Summary
우리는 생쥐의 내측 반월 상 연골 (DMM) 모델, 골관절염 (OA) 연구를위한 효과적인 도구의 불안정에 대한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 progranulin가 OA의 병인에 보호 역할을한다는 것을 나타내는,이 모델을 사용하여 progranulincan 과장 OA 개발 및 진행의 부족을 증명하고있다.
Abstract
내측 반월 상 연골의 불안정은 (DMM) 모델은 생체 내에서 골관절염 (OA)의 병인에 많은 관절염 관련 분자의 병태 생리 학적 역할을 연구하기위한 중요한 도구입니다. 그러나, 세부, 특히 쥐에이 복잡한 모델을 구축하기위한 시각화 한 프로토콜은 사용할 수 없습니다. 여기에서 우리는 야생형 및 progranulin (PGRN) 이용했다 - / - 예 생쥐의 DMM의 모델을 유도하기위한 프로토콜,이 수술 유도 모델의 설립 다음 OA의 비교 발병을 소개하는대로 마우스. 생쥐에서 수행 된 작업은 menisco 경골 인대를 잘라 내측 반월 상 연골의 불안정을 야기 관절낭, 또는 DMM 작업을 개설 가짜 운전, 하나 있었다. 관절염의 심각도는 조직 학적 분석 (예 : Safranin O 염색), OA 관련 유전자의 표현, 연골 세포 외 기질 분자의 분해 및 골극 양식을 사용하여 평가 하였다ATION. 마우스,이 수술 유발 모델에서 더 심한 OA 표현형을 주도 PGNR 성장 인자의 손실 - DMM 작업이 성공적으로 야생형 및 PGRN - / 모두 OA의 개시 및 진행을 유도.
Introduction
또한 퇴행성 관절염으로 알려진 골관절염 (OA)는, 세계 인구의 15 %에 영향을 미치는 미국 내에서 46 만 명 이상, 그리고 윤 활막염, 연골의 변성 및 골극 형성 한 것을 특징으로한다. 그것은 유전 대사, 생체 역학, 생화학 적 요인의 복잡한 상호 작용의 결과 일 수있다. OA의 기본 메커니즘은 사회 과학을 회피하는 것을 계속한다. OA 2,3의 병인을 모방 수있는 수많은 동물 모델은 현재이 있습니다. 그것 때문에 다양한 유전자 변형 마우스의 유용성과 실험의 비용 효율성 양쪽의 생쥐 동물 모델을 확립하는 것이 중요하다. 실험 OA 모델의 여러 종류의 사이에, 내측 반월 상 연골 (DMM) 모델의 수술 유도 불안정 때문에 그것의 좋은 재현성 및 OA를 개발하는 동안 상대적으로 느린 진행의 잘 받아 OA 모델입니다. 이러한 특성은 모두가다른 처리 또는 형질 전환 유전자 3-8 OA 진행의 평가를위한 핵심이었다. 그러나, 수술 OA 모델의 일관성은 수술하는 동안 그 결과 다양한 요인에 의해 영향을받는, 외과 마우스 모델의 적용은 제한된다.
Progranulin (PGRN)는 각종 세포에서 발현 다기능 성장 인자이다. 그것은 PGRN 같은 상처 치유 09 종양 10, 11-15 및 염증 등의 각종 생리적 질병 과정에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 연구는 또한 PGRN의 부족이 인간과 생쥐 16-18 모두 신경계의 퇴행성 질환을 일으킬 수있는 것으로 나타났습니다. 그것은 PGRN 인간 관절 연골에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 그 수준은 상당히 OA 및 류마티스 관절염 (19)을 가진 환자의 연골 조직에서 증가된다. 또, PGRN 또한 연골 세포 증식 20, 분화 및 연골 내에서 중요한 역할을 담당개발 (21, 22) 중 성장판의 골화. 최근에, 우리는 PGRN가 TNF 수용체에 결합을 통해 TNF-α를 반감과 염증성 관절염 모델 13,14,23,24의 항 염증 기능을 전시하고 있다고 보도했다. 그러나, OA에 PGRN의 역할은, 특히 생체 내에서, 수수께끼로 남아있다. 생쥐 - 여기서, 우리는 수술 DMM 모델을 유도하고, 및 WT-PGRN / DMM 소재 모델을 확립 통해 OA 개발 PGRN의 역할을 조사하는 과정을 제시한다.
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Protocol
동물에 관련된 수술의 모든 통증과 수술로 인한 불편을 최소화하기위한 노력으로 지역 기관의 동물 관리 및 윤리위원회의 승인을 받아야한다.
1. 준비하기
- 수술 약 25 g의 체중과 8-12주 세 남성 C57BL / 6 마우스를 선택합니다.
- 자일 라진 (5 ㎎ / kg)과 케타민 (40 ㎎ / kg)을 모두 함유하는 칵테일을 복강 내 주사를 통해 동물을 마취.
- 면도칼로 무릎을 면도 후 수술 동물을 드레이프와 베타 딘, 알코올 (3x)로 수술 부위를 소독하고 연고와 마우스의 눈을 포함한다.
2. 수술 과정
- 무릎 관절을 노출 1cm 길이 중간 파라 슬개골 절개를합니다.
- 슬개골 및 슬개 인대의 측면 전위를 부드럽게 무릎 관절을 엽니 다.
- 길이 방향으로 무릎 관절 캡슐을 잘라2.1 단계에서 중간 파라 슬개골 절개를 통해.
- 집게와 무릎 관절 캡슐을 해부하다.
- 왼손으로 뒷발의 말단 부분을 쥐고, 집게로 슬개골 및 슬개 인대의 측면 전위를 수행합니다. 부드럽게 뒷다리를 잡고 발에 외상을 방지해야합니다. 공동 캡슐 해부 더 나은, 더 적은 힘은 전위를 만들기 위해 필요합니다.
- 연골 표면의 건조를 방지하기 위해 작업 중 관절 연골의 표면에 멸균 식염수 드립.
- 경골 고원에 내측 반월 상 연골을 고정하는 중간 meniscotibial 인대를 잘라. 내측 반월 상 연골 아래에있는 연골을 손상하지 마십시오.
- 대퇴골 내측 관절 융기 및 경골의 내측 고원 사이에 위치한다 내측 반월 상 연골을 확인합니다.
- 경골 과간 융기와 내측 반월 상 연골의 측면을 연결하는 meniscotibial 인대를 확인합니다.
- 하이를 잡고ND 손으로 부드럽게 포, 및 제 10 외과 블레이드를 사용하여 조심스럽게 중간 meniscotibial 인대를 잘라. 연골 및 다른 인대 관절에 해치다가 발생하지 않도록하십시오. 많은 경우에, 커버 지방 패드쪽으로 당길 수 있지만 인대를 식별하기 위해 제거되어야 할 필요는 없다.
- 6-0 흡수성 봉합사와 무릎 관절 캡슐을 닫습니다.
- 6-0 실크 봉합사로 피부를 닫습니다.
3. 수술 후 관리
- 수술 후 통증을 최소화하기 위해 각 마우스의 수술 부위에 0.25 %의 부피 바카 인의 한 방울을 적용합니다.
- 물과 음식을 무료로 운영 쥐를 둡니다.
4. 외과 DMM 모델의 조직 학적 점수
- 지정된 시점에서 쥐를 희생 수술 후 (예를 들어, 사주, 8 주 및 12 주. 여기에 우리가 대표로 팔주의 결과를 보여 주었다).
- 전체 무릎 관절은, 탈회, embe에게 고정되어파라핀으로 dded 다음 5 μm의 간격으로 순차적으로 단면.
- 10 번 블레이드와 전체 뒷다리를 잘라.
- 조심스럽게 두 다리의 피부와 근육을 해부하고, RT에서 3 일 동안 4 % PFA에 샘플을 고정합니다.
- PFA를 제거하고 물 샘플을 청소합니다. 그 후 2 주 동안 4 ° C에서 EDTA의 샘플을 석회.
- 에탄올 그라데이션의 샘플을 탈수. 구체적으로, 다음 에탄올을 변경 및 O / N. 70 % 에탄올의 새로운 세트에서 샘플을 유지, 1 시간 동안 70 % 에탄올에서 샘플을 계속 그 후, 80 %의 샘플을 넣어 90 %의 에탄올 결과, 및 O / N. 100 % 에탄올 다음에, 각각 1 시간 동안 그들을 유지
- 에탄올을 제거하십시오. 1 시간 동안 oxylene에 샘플을 유지하고 oxylene의 새로운 세트로 변경합니다. 이 단계의 3 배를 반복합니다.
- 라이카 삽입 센터를 사용하여 파라핀 금형에 샘플을 포함합니다. 그 후, 샘플을 회전 마이크로톰 (Leica의 RM225을 사용하여 5 ㎛의 절편으로 아르5, 독일) 다음 유리 슬라이드에 수집.
- 직렬 시상 부분은 내측 관절 돌기의 중심으로 측면 외과의 중심에서 지역에 걸쳐있는 각각의 샘플에 대해 잘립니다.
- Safranin O 염색이 수행 이전 25 설명한대로 OARSI 채점 시스템을 통해 채점 및 통계 분석에 의해 이어진다.
- 첫째, oxylene에 슬라이드를 deparaffinize, 증류수에 에탄올 구배를 수화. 그 후, 슬라이드는 Weigert의 철은 Hematoxylin 솔루션, 0.05 % 빠른 그린 (FCF) 솔루션, 1 % 아세트산 용액, 0.1 % Safranin O 솔루션을 통해 염색된다. 수지 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다.
- 조직 학적 점수에 대한 통계 분석을 수행, 연골과 연골 구조의 파괴의 비율에 프로테오글리칸 (붉은 색)의 손실에 따라 Safranin O 스테인드 슬라이드를 점수.
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Representative Results
DMM의 모델은 성공적으로 생쥐에서 설립 PGRN의 결핍은 수술에 의한 OA 개발을 과장했다.
쥐 - 가짜와 DMM 작업 (그림 1) WT 및 PGRN - / 수행되었다. 8주 동작 후에, 마우스를 희생시키고, Safranin O 염색은 무릎 관절의 부분에서 수행 된, 조직학에 근거 관절염 점수의 통계적 분석 하였다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 유사한 초기 조건 (상부 패널) 내재 Safranin O 염색에 기초 모의 운전 그룹의 두 유전자형 연골 명백한 퇴행이 없었다. 마우스 (빨간색 화살표) - 팔주 DMM 작업 (아래 패널) 후, WT 및 PGRN - / 모두 테오와 연골 구조의 파괴의 손실이 있었다. 두 프로테오글리칸 및 연골의 저하의 손실은 OA 표현형의 성공적인 유도를 제안한다. indicat 열 바DMM 작업 다음 내 그룹 구성원 사이의 변화를 에드. 그러나, 바는 상대적으로 짧고, PGRN 녹아웃이 높은 프로테오글리칸의 손실과 연골 구조가 더 심각 야생형 품종에 비해 파괴 된 표시. 또한, 연골 점수에 대한 통계 분석은 기술 이전 (25)로 수행하고, 연골 점수는 WT 그룹보다 PGRN 녹아웃에서 유의하게 높았다. 우리의 결과는 PGRN의 손실이 더 심한 OA 표현형의 결과 것을 보여 주었다.
그림 1. DMM 유도를위한 수술. 무릎 관절 공간. 중간 파라 슬개골 절개 무릎 관절의 피부에서 이루어집니다. 나. 노출 관절낭의 외측 탈구 후. 다. 내부의무릎 관절의 tructure. 파란색 화살표는 내측 반월 상 연골을 나타냅니다. 노란색 화살표가 meniscotibial 인대. D를 보여줍니다. 내측 반월 상 연골이 불안정하게된다. 파란색 화살표는 원래 사이트에서 탈구 된 내측 반월 상 연골을 나타냅니다. 노란색 화살표. D 해부 한 meniscotibial 인대의 잔여 부분을 보여줍니다. 공동 캡슐. F 닫힙니다. 피부가 닫혀 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 관절염의 점수에 대한 조직 학적 및 통계 분석의 대표적인 사진 WT 및 PGRN - /의 A. 대표 조직 학적 사진 -. 마우스 팔주은 가짜 조작이나 DMM 다음, Safranin O 염색에 의해 정량. 빨간색 화살표는 연골 파괴를 나타냅니다. 연골에있는 붉은 색의 손실 프로테오글리칸의 손실을 의미한다. 스케일 바, 모두 PGRN - / 골관절염의 점수는 100 μm의 B. 통계 분석 -.. 및 WT 생쥐는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
그것은 마우스의 변형이 DMM 모델 유도를 들어, 마우스의 서로 다른 균주 / 다음 C57BL6, 129/SvInJ 및 FVB 다음, 129/SvEv 균주에서 가장 높은 수준으로, DMM 후 OA의 정도를 변화 한 매우 중요하다고보고 N 26. DMM에 상대적으로 민감하다 우리가 본 연구에 사용 된 마우스 - 형질 전환 유전자의 많은 부분은 이러한 PGRN - /로 C57BL6 마우스에 설정됩니다. 유전자가 같은 FVB / N 마우스로 구분 변형을 기반으로하는 경우 그러나, DMM 유도하기 전에 감염 균주이 마우스를 역 교배 할 필요가있다. 연구는 이미 암컷 생쥐 수컷 쥐 27보다 덜 민감한 것으로 나타났습니다으로 DMM 유도에 사용되는 생쥐의 성별도 매우 중요합니다. 또한, DMM 작업에 대한 마우스의 나이는 8 주 오래에서 골관절염의 병인에 중요한 역할을 문학 29 일을 기준으로 이전 12주 다릅니다. 따라서, 동일 연령의 마우스는 이러한 효과를 제거하기 위해 작동해야. 수술 후 통증 조절은 수술 후 생쥐의 이동을 향상시키기 위해 필요하다. DMM 모델은 수술 후 통증의 결과로 연골, 불충분 한 운동 운동 매개 마모를 통해 OA에 이르게으로 OA 개발의 불일치가 발생할 수 있습니다. 현재 내측 반월 상 연골 4,28를 제거 할 것인지 여부에 관한 DMM의 정의에 관한 불일치가있다. 현재 우리의 연구에서, 우리는 단지 내측 반월 상 연골을 불안정하지만, 그것을 제거하지 않았다. DMM 모델 병변은 주로 경골 고원 중앙 체중 부하 영역에 위치시키고, 병변의 심각도가 시간 경과 (미공개 데이터) 동안 증가하고, 그 결과는 이전의보고 (5)와 일치 하였다. 또한, DMM 작업 다음 OARSI 점수는 동일한 유전자 그룹의 다른 구성원 간의 상대적으로 일치했다.
PGRN 연골 발달과 관절염 14,21에서 중요한 역할을한다. 우리이전에보고 된 메탈로의 ADAMTS-7과 ADAMTS-12, 및 분해 19 연골 매트릭스 단백질 COMP 보호와 PGRN interplays. 또한, TNF-α는 연골 파괴 (24)에서 중요한 역할을한다는 노포이다. 최근에, 우리는 PGRN는 TNF-α를 반감과 염증성 관절염 모델 (14)에 연골 파괴에 대한 보호 것으로 나타났습니다. 이 연구에서, 우리는 WT 및 PGRN - /의 DMM의 모델을 유도 - 마우스, 예상대로, PGRN-/ - 마우스는 Safranin O 염색에 프로테오글리칸의 더 심각한 손실에 의해 지시 된 DMM, 유도 다음 OA 과장의 진행을 전시하고 조직학에 따라 상당히 높은 관절염 점수 (그림 2). PGRN의 결핍에 가속 OA의 진행을 제안, 그룹 (게시되지 않은 데이터) - 또한, 이화 마커의 발현이 크게 PGRN - /에 상승했다.
결론적으로, DMM 모델의 구축을위한 우리의 프로토콜uccessfully 유도 OA의 WT 및 PGRN - /의 표현형 - 마우스 및 유도는 일관되고 재생산했다. C57/B6 생쥐 DMM 모델의 성공적인 세대는 미래에 OA에 대한 치료제 및 OA 관련 유전자를 평가하기위한 유용한 도구를 제공합니다. 현재의 연구에서, DMM 모델의 결과는 OA 개발 PGRN의 보호 역할을 설명합니다.
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Disclosures
우리는 여기에 우리가 관심의 충돌이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 연구 보조금 R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210 및 (CJ 리우에) 류마티스 연구 재단 질환 표적 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
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