Summary
Vi beskriver en protokoll for destabilisering av den mediale menisk (DMM) modell i mus, et effektivt verktøy for artrose (OA) forskning. I tillegg har vi vist at mangel på progranulincan drive OA utvikling og progresjon ved å bruke denne modellen, noe som indikerer at progranulin spille en beskyttende rolle i patogenesen av OA.
Abstract
Destabilisering av mediale menisk (DMM) modellen er et viktig verktøy for å studere patofysiologiske rollene til en rekke leddgikt assosiert molekyler i patogenesen av artrose (OA) in vivo. Imidlertid, den detaljerte, spesielt visualisert protokoll for å etablere denne kompliserte modell i mus, ikke er tilgjengelig. Heri vi tok fordel av villtype og progranulin (PGRN) - / - mus som eksempler for å innføre en protokoll for å indusere DMM modell i mus, og sammenlignet utbruddet av OA etter etablering av dette kirurgisk indusert modell. De operasjoner utført på mus var enten sham operasjon, som nettopp åpnet leddkapselen, eller DMM drift, som kutter menisco-tibial ligament og forårsaket destabilisering av mediale menisk. Artrose alvorlighetsgrad ble evaluert med histologisk analyse (f.eks safranin O flekker), uttrykk for OA-assosierte gener, nedbrytning av brusk ekstracellulære matrise molekyler, og osteophyte skjemaasjon. DMM operasjonen lykkes indusert OA initiering og progresjon i både villtype og PGRN-/ - mus, og tap av PGNR vekstfaktor ført til en mer alvorlig OA fenotype i dette kirurgisk indusert modell.
Introduction
Artrose (OA), også kjent som degenerative leddgikt, påvirker 15% av verdens befolkning, og over 46 millioner mennesker i USA, og er preget av synovitt, brusk degenerasjon, og osteophyte dannelse en. Den kan være et resultat av et komplekst samspill av genetiske, metabolske, biomekaniske og biokjemiske faktorer. De underliggende mekanismene for OA fortsette å unndra seg det vitenskapelige samfunnet. Det finnes i dag en rekke dyremodeller som kan etterligne patogenesen av OA 2,3. Det er viktig å etablere dyremodeller i mus både på grunn av tilgjengeligheten av forskjellige genetisk modifiserte mus og kostnadseffektiviteten av eksperimentering. Blant de ulike typer eksperimentelle OA modeller, er kirurgisk indusert destabilisering av mediale menisk (DMM) modellen et godt akseptert OA modellen på grunn av sin gode reproduserbarhet og en relativt tregere progresjon under OA utvikling. Begge disse attributtene harvært nøkkelen for evaluering av OA progresjon i ulike behandlinger eller transgener 3-8. Imidlertid er konsistensen av kirurgiske OA modell påvirkes av forskjellige faktorer, i løpet av operasjonen, og som et resultat av dette er anvendelse av kirurgiske musemodell begrenset.
Progranulin (PGRN) er en multi-funksjonell vekstfaktor uttrykt i ulike celler. Det er kjent at PGRN spiller en avgjørende rolle i ulike fysiologiske og sykdomsprosesser som sårtilheling 9, tumorigenesis 10, og betennelse 11-15. Studier har også vist at insuffisiens av PGRN kan forårsake degenerative sykdommer i nervesystemet hos både mennesker og mus 16-18. Det er kjent at PGRN uttrykkes i human leddbrusk, og dens nivå er signifikant forhøyet i brusk hos pasienter med OA og reumatoid artritt 19.. I tillegg spiller PGRN også en avgjørende rolle i chondrocyttransplantasjon spredning 20, differensiering og endochondralforbening av veksten plate under utvikling 21,22. Nylig rapporterte vi at PGRN antagonized TNF-α gjennom binding til TNF-reseptorer og utviste en anti-inflammatorisk funksjon inflammatorisk artritt modeller 13,14,23,24. Men rollen som PGRN i OA, spesielt in vivo, gjenstår å være en gåte. Heri presenterer vi prosedyren for å indusere en kirurgisk DMM modell, og undersøke hvilken rolle PGRN i OA utvikling gjennom etablering av DMM modell i WT og PGRN-/ - mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de kirurgiske prosedyrer knyttet til dyrene skal være godkjent av lokale Institution Animal Care and Ethics Committee, med en innsats for å redusere smerter og ubehag forårsaket av kirurgi.
En. Forberedelse
- Velg 8-12 uker gammel mannlig C57BL / 6 mus med en kroppsvekt på ca 25 g for kirurgi.
- Bedøve dyrene ved intraperitoneal injeksjon av en cocktail som inneholder både xylazin (5 mg / kg) og ketamin (40 mg / kg).
- Barbere kneet med barberhøvler, deretter kirurgisk drapere dyret og sterilisere operasjonsstedet med betadine og alkohol (3x) og dekke muse øynene med salve.
2. Kirurgisk Process
- Lag en 1 cm lengde medial para-patellar snitt for å utsette kneleddet.
- Åpne kneleddet forsiktig gjennom lateral forskyvning av patella og patellar ligament.
- Skjær kneleddet kapsel lengdegjennom den mediale para-patellar innsnitt i trinn 2.1.
- Dissekere kneleddet kapsel med tang.
- Grab den distale del av hind labben med venstre hånd, og utføre lateral forskyvning av patella og patellar ligament med tang. Hold bakpoten forsiktig og sørg for å unngå traumer i labben. Jo bedre den felles kapsel dissekeres, desto mindre kraft kreves for å lage den forvridning.
- Drypp sterilt saltvann på overflaten av leddbrusk under drift for å unngå uttørking av bruskoverflaten.
- Skjær gjennom den mediale meniscotibial leddbånd som forankrer mediale menisk til tibial platået. Unngå å skade brusken under mediale menisk.
- Identifiser den mediale menisk som lokaliserer mellom mediale condyle av femur og medial platå av tibia.
- Identifiser meniscotibial ligament som forbinder laterale siden av mediale menisk med intercondylar eminense av tibia.
- Hold hind labben forsiktig med hånden, og skjære gjennom den mediale meniscotibial ligament nøye ved hjelp av en nr. 10 kirurgisk blad. Sørg for ikke å forårsake skade på leddbrusk og andre leddbånd. I mange tilfeller trenger å dekke fettpute som skal trekkes til side, men ikke til å bli fjernet for å identifisere ligament.
- Lukk kneleddet kapsel med en 6-0 absorberbare sutur.
- Lukk huden med 6-0 silke sutur.
Tre. Postoperativ Care
- Påfør en dråpe av 0,25% bupivakain i det kirurgiske området for hver mus for å redusere postoperativ smerte.
- La de opererte musene gratis å få vann og mat.
4. Histologisk Scoring av Kirurgisk DMM Model
- Ofre musene på angitte tidspunkter (f.eks 4 uker, 8 uker og 12 uker. Her viste vi resultatene av åtte uker som representant) etter operasjonen.
- Hele kneledd er faste, decalcified, embedded av parafin og deretter delt serielt på 5 mikrometer intervall.
- Skjær hele baklemmene med nr 10 kniver.
- Dissekere huden og musklene av baklemmene nøye, og fikse prøvene med 4% PFA for tre dager i RT.
- Fjern PFA, og rengjør prøvene med vann. Etterpå avkalk prøvene i EDTA ved 4 ° C i 2 uker.
- Dehydrer prøvene i en etanol-gradient. I detalj, holde prøvene i 70% etanol i 1 time, deretter skifte til etanol og holde prøvene i et nytt sett av 70% etanol i O / N. Etterpå settes prøvene i 80% og 90% etanol følgelig og holde dem i 1 time, henholdsvis, fulgt av 100% etanol for O / N.
- Fjern etanolen. Hold prøvene i oxylene for en time, og endre til et nytt sett med oxylene. Gjenta dette trinnet 3x.
- Legge prøvene til en parafin mold bruker Leica embedding sentrum. Deretter blir prøvene delt på 5 um ved hjelp av en roterende mikrotom (Leica RM2255, Tyskland) og deretter samles på glassplater.
- Serielle sagittal seksjoner er skåret for hver prøve som strekker seg over et område fra sentrum av den laterale knokkelen til sentrum av den mediale knokkelen.
- Safranin O farging er utført, etterfulgt av scoring og statistisk analyse gjennom OARSI scoring system som beskrevet tidligere 25.
- Først deparaffinize lysbildene i oxylene, og hydrat dem i en etanol gradient til destillert vann. Deretter blir lysbilder farget gjennom Weigert Iron Hematoxylin Solution, 0,05% Fast Grønn (FCF) Solution, en% eddiksyreløsning, og 0,1% safranin O Solution. Monter lysbilder ved hjelp av harpiksholdig medium.
- Scorer safranin O farget lysbilder basert på tap av proteoglycan (rød farge) i brusk og prosentandel av ødeleggelser i brusk struktur, gjør statistisk analyse for den histologiske score.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM modellen ble opprettet i mus, og mangel på PGRN overdrevet kirurgisk indusert OA utvikling.
Sham og DMM operasjoner (figur 1) ble utført i WT og PGRN-/ - mus. 8 uker etter operasjonen, ble musene avlivet, og safranin O farging ble utført på de seksjoner fra kneledd, etterfulgt av statistisk analyse av artritt stillingen basert på histologi. Som vist i figur 2A, var det ingen innlysende degenerering av brusk i begge genotyper i sham operasjonsgrupper basert på safranin O farging, som antydet på liknende grunnlinjebetingelser (øvre panel). 8 uker etter DMM drift (lavere paneler), det var tap av proteoglycan og ødeleggelse av brusk struktur i både WT og PGRN-/ - mus (røde piler). Både tapet av proteoglykan og nedbrytning av brusk foreslå en vellykket induksjon av OA-fenotype. Barene på søylene anmerketed variasjonen mellom intra gruppemedlemmer etter DMM drift. Imidlertid er stolpen forholdsvis kort, og PGRN svekkinger vist en høyere tap av proteoglycan og brusk strukturen ble mer alvorlig ødelagt i forhold til villtype rase. Dessuten ble den statistiske analysen for brusk poengsum utført som beskrevet tidligere 25, og brusk poengsum var signifikant høyere i PGRN knockouts enn WT-gruppen. Våre resultater viser at et tap av PGRN resulterte i mer alvorlig OA fenotype.
Figur 1. Kirurgisk prosedyre for DMM induksjon. en. en medial para-patellar snitt i huden av kneleddet. b.. Eksponering av kneleddet plass etter lateral forskyvning av leddkapselen. c.. Inner structure av kneleddet. Blå pilen viser mediale menisk. Gul pil viser meniscotibial ligament. D.. Medial menisk er destabilisert. Blå pilen viser den mediale menisk som er forstuet fra opprinnelige området. Gul pil viser gjenværende del av meniscotibial leddbånd som har blitt dissekert. D.. Leddkapselen er stengt. F.. Huden er stengt. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Representative bilder av histologi og statistisk analyse for score av artrose A. Representative histologiske bilder av WT og PGRN-/ -. Mus åtte uker etter humbug drift eller DMM, Analysert av safranin O farging. Røde piler indikerer brusk ødeleggelse. Tap av rød farge i brusk innebærer tap av proteoglykan. Scale bar, 100 mikrometer B. Statistisk analyse for score av slitasjegikt i begge PGRN-/ -.. Og WT mus Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er rapportert at den stamme av mus er svært viktig for DMM modell induksjon, har så forskjellige stammer av mus varierende alvorlighetsgrad av OA etter DMM, med høyeste nivå i 129/SvEv belastning, etterfulgt av C57BL6, 129/SvInJ og deretter FVB / n 26. En stor del av transgener er etablert i C57BL6 mus, for eksempel PGRN-/ - mus vi brukt i denne studien, som er relativt utsatt for DMM. Imidlertid, hvis transgenet er basert på insensitive belastning som FVB / n-mus, er det nødvendig å backcross disse musene med følsomme stammer før DMM induksjon. Kjønnet på mus som brukes for DMM induksjon er også svært viktig som studier har allerede vist at hunnmus er mindre sensitiv enn hannmus 27. Videre, i en alder av mus for DMM drift varierer fra 8 uker gammel til 12 uker gamle basert på litteratur 29, som også spiller en avgjørende rolle i patogenesen av OA. Derfor bør mus av samme alder bli operert for å eliminere denne effekten. Post operative smertekontroll er nødvendig for å forbedre bevegelsen av mus etter kirurgi. Som DMM-modellen fører til OA gjennom bevegelse mediert slitasje i brusken, utilstrekkelig bevegelse som følge av postoperativ smerte kan føre til inkonsekvens av OA utvikling. Foreløpig er det en uoverensstemmelse angående definisjonen av DMM om hvorvidt eller ikke å fjerne den mediale menisk 4,28. I vår nåværende studien, vi bare destabilisert mediale menisk, men ikke fjerne den. Skader i DMM modellen var i hovedsak plassert på den sentrale vektbærende område av medial tibial platå, og alvorlighetsgraden av lesjoner økte i løpet av tidsforløpet (upubliserte data), og resultatene var i overensstemmelse med tidligere rapporter 5. Videre OARSI poengsum følgende DMM operasjonen var relativt konsistente mellom ulike medlemmer av samme genetiske gruppe.
PGRN spiller en viktig rolle i brusk utvikling og leddgikt 14,21. Vitidligere rapportert at PGRN samspill med metalloproteaser ADAMTS-7 og ADAMTS-12, og beskytter brusk matrise protein KOMP fra degradering 19. Dessuten er det godt etablert at TNF-α spiller en avgjørende rolle i brusk ødeleggelse 24. Nylig, har vi funnet at PGRN antagonized TNF-α og beskyttet mot brusk ødeleggelse i inflammatorisk artritt modeller 14. I denne studien, vi indusert DMM modell i WT og PGRN-/ - mus, og som forventet, PGRN-/ - mus utstilt overdrevet progresjon av OA etter induksjon av DMM, som ble indikert av mer alvorlig tap av proteoglycan i safranin O flekker og betydelig høyere artritt stillingen basert på histologi (figur 2). Dessuten ble de uttrykk for katabolske markører dramatisk forhøyet i PGRN-/ - gruppen (upubliserte data), noe som tyder på akselerert OA progresjon i mangel av PGRN.
I konklusjonen, vår protokoll for etablering av DMM modell successfully indusert OA fenotype i WT og PGRN-/ - mus, og induksjon var konsekvent og reproduktiv. Den vellykkede generasjonen av DMM modell i C57/B6 mus gir et nyttig verktøy for å vurdere terapeutiske agenter og OA relaterte gener for OA i fremtiden. I den aktuelle studien, dokumenterer resultatet av DMM-modellen en beskyttende rolle PGRN i OA utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi her erklærer at vi ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH forskningsmidler R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, og en sykdom målrettet forskningsstipend fra Rheumatology Research Foundation (til CJ Liu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
References
- Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
- Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
- Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
- Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
- Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
- Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
- He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
- Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
- Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
- Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
- Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
- Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
- Wu, H., Siegel, R. M.
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
- Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
- Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
- Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).
