 min à température ambiante pour lyser la CEI. Effectuer une dilution en série de ce lysat cellulaire suivie par placage des dilutions appropriées sur des plaques de gélose au sang en trois exemplaires, puis incuber à 37 ° C dans l'atmosphère variables incubateur pendant 48 heures afin de quantifier le nombre d'interagir UFC bactériennes.
- Pour le dénombrement du nombre total de bactéries envahissent, ajouter 400 ul de milieu de culture cellulaire DMEM contenant 150 ug / ml de gentamicine pour les IEC et les incuber pendant 2 heures dans un incubateur de culture tissulaire standard à 37 ° C dans 5% de CO 2 et 95% air pour tuer les bactéries extracellulaires,puis suivre comme pour l'étape 7.4 ci-dessus.
8. Nettoyage de la VDC après Coculture
Laver le VDC avec de l'eau stérile et stocker pour la prochaine série d'expériences.
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Representative Results
expériences de co-culture effectuées avec un C. jejuni souche et les IEC dans le modèle VCC avec des conditions microaérobies dans le compartiment apical de type sauvage ont montré une augmentation du nombre d'interaction (près de 10) et les bactéries intracellulaires (près de 100 fois) par rapport à des conditions de culture aérobies dans un temps une manière dépendante. Cette observation était reproductible en utilisant deux différents C. jejuni souches de type sauvage (11168H et 81-176) et deux lignes différentes CEI (Caco-2 et T84), en soulignant la validité du modèle VDC 1.
Les résultats représentatifs présentés ici sont une comparaison entre le nombre de C. jejuni interagir avec ou envahir les cellules Caco-2 après 3, 6 ou 24 heures de co-culture Dans les deux conditions d'essai de culture de cellules standard dans un incubateur à CO 2 (Figures 2A et B) ou dans le modèle VDC avec conditions microaérobies dans la com apicaldépartement (figures 2C et D). Les données de deux C. différent souches de type sauvage jejuni (11168H et 81-176) sont présentés. Dans les conditions de culture cellulaire standard utilisés dans la grande majorité des études dans la littérature scientifique, <10 7 ufc ont été observés en interaction avec cellules Caco-2 (figure 2A) par rapport à ~ 10 8 ufc observé l'interaction avec les cellules Caco-2 dans le VDC modèle (figure 2C) après 24 heures. Après co-culture dans le modèle VDC, ~ 10 7 ufc intracellulaire ont été isolés à partir de Caco-2 cellules (figure 2D), comparativement à seulement ~ 10 5 intracellulaire ufc isolé de Caco-2 cellules (figure 2B) après co-culture dans des conditions de culture cellulaire standard pour 24 heures.
Une comparaison directe entre le nombre de C. jejuni interagir avec les IEC ou d'envahir après co-culture dans le modèle VDC avec soit microaérobie ou aérobie conditionstions dans le compartiment apical a été effectuée précédemment 1. Utilisation des résultats du modèle VDC à une augmentation de l'interaction C. jejuni de près de 10 fois et une augmentation de la concentration intracellulaire C. jejuni de près de 100 fois après 24 h coculture 1.
Figure 1. Schéma de la Chambre de diffusion verticale (VDC) modèle. Des cellules épithéliales intestinales (SAVA) sont cultivés sur perméables 0,4 um supports de filtres et inséré dans un VDC, créant ainsi une apical et un compartiment basolatéral. Ces compartiments peuvent ensuite être ajustés individuellement par rapport aux moyennes et la composition du gaz pour permettre la co-culture de les IEC avec C. jejuni avec les conditions microaérobies à la surface apicale de les IEC et des conditions aérobies à la surface basolatérale de les IEC.
Figure 2. Les résultats représentatifs comparant le nombre de C. jejuni 11168H ou 81-176 souches de type sauvage qui interagissent avec (A et C) ou d'envahir (B et D) des cellules Caco-2 après 3, 6 ou 24 heures lorsque le test de co-culture a été effectuée en vertu, soit des conditions de culture de cellules standard dans un CO 2 incubateur (A et B) ou dans le modèle VDC avec conditions microaérobies dans le compartiment apical (C et D). Toutes les expériences représentent au moins trois répétitions biologiques réalisées en double dans chaque expérience. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
L'utilisation de méthodes de culture cellulaire in vitro pour étudier les interactions entre les pathogènes bactériens avec des cellules hôtes est une technique largement utilisée dans de nombreux laboratoires de recherche. Cependant, comme ces essais de culture de cellules sont réalisées dans des conditions aérobies, ces modèles in vitro peuvent ne pas représenter exactement l'environnement in vivo dans lequel les interactions hôte-pathogène du lieu. La largement utilisé dans des modèles d'infection in vitro sont particulièrement inapproprié pour étudier microaerophilic C. jejuni par rapport à d'autres pathogènes entériques qui sont anaérobies facultatives. Il ya beaucoup de confusion dans la littérature concernant les mécanismes d'invasion des CEI humaines par C. jejuni 4,5. Nous suggérons que la raison pour laquelle les mécanismes d'invasion sont si mal compris, c'est parce que les modèles in vitro utilisés dans ces études ne reflètent pas fidèlement la situation in vivo. En utilisant des essais de culture de cellules standard, le niveaude C. jejuni invasion des CEI est toujours très faible 9. Le développement du modèle VDC était notre réponse à régler ce problème.
Nous avons établi que deux lignes CEI différents peuvent être maintenus dans le VDC avec des conditions micro-aérobies à la surface apicale, sans effets défavorables observées sur une période de 24 heures 1. Une augmentation en fonction du temps le nombre de fois interaction intracellulaire et C. les bactéries de la souche de type sauvage jejuni 11168H a été observée après co-culture avec des cellules Caco-2 les IEC dans le VDC avec des conditions microaérobies dans le compartiment apical 1. Ces observations ont été confirmées à l'aide d'une deuxième ligne CEI (T84) ainsi qu'un second C. jejuni souche de type sauvage (81-176), ce qui indique aucune lignée de cellules bactériennes ou des effets spécifiques de contrainte 1. Ces niveaux accrus d'interaction bactérienne et l'invasion a entraîné une augmentation de la réponse immunitaire, polarisée innée parmi les IEC 1. Higses niveaux d'IL-8 ont été détectés après coculture microaérobie, indiquant que le défi bactérienne accrue s'accompagne d'une réponse de l'hôte accrue. Des niveaux plus élevés d'IL-8 ont été détectés dans les surnageants basolatérales par rapport aux surnageants apicale, indiquant que la sécrétion d'IL-8 par les IEC se produit principalement à partir de la surface basolatérale CEI. IL-8 est une attraction des neutrophiles, ce qui serait d'une utilité limitée dans la lumière intestinale. Ces données démontrent que l'installation de deux compartiments de la VDC permet également l'identification efficace d'une réponse de l'hôte polarisée.
Plusieurs caractéristiques pour le côté / de configuration technique du modèle VDC doivent être considérés avant d'appliquer le modèle pour étudier tout organisme pathogène. Tout d'abord, les IEC doivent être cultivés pour former une monocouche imperméable à 0,4 um filtres spéciaux. Cela prend entre 14-21 jours selon la lignée cellulaire utilisée et rend les expériences assez longs par rapport au classique cocultuexpériences annulaires réalisées dans des plaques de culture de cellules et utilisant les IEC cultivées pour entre 1-7 jours. D'autre part, seulement après une si longue période de croissance sont les IEC été démontrée pour former une monocouche complètement polarisée. Ces monocouches polarisées imitent la situation in vivo dans l'épithélium intestinal humain beaucoup plus étroitement que les lignes CEI nonconfluent non polarisés utilisés dans certaines études et à ce titre offrir un autre avantage du modèle VDC. Deuxièmement, les particuliers 0,4 um filtres sont nettement plus chers que d'une plaque de culture cellulaire de 24 puits standard. La principale limitation de la VDC est le débit relativement faible. Ceci est principalement dû à la disponibilité des chambres VDC et la configuration nécessitant le collecteur de gaz. Seul un nombre relativement faible de répétitions parallèles peuvent être effectuées en une seule fois, contrairement à la méthode de culture cellulaire classique. Le modèle VDC est donc moins adapté à des expériences de criblage à grande échelle ou des expériences nécessitant un nombre élevé de répliqueTES. Un autre facteur à prendre en considération est ce que les moyens de l'effet de la gravité de l'exécution des tests dans le modèle de coculture VCC que les bactéries de temps plus vont commencer à agrégat au fond du compartiment apical entraînant possibilité réduite pour les interactions avec la monocouche CEI. Cependant, l'utilisation du modèle VDC, nous avons montré que les interactions d'un immobiles, non agrégeant 11168H rpoN mutant sont considérablement réduits par rapport à la motilité, l'agrégation souche de type sauvage 11168H après 6 heures 1. Nous travaillons actuellement sur les modifications apportées au modèle VDC qui permettrait à un certain mélange dans le compartiment apical qui serait mieux imiter le péristaltisme dans le lumen de l'intestin. Par conséquent, tandis que le modèle VDC est meilleure que les méthodes de culture de cellules aérobies classiques dues à imiter de plus près la situation in vivo, en particulier pour les bactéries comme C. jejuni qui avez des conditions atmosphériques rigoureuses, le modèle VDC a encore certaines restrictions qui doivent être prisesen compte lors de la conception d'expériences.
Nos données confirment les conclusions rapportées pour un modèle de VDC similaire à celle utilisée pour étudier le pathogène gastrique Helicobacter pylori humaine, qui a montré une adhérence accrue des bactéries aux cellules de l'hôte, l'augmentation de la synthèse des facteurs de virulence bactériens ainsi que d'un hôte augmentation de la réponse immunitaire innée lorsque H. pylori a été co-cultivées avec des cellules épithéliales sous microaérobie par rapport aux conditions aérobies 11. Comme les deux H. C. pylori et jejuni nécessitent des conditions microaérobies pour la croissance, la constatation que les conditions microaérobies promouvoir l'interaction des organismes avec des cellules hôtes n'est pas surprenant. Cependant, une autre étude utilisant un système VDC pour analyser les interactions des anaérobie facultatif Escherichia coli entérohémorragique avec les IEC a démontré des niveaux accrus d'interaction bactérienne dans des conditions anaérobies coculture / microaérobie dans le compartiment apical VDC 10. Tson indique que le comportement des bactéries qui sont capables de proliférer dans des conditions d'oxygène dans l'atmosphère est également changé lorsque co-cultivées avec les IEC dans des conditions anaérobies / microaérobie. Ceci suggère que le modèle VDC est un modèle amélioré et précieux pour l'analyse des interactions hôte-pathogène de nombreuses bactéries pathogènes dans des conditions qui ressemblent plus fidèlement la situation in vivo dans la lumière intestinale humaine en.
Du point de vue du modèle, le modèle VDC s'est avéré posséder des avantages évidents par rapport aérobie à C. jejuni modèles de co-culture-IEC in vitro. L'environnement créé dans le modèle VDC rapproche le plus de l'environnement dans l'intestin humain au cours de C. jejuni, conduisant à une augmentation très importante du nombre de bactéries interagissent avec et envahir les IEC. Le modèle VDC dans ce format actuel est idéal pour étudier les interactions entre les bactéries entériques à l'estomac ou à l'intestinles cellules épithéliales, mais il ya la possibilité d'adapter le modèle de VDC pour l'étude des bactéries anaérobies strictes à partir d'échantillons de selles ou de prélèvements microbiologiques orales, que deux exemples. Le principe important doit toujours être de viser à réaliser ces expériences coculture dans des conditions qui imitent de plus près la situation in vivo. Le modèle VDC sera un outil important pour poursuivre des études de C. jejuni interactions hôte-pathogène et devraient être applicables à l'étude des mécanismes pathogènes de nombreuses bactéries.
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Dominic Mills a été soutenu par une Bloomsbury collèges PhD stagiaire (2007-2010). Les auteurs tiennent à remercier tous les deux Ozan Gundogdu et Abdi Elmi pour leur aide dans l'élaboration du modèle VDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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