Summary
We beschrijven een protocol voor de destabilisatie van de mediale meniscus (DMM) model in muizen, een effectief instrument voor artrose (OA) onderzoek. Bovendien hebben we tekort aan progranulincan overdrijven OA ontwikkeling en progressie door dit model aangetoond aangeeft dat progranulin speelt een beschermende rol in de pathogenese van OA.
Abstract
Destabilisatie van mediale meniscus (DMM) model is een belangrijk instrument voor het bestuderen van de pathofysiologische rol van talrijke artritis geassocieerde moleculen in de pathogenese van osteoartritis (OA) in vivo. De gedetailleerde name de gevisualiseerde protocol waarbij die complexe model in muizen, is niet beschikbaar. Hierin hebben we geprofiteerd van wildtype en progranuline (PGRN) - / - muizen als voorbeelden van een protocol voor het induceren van DMM-model bij muizen, en vergeleken het begin van OA na oprichting van deze chirurgisch geïnduceerde model introduceren. De bewerkingen uitgevoerd op muizen waren ofwel sham operatie, die net geopend gewrichtskapsel of DMM operatie, die de menisco-tibiale ligament snijden en veroorzaakte destabilisatie van mediale meniscus. Artrose ernst werd geëvalueerd met behulp van histologische assay (bijv. Safranine O kleuring), uitingen van OA-geassocieerde genen, afbraak van kraakbeen extracellulaire matrix moleculen, en osteofyt vormatie. DMM operatie met succes geïnduceerde OA initiatie en progressie in wildtype en PGRN-/ - muizen, en verlies van PGNR groeifactor geleid tot een ernstiger fenotype OA in dit chirurgisch geïnduceerde model.
Introduction
Osteoartritis (OA), ook wel bekend als degeneratieve artritis, treft 15% van de wereldbevolking en meer dan 46 miljoen mensen in de Verenigde Staten, en wordt gekenmerkt door synovitis, kraakbeen degeneratie, en osteofytvorming 1. Het kan een gevolg van een complexe interactie van genetische, metabolische, biochemische en biomechanische factoren. De onderliggende mechanismen van OA blijven aan de wetenschappelijke gemeenschap te ontwijken. Er zijn momenteel talrijke dierlijke modellen die de pathogenese van OA 2,3 kan nabootsen. Het is belangrijk om dierlijke modellen voor de muizen zowel vanwege de beschikbaarheid van verschillende genetisch gemodificeerde muizen en de kosteneffectiviteit van experimenteren. Onder de verschillende experimentele modellen OA, het chirurgisch geïnduceerde destabilisatie van mediale meniscus (DMM) model is een algemeen geaccepteerd model OA vanwege de goede reproduceerbaarheid en een relatief tragere progressie tijdens artrose ontwikkeling. Beide attributensleutel voor de evaluatie van OA progressie verschillende behandelingen of transgenen 3-8 is. Echter, de consistentie van chirurgische OA model beïnvloed door verschillende factoren tijdens de operatie en als gevolg, is de toepassing van chirurgische muismodel beperkt.
Progranuline (PGRN) is een multi-functionele groeifactor uitgedrukt in verschillende cellen. Het is bekend dat PGRN speelt een cruciale rol bij verschillende fysiologische en ziekteprocessen zoals wondgenezing 9, tumorigenese 10 en ontsteking 11-15. Studies ook aangetoond dat gebrek aan PGRN degeneratieve ziekten van het zenuwstelsel in zowel mensen en muizen 16-18 veroorzaken. Het is bekend dat PGRN is in humane gewrichtskraakbeen en het niveau significant verhoogd in kraakbeen van patiënten met artrose en reumatoïde artritis 19. Daarnaast PGRN speelt ook een cruciale rol in chondrocyten proliferatie 20, differentiatie en endochondrialeverbening van groeischijf tijdens de ontwikkeling 21,22. Onlangs hebben we gemeld dat PGRN antagoniseerde TNF-α door binding aan TNF receptoren en vertoonde een anti-inflammatoire functie inflammatoire artritis modellen 13,14,23,24. De rol van PGRN in OA, vooral in vivo blijft een raadsel zijn. Hierin presenteren we de procedure om een chirurgische DMM te induceren, en onderzoeken de rol van PGRN in OA ontwikkeling door het opzetten van DMM model in WT en PGRN-/ - muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle chirurgische procedures met betrekking tot de dieren moet worden goedgekeurd door de lokale instelling Animal Care en ethische commissie, met een poging gedaan om pijn en ongemak veroorzaakt door de operatie te minimaliseren.
1. Voorbereiding
- Selecteer 8-12 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen met een lichaamsgewicht van ongeveer 25 g voor chirurgie.
- Verdoven de dieren door intraperitoneale injectie van een cocktail die zowel xylazine (5 mg / kg) en ketamine (40 mg / kg).
- Scheer de knie met scheermessen, dan chirurgisch draperen het dier en steriliseer de chirurgische site met betadine en alcohol (3x) en dek de muis ogen met zalf.
2. Chirurgische Proces
- Maak een 1 cm longitudinale mediale para-patella insnijding aan kniegewricht bloot.
- Open het kniegewricht zachtjes door laterale dislocatie van de knieschijf en patella ligament.
- Snijd de knie gewrichtskapsel lengterichtingdoor de mediale para-patella incisie in stap 2.1.
- Ontleden kniegewricht capsule met een pincet.
- Pak het distale deel van de achterpoot met de linkerhand, en het uitvoeren van laterale dislocatie van de knieschijf en patella ligament met een pincet. Houd de achterpoot voorzichtig en zorg ervoor dat trauma in de poot te voorkomen. Hoe beter het gewrichtskapsel wordt ontleed, hoe minder kracht nodig om de dislocatie te maken.
- Druppel steriele zoutoplossing op het oppervlak van gewrichtskraakbeen tijdens bedrijf om uitdroging kraakbeenoppervlak voorkomen.
- Dwars door de mediale ligament meniscotibial die mediale meniscus verankert aan de tibia plateau. Niet verwondt het kraakbeen onder de mediale meniscus.
- Identificeer de mediale meniscus die zoekt tussen mediale condylus van het femur en de mediale plateau van het scheenbeen.
- Identificeer de meniscotibial ligament die laterale zijde van de mediale meniscus verbindt met intercondylaris eminentie van het scheenbeen.
- Houd de hind poot voorzichtig met de hand, en dwars door de mediale ligament meniscotibial zorgvuldig met behulp van een nr. 10 chirurgisch mes. Zorg ervoor dat niet te verwonden veroorzaken aan het kraakbeen en andere ligamenten articulaire. In veel gevallen, moet de bekleding vetkussentje wordt getrokken naar de kant, maar niet om het ligament identificeren worden verwijderd.
- Sluit de knie gewrichtskapsel met een 6-0 absorbeerbare hechtdraad.
- Sluit de huid met 6-0 zijden hechtdraad.
3. Post-operatieve Zorg
- Breng een druppel van 0,25% bupivacaïne in de chirurgische plaats van elke muis postoperatieve pijn te minimaliseren.
- Verlaat de geopereerde muizen vrij om water en voedsel te krijgen.
4. Histologische Scoren van Chirurgische DMM Model
- Offer de muizen op aangegeven tijdstippen na de operatie (bijvoorbeeld 4 weken, 8 weken en 12 weken. Hier resultaten van 8 weken als representatief toonden we).
- De gehele kniegewrichten zijn vast, ontkalkt, embedded door paraffine en vervolgens serieel coupes op 5 micrometer interval.
- Snijd de hele achterste ledematen met nr. 10 messen.
- Ontleden de huid en spieren van de achterpoten zorgvuldig, en zet de monsters met 4% PFA gedurende 3 dagen in RT.
- Verwijder de PFA, en reinig de monsters met water. Daarna ontkalken de monsters in EDTA bij 4 ° C gedurende 2 weken.
- Dehydrateer de monsters in een ethanol verloop. In detail, houden de monsters in 70% ethanol gedurende 1 uur, verander dan de ethanol en houden de monsters in een nieuwe reeks van 70% ethanol voor O / N. Daarna zet de monsters in 80% en 90% ethanol dus, en bewaar ze voor 1 uur, respectievelijk, gevolgd door 100% ethanol voor O / N.
- Verwijder de ethanol. Houd de monsters in oxylene gedurende 1 uur, en veranderen in een nieuwe reeks van oxylene. Herhaal deze stap 3x.
- De monsters te bedden in een paraffine mal met behulp van de Leica inbedding centrum. Daarna worden de monsters coupes 5 urn met een roterende microtoom (Leica RM2255, Duitsland) en daarna verzameld op glasplaatjes.
- Seriële sagittale secties worden gesneden voor elk monster verspreid over een gebied van het centrum van de laterale condylus naar het midden van de mediale condylus.
- Safranine O kleuring wordt uitgevoerd, gevolgd door scoring en statistische analyse door middel OARSI scoresysteem zoals eerder 25 beschreven.
- Eerste, deparaffinize de dia's in oxylene en hydrateren ze in een ethanol gradiënt naar gedestilleerd water. Daarna worden de objectglaasjes gekleurd met Weigert Iron hematoxyline oplossing, 0,05% Fast Green (FCF) oplossing, 1% azijnzuur en 0,1% safranine O oplossing. Monteer de dia's met behulp van harsachtige medium.
- De score van de Safranine O gekleurde coupes op basis van het verlies van proteoglycanen (rode kleur) in het kraakbeen en het percentage van de vernietiging in het kraakbeen structuur, doen statistische analyse voor de histologische score.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM model werd met succes bij muizen, en een tekort aan PGRN overdreven chirurgisch geïnduceerde OA ontwikkeling.
Sham en DMM activiteiten (figuur 1) werden uitgevoerd in WT en PGRN-/ - muizen. 8 weken na de operatie werden de muizen gedood en safranine O kleuring werd uitgevoerd op secties van kniegewrichten, gevolgd door statistische analyse van artritis score op basis van histologie. Zoals getoond in figuur 2A, was er geen duidelijke degeneratie van kraakbeen in beide genotypen in schijnoperatiegroep groepen op basis safranine O kleuring, die vergelijkbare uitgangssituatie (bovenste panelen) geïmpliceerd. 8 weken na operatie DMM (onderste panelen), was er verlies van proteoglycan en vernietiging van kraakbeen structuur in zowel WT en PGRN-/ - muizen (rode pijl). Zowel het verlies van proteoglycanen en afbraak van kraakbeen suggereren de succesvolle inductie van de OA fenotype. De staven van de kolommen Aanwijsed de variatie tussen intra groepsleden na DMM operatie. De bar is relatief kort en PGRN knockouts toonde een groter verlies van proteoglycan en het kraakbeen structuur zwaarder vernietigd in vergelijking met het wildtype ras. Bovendien, de statistische analyse voor kraakbeen score werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 25 en kraakbeen score was significant hoger in PGRN knockouts dan de WT-groep. Onze resultaten toonden dat een verlies van PGRN geleid ernstiger fenotype OA.
Figuur 1. Chirurgische ingreep voor DMM inductie. een. Een mediale para-patella incisie gemaakt in de huid van het kniegewricht. b. Blootstelling van kniegewricht spatie na laterale dislocatie van gewrichtskapsel. c. Inner structuur van het kniegewricht. Blauwe pijl geeft mediale meniscus. Gele pijl toont meniscotibial ligament. D. Mediale meniscus wordt gedestabiliseerd. Blauwe pijl geeft de mediale meniscus die wordt ontwricht uit oorspronkelijke site. Gele pijl toont resterende deel van meniscotibial ligament dat is ontleed. D. Het gewrichtskapsel is gesloten. F. De huid wordt gesloten. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Representatieve foto's van histologie en statistische analyse voor score van artrose A. Vertegenwoordiger histologische foto's van WT en PGRN-/ -. Muizen 8 weken na sham operatie of DMM, Getest door safranine O kleuring. Rode pijlen geven kraakbeenvernietiging. Verlies van rode kleur in het kraakbeen impliceert verlies van proteoglycanen. Schaal bar, 100 micrometer B. Statistische analyse voor score van artrose in beide PGRN-/ -.. En WT muizen Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is gemeld dat de stam van muizen is zeer belangrijk voor DMM model inductie, als verschillende stammen van muizen variërende ernst van OA na DMM met hoogste niveau in de 129/SvEv stam, gevolgd door C57Bl6, 129/SvInJ en FVB / n 26. Een groot deel van transgenen worden vastgesteld C57BL6 muizen, zoals PGRN-/ - muizen we in de onderhavige studie, die relatief gevoelig DMM zijn. Indien het transgen is gebaseerd op ongevoelige stam zoals FVB / N muizen, is het noodzakelijk deze muizen terugkruising met gevoelige stammen voor DMM inductie. Het geslacht van muizen gebruikt voor DMM inductie is ook erg belangrijk omdat studies al hebben aangetoond dat vrouwelijke muizen minder gevoelig zijn dan mannelijke muizen 27. Bovendien leeftijd muizen voor DMM bediening varieert van 8 weken tot 12 weken gebaseerd op literatuur 29 speelt ook een cruciale rol in de pathogenese van OA. Daarom moet muizen van dezelfde leeftijd zijn gebruikt om dit effect te elimineren. Postoperatieve pijnbestrijding nodig om de beweging van muizen verbeteren na de operatie. Zoals DMM model leidt tot OA door beweging veroorzaakte slijtage van kraakbeen, onvoldoende beweging ten gevolge van postoperatieve pijn kunnen inconsistentie OA ontwikkeling veroorzaken. Momenteel is er een verschil met betrekking tot de definitie van DMM over het al dan niet aan de mediale meniscus 4,28 verwijderen. In onze huidige studie hebben we alleen maar gedestabiliseerd mediale meniscus, maar niet verwijderen. Laesies in de DMM model waren vooral gelegen op het centrale dragende regio mediale tibia plateau, en de ernst van het letsel gestegen tijdens het tijdsverloop (ongepubliceerde gegevens), en de resultaten waren consistent met de eerdere verslagen 5. Bovendien is de OARSI score na DMM operatie was betrekkelijk consistent tussen de verschillende leden van dezelfde genetische groep.
PGRN speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van kraakbeen en artritis 14,21. Weeerder gemeld dat PGRN wisselwerkingen met metalloproteasen ADAMTS-7 en ADAMTS-12, en beschermt kraakbeenmatrix eiwit COMP tegen afbraak 19. Bovendien is voldoende aangetoond dat TNF-α speelt een cruciale rol in kraakbeenvernietiging 24. Recent vonden we dat PGRN antagoniseerde TNF-α en beschermd tegen kraakbeendestructie in inflammatoire artritis modellen 14. In deze studie hebben we geïnduceerd DMM model WT en PGRN-/ - muizen, en zoals verwacht, PGRN-/ - muizen vertoonden overdreven progressie van artrose na inductie van DMM, dat was gedefinieerd met meer ernstig verlies van proteoglycan in safranine O kleuring en significant hogere artritisscore gebaseerd op histologie (Figuur 2). Bovendien waren de uitingen van katabole markers drastisch verhoogd in PGRN-/ - groep (ongepubliceerde gegevens), wat suggereert versnelde progressie van artrose in een tekort van PGRN.
Tot slot, ons protocol voor de oprichting van DMM model successfully geïnduceerd OA fenotype in WT-en PGRN-/ - muizen en inductie was consistent en reproductieve. De succesvolle generatie van DMM model in C57/B6 muizen een nuttig hulpmiddel voor het evalueren van therapeutische middelen en OA-gerelateerde genen voor OA in de toekomst. In de huidige studie, het resultaat van DMM modeldocumenten een beschermende rol van PGRN in OA ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hierin verklaren dat we geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door NIH onderzoekssubsidies R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, en een Doelziekte Research Grant van Reumatologie Research Foundation (CJ Liu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
References
- Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
- Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
- Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
- Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
- Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
- Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
- He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
- Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
- Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
- Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
- Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
- Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
- Wu, H., Siegel, R. M.
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
- Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
- Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
- Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).
