Summary
एरोबिक परिस्थितियों में बैक्टीरियल आसंजन और आक्रमण की जांच के लिए सेल संस्कृति assays के प्रदर्शन का आमतौर पर unrepresentative है
Abstract
मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की बातचीत विट्रो सेल संस्कृति तरीकों में उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर जांच की गई है. इस तरह के सेल संस्कृति assays के एरोबिक शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि इन विट्रो मॉडल में सही मेजबान रोगज़नक़ बातचीत जगह ले जिसमें vivo वातावरण में प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता. हम विभिन्न मध्यम और गैस परिस्थितियों में बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के coculture परमिट कि संक्रमण का एक में इन विट्रो मॉडल विकसित किया है. कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर (समिति) मॉडल बैक्टीरिया बहुत कम ऑक्सीजन whilst के ऊतकों की शर्तों के तहत किया जाएगा, जहां मानव आंत में स्थितियों को रक्त प्रवाह से ऑक्सीजन की आपूर्ति की जाएगी mimics. एक समिति में Snapwell आवेषण में उगाई ध्रुवीकृत आंतों उपकला सेल (आईईसी) monolayers रखकर अलग शिखर और basolateral डिब्बों बनाता है. basolateral डिब्बे, सेल संस्कृति माध्यम से भरा सील और ऑक्सीजन w के साथ perfused हैशिखर डिब्बे hilst शोरबा से भर जाता है, खुला रखा और microaerobic परिस्थितियों में incubated. Caco -2 और T84 दोनों IECs सेल अस्तित्व या monolayer की अखंडता पर कोई स्पष्ट हानिकारक प्रभाव के बिना इन शर्तों के तहत ग्राम रक्षा समिति में बनाए रखा जा सकता है. Coculturing प्रयोगों अलग सी. के साथ प्रदर्शन शिखर डिब्बे में microaerobic शर्तों के साथ जेजुनी जंगली प्रकार उपभेदों और ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में अलग आईईसी लाइनों reproducibly एरोबिक संस्कृति की स्थिति की तुलना में एक बातचीत के दौरान की संख्या (लगभग 10 गुना) में वृद्धि और intracellular (लगभग 100 गुना) बैक्टीरिया में परिणाम 1. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में बनाया माहौल और अधिक बारीकी सी. द्वारा सामना वातावरण mimics और मानव आंत में जेजुनी अधिक बारीकी विवो वास्तविकता में है कि नकल की शर्तों के तहत इन विट्रो संक्रमण assays में प्रदर्शन के महत्व पर प्रकाश डाला गया. हम समिति मॉडल का उपयोग करें कि बातचीत की नई व्याख्याओं शर्त अनुमति देगा का प्रस्तावबैक्टीरियल रोगज़नक़ों और मेजबान कोशिकाओं को समझना.
Introduction
मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की बातचीत विट्रो सेल संस्कृति तरीकों में उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर जांच की गई है. इस तरह के सेल संस्कृति assays के मेजबान कोशिकाओं को बैक्टीरियल आसंजन, मेजबान सेल रिसेप्टर्स, रास्ते और मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण संकेत मेजबान सेल की पहचान का उपयोग करना सभी कई महत्वपूर्ण टिप्पणियों में जिसके परिणामस्वरूप विस्तार से अध्ययन किया गया है. हालांकि इस तरह के सेल संस्कृति assays के vivo वातावरण में की प्रतिनिधि नहीं हो सकता कि एरोबिक शर्तों के तहत किया जाता है. गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमण का अध्ययन किया विट्रो मॉडल में से एक प्रमुख सीमा उच्च ऑक्सीजन का स्तर सहित संस्कृति की स्थिति आम तौर पर यूकेरियोटिक सेल अस्तित्व के पक्ष में है. हालांकि आंतों लुमेन में स्थिति लगभग अवायवीय हो जाएगा. एक बहुत कम ऑक्सीजन वातावरण में आंत्र रोगजनकों जिनकी अभिव्यक्ति परिवर्तन एरोबिक शर्तों के तहत 2 डाह जीन व्यक्त करते हैं. जैसे, डेटा मानक सेल संस्कृति मॉडल मीटर का उपयोग कर प्राप्तप्र मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल बातचीत के एक गलत संकेत देते हैं.
Campylobacter jejuni हल्के दस्त से गंभीर भड़काऊ आंत्रशोथ को लेकर है कि लक्षणों के साथ, दुनिया भर में बैक्टीरियल तीव्र आंत्रशोथ का प्रमुख प्रेरणा का एजेंट है. सी. के बहुमत सीधी आंत्रशोथ में जेजुनी संक्रमण के परिणाम, तथापि सी. जेजुनी भी Guillain-Barre सिंड्रोम (जीबीएस) सहित परिधीय neuropathies में सबसे अधिक पहचान संक्रामक एजेंट है. ब्रिटेन में, यह सी. के कारण आंत्रशोथ के 500,000 से अधिक मामलों रहे हैं अनुमान है कि £ 580000000 की ब्रिटेन की अर्थव्यवस्था के लिए एक अनुमानित लागत के साथ जेजुनी संक्रमण हर साल. विकासशील दुनिया में, सी. जेजुनी बच्चों में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है. ज़ाहिर कैम्पिलोबैक्टर संक्रमण का महत्व और पूरी तरह से जीनोमिक्स आधारित विश्लेषण, सी सहित अनुसंधान के दशकों के बावजूद जेजुनी रोगजनन अभी भी खराब समझ हैood, ऐसे साल्मोनेला, ई. कोलाई, शिगेला, और विब्रियो कोलरा के रूप में अन्य आंतों रोगजनकों के विपरीत. एक सुविधाजनक छोटे पशु मॉडल की कमी इस 3 के लिए एक प्रमुख कारण है. इसके अलावा व्यापक रूप से इन विट्रो संक्रमण मॉडल में इस्तेमाल microaerophilic सी. के अध्ययन के लिए और अधिक अनुचित हैं ऐच्छिक anaerobes हैं कि अन्य आंतों रोगजनकों के लिए की तुलना जेजुनी. Whilst सी. जेजुनी एक आक्रामक रोगज़नक़, सी. के तंत्र के रूप में मान्यता प्राप्त है आंतों उपकला कोशिकाओं के जेजुनी आक्रमण (IECs) अभी 4,5 स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. सी. जेजुनी आक्रमण या तो microfilaments, सूक्ष्मनलिकाएं, दोनों का एक संयोजन या न 5 पर निर्भर होना दिखाया गया है. इस क्षेत्र में भ्रम की स्थिति सबसे शायद इन विट्रो परख स्थितियों में अनुपयुक्त के उपयोग की वजह से है.
अलग सेल संस्कृति assays के एक नंबर सी की बातचीत की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है जेजुनीमेजबान कोशिकाओं के साथ. Caco-2 6, INT 407 7, और T84 8 सेल लाइनों के सभी विभिन्न सी. के आसंजन और आक्रमण क्षमताओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है jejuni उपभेदों. हालांकि, सी के लिए बैक्टीरियल आसंजन और आक्रमण के स्तर IECs साथ जेजुनी अन्य आंतों रोगजनकों 9 से नाटकीय रूप से कम कर रहे हैं. सी. के coculturing IECs साथ जेजुनी सामान्य रूप से IECs के अस्तित्व के लिए आवश्यक है, वायुमंडलीय ऑक्सीजन के स्तर के करीब परिस्थितियों में एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में किया जाता है. सी. जेजुनी जीन अभिव्यक्ति वायुमंडलीय ऑक्सीजन की स्थिति की तुलना में आंतों लुमेन के कम ऑक्सीजन वातावरण में बहुत अलग हो जाएगा.
एक कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर (समिति) प्रणाली का उपयोग विभिन्न मध्यम और गैस शर्तों 1,10,11 तहत बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं के coculture परमिट जो विकसित किया गया है. इस प्रणाली बैक्टीरिया संयुक्त राष्ट्र होगा जहां मानव आंत में शर्तों mimicsबहुत कम ऑक्सीजन whilst के ऊतक के डेर शर्तों रक्त प्रवाह से ऑक्सीजन की आपूर्ति की जाएगी. विशेष 0.4 माइक्रोन फिल्टर में उगाई फूट डालना आईईसी monolayers के अलग - अलग बैक्टीरिया शोरबा और क्रमशः सेल संस्कृति माध्यम (चित्रा 1) के साथ भर दिया गया है, जो एक शिखर और basolateral डिब्बे बनाने, एक ग्राम रक्षा समिति में रखा गया था. ग्राम रक्षा समिति चर माहौल इनक्यूबेटर 37 में 85% एन 2, 5% 2 हे, और 10% सीओ 2 युक्त डिग्री सेल्सियस, सी. के लिए इष्टतम स्थितियों का प्रतिनिधित्व में रखा गया था जेजुनी. शिखर डिब्बे खुला छोड़ दिया और चर माहौल इनक्यूबेटर भीतर microaerobic वातावरण के संपर्क में था, मोहरबंद basolateral डिब्बे whilst 5% सीओ 2 / दबाव के संचय को रोकने के लिए एक दुकान ट्यूब के साथ 95% 2 हे गैस मिश्रण के लगातार प्रशासन द्वारा ऑक्सीजन की आपूर्ति के साथ किया गया था . इन परिस्थितियों में Caco -2 सेल अस्तित्व और monolayer की अखंडता transepithelial तत्वों की निगरानी के द्वारा पुष्टि की गई24 घंटा से अधिक monolayer भर ctrical प्रतिरोध (तीर) शिखर डिब्बे में कम ऑक्सीजन परिस्थितियों में शिखर और basolateral डिब्बों की Caco -2 सेल monolayer और शारीरिक जुदाई के अस्तित्व को प्रदर्शित करने के लिए. चर माहौल इनक्यूबेटर (microaerobic शर्तों) में और एक मानक सेल संस्कृति सीओ 2 इनक्यूबेटर (एरोबिक शर्तों) में बनाए रखा ग्राम रक्षा समितियों में monolayers के तीर विभिन्न वायुमंडलीय स्थितियों 1 के तहत सेल monolayer की अखंडता को दर्शाता है, कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया. Microaerobic शर्तों के तहत, तंग जंक्शनों वर्तमान और समान रूप से एरोबिक स्थितियों 1 के तहत बनाए रखा कोशिकाओं के समान occludin धुंधला पैटर्न के साथ सेल की सीमाओं के बीच वितरित बने रहे.
सी. की बातचीत ग्राम रक्षा समिति में Caco -2 और T84 कोशिकाओं के साथ जेजुनी बैक्टीरियल बातचीत (आसंजन और आक्रमण) और आक्रमण का आकलन करने से जांच की गई. दो अलग सी. जेजुनी जंगली प्रकार straiएनएस 1 इस्तेमाल किया गया. सी. जेजुनी 11168H मूल अनुक्रम तनाव NCTC11168 की एक hypermotile व्युत्पन्न है. 11168H तनाव एक लड़की बसाना मॉडल में बहुत अधिक उपनिवेशवाद के स्तर से पता चलता है और इस प्रकार मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए उपयोग करने के लिए एक उपयुक्त तनाव माना जाता है. 81-176 एक मानव को अलग है और सबसे आक्रामक व्यापक रूप से अध्ययन प्रयोगशाला उपभेदों में से एक है. सी. jejuni उपभेदों microaerobic या एरोबिक शर्तों या तो अधीन एक समिति के शिखर डिब्बे में जोड़ा गया था. हम बातचीत और आक्रमण दोनों के लिए उच्च दर सी. के लिए दर्ज किया गया मनाया microaerobic शर्तों के तहत 1 जेजुनी. बढ़ी हुई सी. जेजुनी बातचीत microaerobic शर्तों के तहत 1 जीवाणु की संख्या में वृद्धि के कारण नहीं थे. इस डेटा में ग्राम रक्षा समिति के शिखर डिब्बे में कम ऑक्सीजन वातावरण बैक्टीरिया मेजबान बातचीत को बढ़ाता है और यह संकेत करता है कि हमारी परिकल्पना का समर्थन करता है कि सी. के आक्रामक गुण जेजुनी incr हैंइन परिस्थितियों में ढील. यह एक आक्रामक जीवाणु रोगज़नक़ अध्ययन करने के लिए ग्राम रक्षा समिति के मॉडल के उपयोग की पहली रिपोर्ट था और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में है कि नकल की शर्तों के तहत इन विट्रो संक्रमण assays में प्रदर्शन के महत्व पर प्रकाश डाला गया. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल के कई अलग अलग प्रजातियों के जीवाणु के लिए मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
1. विशेष 0.4 माइक्रोन फिल्टर पर आईईसी monolayers की ग्रोथ
- है Dulbecco संशोधित आवश्यक मीडिया में संस्कृति Caco-2 कोशिकाओं (DMEM) 10% (v / v) भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% (v / v) एक में nonessential अमीनो एसिड के साथ पूरक 37 में मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर ° 5% सीओ 2 और 95% हवा में सी. बीज 4 एक्स 10 5 Caco-2 0.4 माइक्रोन प्रति IECs फिल्टर और 21 दिन से अधिक ध्रुवीकरण करने के लिए विकसित, मीडिया हर 2-3 दिनों बदल रहा है.
- एक वाल्ट ओम प्रतिरोध मीटर का उपयोग monolayer के ध्रुवीकरण की स्थिति की पुष्टि करने के लिए तीर उपाय. हमारे अध्ययन में, 21 दिन की Teer Caco-2 इन 0.4 माइक्रोन फिल्टर में विकसित कोशिकाओं 700-800 Ωcm 2 है.
2. सी. की तैयारी जेजुनी और Coculturing परख के लिए बैक्टीरियल मध्यम
- ग्राम रक्षा समिति coculturing परख की वांछित शुरुआती बिंदु से पहले 24 घंटा, सी के एक ताजा रक्त अगर प्लेट तैयार. 37 में जेजुनी और सेते डिग्री सेल्सियस चर माहौल इनक्यूबेटर में microaerobic शर्तों (85% एन 2, 5% 2 हे, और 10% सीओ 2) के तहत.
- इसी समय, एक चर माहौल इनक्यूबेटर में microaerobic शर्तों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर brucella शोरबा की 30 मिलीलीटर preincubate.
3. तैयारी और परख करने से पहले समिति आधा मंडलों का बंध्याकरण
- पूरी तरह से विसर्जित ग्राम रक्षा समिति के आधे कक्षों के साथ ही O-अंगूठी और नसबंदी समाधान में प्लग.
- एक बाँझ 20 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, आधा कक्षों दोनों में गैस inlets के माध्यम से नसबंदी समाधान निकलवाने. ऐसा करने में विफलता coculturing दौरान नमूने के प्रदूषण में हो सकता है.
- > 1 घंटे के लिए नसबंदी समाधान में डूबे सभी घटकों को छोड़ दें.
- गैस inlets के फ्लश करने के लिए एक और बाँझ 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर, ताजा बाँझ पानी के साथ सभी घटकों कुल्ला.
4. तैयारीबैक्टीरियल inoculum की
- सी. के आधे से एक थाली फसल रक्त अगर थाली से जेजुनी विकास preincubated brucella शोरबा का 1 मिलीलीटर में पिछले दिन के लिए तैयार. यह ~ 10 10 CFU / एमएल उपज चाहिए.
- बैक्टीरियल कॉलोनी गठन इकाइयों (CFUs) semiquantify के लिए 600 एनएम जीवाणु निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व को मापने.
- Preincubated brucella शोरबा के 4 मिलीलीटर में वांछित inoculum के स्तर को जीवाणु निलंबन समायोजित करें.
- तब inoculum में मौजूद बैक्टीरिया CFUs की संख्या यों को 48 घंटे के लिए चर माहौल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते तीन प्रतियों में रक्त अगर प्लेटों पर उपयुक्त dilutions के चढ़ाना द्वारा पीछा इस अंतिम जीवाणु निलंबन से एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना.
5. ग्राम रक्षा समिति की स्थापना
- बेंच पर एक ग्राम रक्षा समिति के फ्लैट के निचले आधे चैम्बर रखें. निचले आधे कक्ष पर एक O-अंगूठी फिट.
- टी से IECs ले जाने के एक फिल्टर को अलग करेंवह वाहक और बाँझ पीबीएस के 400 μl के साथ तीन बार धो लो. O-अंगूठी जगह में रहता है, यकीन है कि कम आधा कक्ष पर फिल्टर रखें.
- धीरे ऊपरी आधा चैम्बर जगह में कम है. दो आधे कक्षों इकट्ठा कर रहे हैं एक बार, रिंग clamps का उपयोग कर एक साथ दबाना. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ दो खुलने के साथ, बेंच शीर्ष पर क्षैतिज समिति रखें.
- शिखर आधा चेंबर में बैक्टीरियल inoculum के 4 मिलीलीटर जोड़ें.
- Basolateral आधा चेंबर में सेल संस्कृति के माध्यम से 4 मिलीलीटर जोड़ें.
- आधा कक्षों दोनों पर खुलने में अंत टुकड़े रखें.
6. चर वायुमंडल इनक्यूबेटर भीतर गैस कई गुना करने के लिए ग्राम रक्षा समिति संलग्न
- गैस कई गुना के करीब निकटता में चर माहौल इनक्यूबेटर में ग्राम रक्षा समिति रखें.
- गैस कई गुना से जुड़े गैस की आपूर्ति नियामक खोलें. ग्राम रक्षा समिति के basolateral आधा कक्ष पर गैस इनलेट में कई गुना से ट्यूब देते हैं. गा देते हैंएस आउटलेट पाइप basolateral आधा कक्ष पर अंत टुकड़ा में दुकानों में से एक को चर वातावरण इनक्यूबेटर के बाहर अग्रणी.
- Basolateral आधा कक्ष पर अंत टुकड़ा में अन्य दुकान बंद बंद करें. इस basolateral माध्यम के निष्कासन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, अतिरिक्त गैस के दबाव से बचने के लिए बहुत धीरे धीरे इसे खोलने के लिए, देखभाल गैस कई गुना पर गैस प्रवाह खोलें.
- उद्देश्य 1 बुलबुला हर 2-5 सेकंड के एक गैस प्रवाह है. समय समय पर प्रयोग के दौरान गैस प्रवाह पर जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें.
7. Coculture के बाद समिति disassembling
- उचित coculture अवधि के बाद, गैस कई गुना से जुड़े गैस की आपूर्ति नियामक बंद करें. कई गुना में ग्राम रक्षा समिति में गैस का प्रवाह बंद बंद करें. गैस इनलेट, गैस दुकान और ग्राम रक्षा समिति से डाट डिस्कनेक्ट.
- एक चर माहौल इनक्यूबेटर से ग्राम रक्षा समिति निकालें. Subsequen के लिए -80 शिखर और basolateral supernatants और दुकान डिग्री सेल्सियस निकालेंटी विश्लेषण.
- रिंग clamps निकालें और धीरे समिति अलग ले. आधा कक्ष और एक बाँझ 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति डिश के लिए स्थानांतरण से फिल्टर निकालें. बाँझ पीबीएस के 400 μl के साथ IECs तीन बार धोएं.
- बातचीत बैक्टीरिया की कुल संख्या की गणना के लिए, ट्राइटन X-100 IECs को 0.1% युक्त बाँझ पीबीएस के 400 μl (v / v) जोड़ने और आईईसी lyse लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. तो बैक्टीरियल CFUs बातचीत की संख्या यों को 48 घंटे के लिए चर माहौल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते तीन प्रतियों में रक्त अगर प्लेटों पर उपयुक्त dilutions के चढ़ाना द्वारा पीछा इस सेल lysate से एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना.
- हमलावर बैक्टीरिया की कुल संख्या की गणना के लिए, 5% सीओ 2 और 95% में 37 पर एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए IECs और सेते से 150 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin युक्त DMEM सेल संस्कृति माध्यम डिग्री सेल्सियस के 400 μl जोड़ने कोशिकी बैक्टीरिया को मारने के लिए हवा,तो ऊपर कदम 7.4 के रूप में पालन करें.
8. Coculture के बाद समिति सफाई
प्रयोगों के अगले दौर के लिए बाँझ पानी और दुकान के साथ ग्राम रक्षा समिति धो लें.
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Representative Results
Coculturing प्रयोगों एक सी. के साथ प्रदर्शन जेजुनी जंगली प्रकार के तनाव और शिखर डिब्बे में microaerobic शर्तों के साथ ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में IECs एक समय में एरोबिक संस्कृति की स्थिति की तुलना में एक बातचीत की संख्या में वृद्धि हुई है (लगभग 10 गुना) और intracellular (लगभग 100 गुना) बैक्टीरिया का प्रदर्शन किया पर निर्भर ढंग से 1. इस अवलोकन दो अलग सी. का उपयोग करने योग्य था जेजुनी जंगली प्रकार उपभेदों (11168H और 81-176) और दो अलग आईईसी लाइनों (Caco -2 और T84), ग्राम रक्षा समिति के मॉडल 1 की वैधता पर प्रकाश डाला.
यहाँ प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम सी. की संख्या के बीच एक तुलना कर रहे हैं जेजुनी शिखर कॉम में microaerobic शर्तों के साथ एक सीओ 2 इनक्यूबेटर (आंकड़े 2A और बी) में या ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में मानक सेल संस्कृति परख की स्थिति या तो नीचे 3, 6, या 24 coculture के घंटे के बाद के साथ बातचीत या Caco-2 कोशिकाओं पर हमलाविभाग (आंकड़े -2 सी और डी). दो अलग सी के लिए डेटा जेजुनी जंगली प्रकार उपभेदों (11168H और 81-176) प्रस्तुत कर रहे हैं. वैज्ञानिक साहित्य में अध्ययन के विशाल बहुमत में प्रयोग किया जाता मानक सेल संस्कृति शर्तों के तहत, <10 7 CFU की तुलना Caco-2 कोशिकाओं (2A चित्रा) के साथ बातचीत के दौरान मनाया गया ~ 10 8 CFU समिति में Caco-2 कोशिकाओं के साथ बातचीत मनाया 24 घंटे के बाद मॉडल (चित्रा -2). ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में coculture के बाद, ~ 10 7 इंट्रासेल्युलर CFU ही की तुलना में Caco-2 कोशिकाओं (चित्रा 2 डी), ~ के लिए मानक सेल संस्कृति शर्तों के तहत coculture बाद Caco-2 कोशिकाओं (चित्रा 2B) से अलग 10 5 इंट्रासेल्युलर CFU से अलग थे 24 घंटा.
सी. की संख्या के बीच एक सीधी तुलना जेजुनी microaerobic या एरोबिक या तो Condi के साथ ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में coculture बाद IECs के साथ बातचीत या हमलावरशिखर डिब्बे में माहौल पहले से 1 का प्रदर्शन किया गया है. सी. बातचीत में वृद्धि में ग्राम रक्षा समिति के मॉडल परिणामों का प्रयोग करें लगभग 10 गुना के जेजुनी और intracellular सी. में वृद्धि 24 घंटा coculture 1 के बाद लगभग 100 गुना की जेजुनी.
चित्रा 1. कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर (समिति) मॉडल. आंतों उपकला कोशिकाओं (IECs) के योजनाबद्ध पारगम्य 0.4 माइक्रोन फिल्टर का समर्थन करता है पर वृद्धि हुई है और इस प्रकार एक शिखर और एक basolateral डिब्बे बनाने, एक ग्राम रक्षा समिति में डाला जाता है. इन डिब्बों तो व्यक्तिगत रूप से सी के साथ IECs की coculturing अनुमति देने के लिए मध्यम और गैस रचना के संबंध में समायोजित किया जा सकता है IECs की basolateral सतह पर IECs और एरोबिक शर्तों के शिखर सतह पर microaerobic शर्तों के साथ जेजुनी.
चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम सी. की संख्या की तुलना coculture परख एक कंपनी में मानक सेल संस्कृति शर्तों या तो के तहत किया गया था जब (ए और सी) के साथ बातचीत या 3, 6 या 24 घंटे के बाद (बी और डी) Caco-2 कोशिकाओं पर हमला जेजुनी 11168H या 81-176 जंगली प्रकार उपभेदों 2 इनक्यूबेटर (ए और बी) या शिखर कम्पार्टमेंट (सी और डी) में microaerobic शर्तों के साथ ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में. सभी प्रयोगों प्रत्येक प्रयोग में नकल में प्रदर्शन में कम से कम तीन जैविक replicates का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
मेजबान कोशिकाओं के साथ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के संबंधों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति विधियों के उपयोग व्यापक रूप से कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं में कार्यरत एक तकनीक है. इस तरह के सेल संस्कृति assays के एरोबिक शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं लेकिन, जैसा कि इन विट्रो मॉडल में सही मेजबान रोगज़नक़ बातचीत जगह ले जिसमें vivo वातावरण में प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता. व्यापक रूप से इन विट्रो संक्रमण मॉडल में इस्तेमाल microaerophilic सी. के अध्ययन के लिए विशेष रूप से अनुपयुक्त हैं जेजुनी ऐच्छिक anaerobes हैं कि अन्य आंतों रोगजनकों की तुलना में. सी. द्वारा मानव IECs के आक्रमण के तंत्र के बारे में साहित्य में काफी भ्रम की स्थिति है जेजुनी 4,5. हम इन अध्ययनों में इस्तेमाल में इन विट्रो मॉडल सही vivo स्थिति में प्रतिबिंबित नहीं करते क्योंकि आक्रमण के तंत्र इतना बुरा समझा जाता है कारण है कि सुझाव. स्तर, मानक सेल संस्कृति assays का उपयोगसी. की IECs की जेजुनी आक्रमण हमेशा 9 बहुत कम है. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल के विकास के लिए इस मुद्दे के समाधान के लिए हमारी प्रतिक्रिया थी.
हम दो अलग आईईसी लाइनों एक 24 घंटे की अवधि 1 से अधिक किसी भी मनाया प्रतिकूल प्रभाव के बिना शिखर सतह पर microaerobic शर्तों के साथ ग्राम रक्षा समिति में बनाए रखा जा सकता है की स्थापना की है. बातचीत और intracellular सी. दोनों की संख्या का एक समय पर निर्भर वृद्धि जेजुनी 11168H जंगली प्रकार के तनाव बैक्टीरिया शिखर कम्पार्टमेंट 1 में microaerobic शर्तों के साथ ग्राम रक्षा समिति में Caco -2 IECs साथ coculturing के बाद मनाया गया. इन टिप्पणियों के आगे एक दूसरे आईईसी रेखा (T84) और साथ ही एक दूसरे सी. का उपयोग कर पुष्टि की गई जेजुनी जंगली प्रकार के तनाव (81-176), कोई कोशिका लाइन या बैक्टीरियल तनाव विशिष्ट प्रभाव 1 का संकेत है. बैक्टीरियल बातचीत और आक्रमण का ये स्तर बढ़ा IECs 1 से एक बढ़ा, ध्रुवीकृत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में हुई. Higआईएल -8 के अपने स्तर को बढ़ा बैक्टीरियल चुनौती एक बढ़ा मेजबान प्रतिक्रिया के अनुरूप है यह दर्शाता है कि microaerobic coculturing के बाद पता चला रहे थे. आईएल -8 के उच्च स्तर IECs द्वारा आईएल -8 स्राव basolateral आईईसी सतह से मुख्य रूप से होता है कि यह दर्शाता है, शिखर supernatants की तुलना basolateral supernatants में पाया गया. आईएल -8 आंतों लुमेन में सीमित इस्तेमाल के लिए किया जाएगा जो एक न्युट्रोफिल attractant, के रूप में है. इस डेटा में ग्राम रक्षा समिति के दो पूरक सेटअप भी एक polarized मेजबान प्रतिक्रिया के कुशल पहचान के लिए अनुमति देता है दर्शाता है.
ग्राम रक्षा समिति के मॉडल की तकनीकी / स्थापना के पक्ष के बारे में कई सुविधाओं से पूर्व किसी भी रोगजनक जीव का अध्ययन करने के मॉडल को लागू करने के लिए विचार किया जाना चाहिए. सबसे पहले, IECs विशेष 0.4 माइक्रोन फिल्टर पर एक अभेद्य monolayer के लिए फार्म का हो जाना चाहिए. यह प्रयोग किया जाता सेल लाइन के आधार पर 14-21 दिनों के बीच लेता है और काफी लंबा प्रयोगों शास्त्रीय cocultu की तुलना करता हैरिंग प्रयोगों सेल संस्कृति प्लेटों में प्रदर्शन किया और 1-7 दिनों के बीच के लिए हो IECs का उपयोग कर. दूसरी ओर, केवल विकास की इतनी लंबी अवधि के बाद IECs एक पूरी तरह से ध्रुवीकृत monolayer के लिए फार्म का प्रदर्शन किया गया है. इस तरह की ध्रुवीकृत monolayers के और अधिक बारीकी से कुछ अध्ययनों में इस्तेमाल किया है और इस तरह के रूप में ग्राम रक्षा समिति के मॉडल का एक अन्य लाभ प्रदान nonpolarized, nonconfluent आईईसी लाइनों की तुलना में मानव आंतों उपकला में vivo में स्थिति की नकल. दूसरे, विशेष 0.4 माइक्रोन फिल्टर एक मानक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट की तुलना में काफी अधिक महंगे हैं. ग्राम रक्षा समिति के मुख्य सीमा अपेक्षाकृत कम throughput है. इस समिति कक्षों की उपलब्धता और गैस कई गुना की आवश्यकता सेटअप करने के लिए मुख्य कारण है. समानांतर replicates का केवल अपेक्षाकृत कम संख्या शास्त्रीय सेल कल्चर विधि के विपरीत, एक समय में किया जा सकता है. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल इसलिए प्रतिकृति के एक उच्च संख्या की आवश्यकता होती है बड़े पैमाने पर प्रदर्शन प्रयोगों या प्रयोगों के लिए कम उपयुक्त हैtes है. विचार करने के लिए एक और पहलू ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में coculture assays के प्रदर्शन के गुरुत्वाकर्षण प्रभाव से अधिक समय बैक्टीरिया आईईसी monolayer के साथ बातचीत के लिए कम अवसर में जिसके परिणामस्वरूप शिखर डिब्बे के नीचे स्थित कुल करने के लिए शुरू कर देंगे कि इसका मतलब है कि है. हालांकि समिति मॉडल का उपयोग कर, हम 11168H rpoN उत्परिवर्ती nonaggregating एक nonmotile की बातचीत, नाटकीय रूप से 6 घंटे के बाद 1 11168H जंगली प्रकार के तनाव कुल मिलाकर, चलता - फिरता की तुलना में कम कर रहे हैं कि पता चला है. वर्तमान में हम और अधिक बारीकी से आंत लुमेन में peristalsis नकल होगा कि शिखर डिब्बे में कुछ मिश्रण की अनुमति होगी कि ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में संशोधन पर काम कर रहे हैं. इसलिए, ग्राम रक्षा समिति के मॉडल विशेष रूप से इस तरह के सी. के रूप में बैक्टीरिया के लिए, और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में नकल उतार के कारण शास्त्रीय, एरोबिक सेल संस्कृति तरीकों की तुलना में बेहतर है whilst एक कड़े वायुमंडलीय आवश्यकताओं है कि जेजुनी, ग्राम रक्षा समिति के मॉडल अभी भी उठाए जाने की जरूरत है कि कुछ सीमाएँ हैंप्रयोगों जब डिजाइनिंग खाते में.
हमारे आंकड़े बताते हैं, कोशिकाओं को होस्ट करने के लिए वृद्धि बैक्टीरियल आसंजन पता चला है जो मानव गैस्ट्रिक रोगज़नक़ हेलिकोबेक्टर, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक समान ग्राम रक्षा समिति के मॉडल के लिए रिपोर्ट के निष्कर्षों का समर्थन करता है बैक्टीरियल विषैलापन कारकों के संश्लेषण के साथ ही एक बढ़ा मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जब एच. वृद्धि हुई पाइलोरी एरोबिक शर्तों के 11 की तुलना में microaerobic तहत उपकला कोशिकाओं के साथ cocultured था. एच. दोनों के रूप में पाइलोरी और सी. जेजुनी विकास के लिए microaerobic स्थितियों की आवश्यकता है, microaerobic शर्तों मेजबान कोशिकाओं के साथ जीवों की बातचीत को बढ़ावा देने के लग रहा है कि unsurprising है. हालांकि, IECs साथ विकल्पी वातनिरपेक्षी enterohemorrhagic Escherichia कोलाई की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक समिति प्रणाली का उपयोग करते हुए एक और अध्ययन में ग्राम रक्षा समिति के शिखर कंपार्टमेंट 10 में अवायवीय / microaerobic coculture परिस्थितियों में बैक्टीरियल बातचीत के स्तर में वृद्धि का प्रदर्शन किया. टीउसकी अवायवीय / microaerobic परिस्थितियों में IECs साथ cocultured जब वायुमंडलीय ऑक्सीजन परिस्थितियों में proliferating में सक्षम हैं कि बैक्टीरिया का व्यवहार भी बदल रहा है. इस समिति मॉडल अधिक ईमानदारी से मानव आंतों लुमेन में vivo स्थिति में समान है कि परिस्थितियों में कई अलग रोगजनक बैक्टीरिया के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के विश्लेषण के लिए एक बेहतर और मूल्यवान मॉडल है कि पता चलता है.
मॉडल दृष्टिकोण से, ग्राम रक्षा समिति के मॉडल विट्रो सी. जेजुनी-आईईसी coculturing मॉडल में एरोबिक पर कुछ स्पष्ट लाभ के अधिकारी को साबित कर दिया है. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल में बनाया माहौल और अधिक बारीकी सी. के दौरान मानव आंत में पर्यावरण mimics जेजुनी संक्रमण, के साथ बातचीत और IECs हमलावर जीवाणुओं की संख्या में एक अत्यधिक महत्वपूर्ण वृद्धि करने के लिए अग्रणी. यह मौजूदा स्वरूप में ग्राम रक्षा समिति के मॉडल के साथ आंतों बैक्टीरिया की बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदर्श है आमाशय या आंतोंउपकला कोशिकाओं, लेकिन सिर्फ दो उदाहरण के रूप में, मल के नमूने से या मौखिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी नमूने लिए सख्त anaerobes के अध्ययन के लिए समिति मॉडल अनुकूल करने की क्षमता है. महत्वपूर्ण सिद्धांत हमेशा अधिक बारीकी से vivo स्थिति में है कि नकल की शर्तों के तहत इन coculture प्रयोगों प्रदर्शन करने के उद्देश्य के लिए होना चाहिए. ग्राम रक्षा समिति के मॉडल सी. के आगे के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा जेजुनी मेजबान रोगज़नक़ बातचीत और कई अलग अलग बैक्टीरिया के रोगजनक तंत्र के अध्ययन के लिए लागू किया जाना चाहिए.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
डोमिनिक मिल्स एक ब्लूम्सबरी कालेजों पीएचडी छात्रवृत्ति (2007-2010) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों ग्राम रक्षा समिति के मॉडल को विकसित करने में उनकी सहायता के लिए Ozan Gundogdu और अब्दी Elmi दोनों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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