Summary
Nous décrivons un protocole pour la déstabilisation du ménisque médial (DMM) de modèle chez la souris, un outil efficace pour l'arthrose (OA) de recherche. De plus, nous avons démontré que la carence de progranulincan exaggerate développement de l'OA et de la progression à l'aide de ce modèle, ce qui indique que progranulin joue un rôle protecteur dans la pathogenèse de l'arthrose.
Abstract
Déstabilisation du ménisque interne (DMM) modèle est un outil important pour étudier les rôles physiopathologiques de nombreuses molécules associées à l'arthrite dans la pathogenèse de l'arthrose (OA) in vivo. Cependant, le détail, en particulier le protocole visualisée pour établir ce modèle compliqué chez la souris, ne sont pas disponibles. Ici, nous avons profité de type sauvage et progranuline (PGRN) - / - souris comme exemples d'introduire un protocole pour induire modèle DMM chez la souris, et contre l'apparition de l'arthrose suite à la création de ce modèle induit chirurgicalement. Les opérations effectuées sur des souris ont un fonctionnement en trompe-l'œil, qui vient d'ouvrir la capsule articulaire, ou opération de DMM, qui a coupé le ligament menisco-tibiale et provoqué la déstabilisation du ménisque interne. Arthrose gravité a été évaluée à l'aide dosage histologique (par exemple, la safranine O de coloration), des expressions de gènes OA-associés, la dégradation de cartilage molécules de la matrice extracellulaire, et ostéophytes formeation. DMM opération induite avec succès OA initiation et la progression à la fois de type sauvage et PGRN-/ - souris, et la perte de facteur de croissance PGNR conduit à un phénotype plus sévère OA dans ce modèle induit chirurgicalement.
Introduction
L'arthrose (OA), aussi connu comme l'arthrite dégénérative, affecte 15% de la population mondiale et plus de 46 millions de personnes aux États-Unis, et est caractérisée par une synovite, la dégénérescence du cartilage, et la formation d'ostéophytes 1. Il peut être le résultat d'une interaction complexe de facteurs génétiques, métaboliques, biomécaniques et biochimiques. Les mécanismes sous-jacents de l'arthrose continuent d'échapper à la communauté scientifique. Il existe actuellement de nombreux modèles animaux qui peuvent imiter la pathogenèse de l'arthrose 2,3. Il est important d'établir des modèles animaux chez la souris à la fois en raison de la disponibilité des différentes souris génétiquement modifiées et la rentabilité de l'expérimentation. Parmi les différents types de modèles d'arthrose expérimentale, la déstabilisation induite chirurgicalement du ménisque interne (DMM) de modèle est un modèle OA bien acceptée en raison de sa bonne reproductibilité et une progression relativement lente au cours du développement de l'arthrose. Ces deux attributs ontjoué un rôle clé pour l'évaluation de la progression de l'arthrose dans les différents traitements ou des transgènes 8.3. Toutefois, la cohérence du modèle d'OA chirurgical est affecté par plusieurs facteurs au cours de l'intervention chirurgicale et, par conséquent, l'application du modèle de souris chirurgical est limité.
Progranuline (PGRN) est un facteur de croissance multi-fonctionnel exprimé dans diverses cellules. Il est connu que PGRN joue un rôle essentiel dans différents processus physiologiques et pathologiques, tels que la cicatrisation des plaies 9, 10 tumorigenèse, et l'inflammation de 11 à 15. Des études ont également montré que l'insuffisance de PGRN peut provoquer des maladies dégénératives du système nerveux chez les humains et les souris 16-18. Il est connu que PGRN est exprimé dans le cartilage articulaire humain, et son niveau est significativement élevée dans le cartilage de patients atteints d'arthrose et de la polyarthrite rhumatoïde 19. En outre, PGRN joue également un rôle crucial dans la prolifération des chondrocytes 20, la différenciation et endochondraleossification du cartilage de croissance au cours du développement 21,22. Récemment, nous avons signalé que PGRN contrarié TNF-α en se liant à des récepteurs TNF et présentait une fonction anti-inflammatoire dans des modèles inflammatoires d'arthrite 13,14,23,24. Cependant, le rôle de PGRN dans l'arthrose, en particulier in vivo, reste à être une énigme. Ici, nous présentons la procédure pour induire un modèle DMM chirurgicale, et d'enquêter sur le rôle de PGRN en développement de l'OA en établissant modèle de DMM en WT et PGRN-/ - souris.
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Protocol
Toutes les interventions chirurgicales concernant les animaux devraient être approuvés par le soin des animaux et du Comité d'éthique de l'institution locale, avec un effort pour minimiser la douleur et l'inconfort causé par la chirurgie.
Une. Préparation
- Sélectionner 8-12 semaines mâle souris C57BL / 6 avec un poids corporel d'environ 25 g pour une intervention chirurgicale.
- Anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale d'un cocktail contenant à la fois de la xylazine (5 mg / kg) et de la kétamine (40 mg / kg).
- Raser le genou avec des rasoirs, puis draper chirurgicalement l'animal et stériliser le site chirurgical avec de la bétadine et alcool (3x) et couvrir les yeux de souris avec une pommade.
2. Procédures chirurgicales
- Faire une médiane longitudinale para-patellaire incision de 1 cm pour exposer l'articulation du genou.
- Ouvrez l'articulation du genou doucement à travers la dislocation latérale de la rotule et ligament rotulien.
- Couper la capsule articulaire du genou longitudinalementà travers la médiane incision para-patellaire à l'étape 2.1.
- Disséquer la capsule articulaire du genou avec une pince.
- Prenez la partie distale de la patte arrière avec la main gauche, et effectuer dislocation latérale de la rotule et ligament rotulien avec une pince. Maintenez la patte arrière doucement et assurez-vous d'éviter les traumatismes dans la patte. Le meilleur de la capsule articulaire est disséqué, moins la force sera nécessaire pour faire la dislocation.
- Goutte à goutte une solution saline stérile à la surface du cartilage articulaire lors du fonctionnement afin d'éviter le dessèchement de la surface du cartilage.
- Couper à travers le ligament médial meniscotibial qui ancre ménisque interne au plateau tibial. Éviter de blesser le cartilage sous le ménisque médial.
- Identifier le ménisque médial qui localise entre condyle médial du fémur et du tibia plateau intermédiaire.
- Identifier le ligament qui relie meniscotibial côté latéral du ménisque médial avec éminence intercondylienne du tibia.
- Tenez le salute patte doucement avec la main, et couper à travers le ligament médial meniscotibial soigneusement à l'aide d'une lame chirurgicale n ° 10. Assurez-vous de ne pas causer de blesser cartilage articulaire et d'autres ligaments. Dans de nombreux cas, le tampon recouvrant la graisse doit être tiré vers le côté mais non d'être retiré dans le but d'identifier le ligament.
- Fermez la capsule articulaire du genou avec un fil résorbable 6-0.
- Fermer la peau avec 6-0 suture de soie.
3. Soins post-opératoires
- Appliquer une goutte de 0,25% de bupivacaïne dans le site chirurgical de chaque souris afin de minimiser la douleur post-opératoire.
- Laissez les souris exploités sans chercher de l'eau et de la nourriture.
4. Marquer histologique de DMM chirurgical Modèle
- Sacrifier la souris aux points indiqués de temps (par exemple 4 semaines, 8 semaines, et 12 semaines. Ici, nous avons montré les résultats de huit semaines en tant que représentant) après la chirurgie.
- Les articulations des genoux entières sont fixés, décalcifiés, embedded par la paraffine, puis coupe en série à intervalle de 5 um.
- Couper l'ensemble des membres postérieurs avec n ° 10 lames.
- Disséquer la peau et les muscles des membres postérieurs avec soin, et fixer les échantillons à 4% PFA pendant 3 jours à température ambiante.
- Retirez la PFA, et nettoyer les échantillons avec de l'eau. Ensuite, détartrer les échantillons dans de l'EDTA à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Déshydrater les échantillons dans un gradient d'éthanol. Dans le détail, conserver les échantillons dans de l'éthanol à 70% pendant 1 heure, puis changer de l'éthanol et de conserver les échantillons dans un nouvel ensemble de 70% d'éthanol pour O / N. Ensuite, mettre les échantillons dans 80% et 90% d'éthanol, par conséquent, et de les conserver pendant 1 heure, respectivement, suivie par de l'éthanol à 100% pour O / N.
- Éliminer l'éthanol. Conserver les échantillons en o-xylène pendant 1 heure, et passer à une nouvelle série de o-xylène. Répétez cette étape 3x.
- Incorporer les échantillons dans un moule de la paraffine en utilisant le centre enrobage Leica. Par la suite, les échantillons sont coupés à 5 um en utilisant un microtome rotatif (Leica RM2255, Allemagne) et ensuite recueillies sur des lames de verre.
- Des sections sagittales en série sont coupées pour chaque échantillon couvrant une région du centre du condyle latéral vers le centre du condyle interne.
- Safranin O coloration est réalisée, suivie par la notation et l'analyse statistique par OARSI système de notation comme décrit précédemment 25.
- Tout d'abord, Déparaffiner les lames dans o-xylène, et hydrater les dans un gradient d'éthanol à de l'eau distillée. Par la suite, les lames sont colorées par hématoxyline de fer Solution de Weigert, 0,05% vert rapide (FCF) Solution, solution à 1% d'acide acétique et 0,1% safranine O Solution. Monter les lames en utilisant un milieu résineux.
- Note les lames colorées à la safranine O sur la base de la perte de protéoglycanes (de couleur rouge) dans le cartilage et le pourcentage de destruction de la structure du cartilage, faire l'analyse statistique pour le score histologique.
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Representative Results
Modèle DMM a été créé avec succès chez la souris, et la carence de PGRN exagéré développement de l'OA chirurgicalement induite.
Opérations fictives et DMM (figure 1) ont été effectuées dans le document WT et PGRN-/ - souris. 8 semaines après l'opération, les souris ont été sacrifiées, et la safranine O coloration a été réalisée sur des sections de l'articulation du genou, suivies d'une analyse statistique de score sur la base de l'arthrite histologie. Comme le montre la Figure 2A, il n'y avait aucune évidence de dégénérescence du cartilage dans les deux génotypes dans des groupes d'opérations fictives sur la base de la safranine O coloration, ce qui implique des conditions de base similaires (panneaux supérieurs). 8 semaines après l'opération DMM (panneaux inférieurs), il y avait perte de protéoglycanes et de la destruction de la structure du cartilage dans les deux WT et PGRN-/ - souris (flèches rouges). Tant la perte de protéoglycane du cartilage et la dégradation de la suggestion d'induction réussie du phénotype OA. Les barres des colonnes INDICATed la variation entre les membres du groupe suivant intra opération de DMM. Toutefois, la barre est relativement courte, et KO PGRN affiché une perte plus importante de protéoglycanes et la structure du cartilage a été plus sévèrement détruite par rapport à la race de type sauvage. En outre, l'analyse statistique de score de cartilage a été réalisée comme décrit précédemment 25, et des notes de cartilage était significativement plus élevée dans KO PGRN que le groupe WT. Nos résultats ont montré que la perte de PGRN a donné lieu à plus sévère phénotype de l'arthrose.
Figure 1. Intervention chirurgicale pour DMM induction. a. Un médial para-patellaire incision est faite dans la peau de l'articulation du genou. b. exposition de l'espace articulaire du genou après dislocation latérale de la capsule articulaire. c. Inner structure de l'articulation du genou. Flèche bleue indique ménisque médial. Flèche jaune indique ligament meniscotibial. D. Ménisque médial est déstabilisé. Flèche bleue indique le ménisque médial qui est disloqué à partir du site d'origine. Flèche jaune montre une partie résiduelle du ligament meniscotibial qui a été disséqué. D. La capsule articulaire est fermé. F. La peau est fermé. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Images représentatives de l'histologie et de l'analyse statistique pour le score de l'arthrose A. représentatifs images histologiques de WT et PGRN-/ -. Souris 8 semaines suivant l'opération fictive ou DMM, Dosée par la safranine O coloration. Les flèches rouges indiquent la destruction du cartilage. Perte de la couleur rouge dans le cartilage implique une perte de protéoglycanes. La barre d'échelle, 100 um B. L'analyse statistique pour le score de l'arthrose dans les deux PGRN-/ -.. souris et WT Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Il est rapporté que la souche de souris est très important pour le modèle de DMM induction, en tant que différentes souches de souris ont différentes gravité de l'arthrose après DMM, avec le plus haut niveau dans la souche 129/SvEv, suivie par C57BL6, 129/SvInJ puis FVB / n 26. Une grande partie des transgènes sont établis dans des souris C57BL6, comme PGRN-/ - souris, nous avons utilisé dans la présente étude, qui sont relativement sensibles à la DMM. Cependant, si le transgène est basé sur la souche sensible tels que des souris FVB / N, il est nécessaire de backcross ces souris avec des souches sensibles avant DMM induction. Le genre de souris utilisées pour DMM induction est également très important que des études ont déjà montré que les souris femelles sont moins sensibles que les souris mâles 27. En outre, l'âge de la souris pour l'opération de DMM varie d'un âge de 8 semaines à 12 semaines d'âge sur la base de la littérature 29, qui joue également un rôle critique dans la pathogenèse de l'arthrose. Par conséquent, les souris du même âge doivent être actionnés pour éliminer cet effet. Contrôle de la douleur post-opératoire est nécessaire pour renforcer le mouvement de la souris après la chirurgie. Comme modèle DMM conduit à OA par le mouvement médiation usure du cartilage, mouvement inadéquate en raison de la douleur post-opératoire peut entraîner des incohérences de développement de l'OA. Actuellement, il existe un écart relatif à la définition de DMM quant à savoir si ou de ne pas enlever le ménisque médial 4,28. Dans notre étude, nous avons simplement déstabilisé ménisque interne, mais nous n'avons pas le supprimer. Des lésions dans le modèle DMM sont principalement situés sur la zone centrale de port de poids du plateau tibial médial, et la gravité des lésions a augmenté au cours du temps (données non publiées), et les résultats étaient en accord avec les rapports précédents 5. En outre, le score OARSI opération suivante DMM était relativement constant entre les différents membres d'un même groupe génétique.
PGRN joue un rôle important dans le développement du cartilage et de l'arthrite 14,21. Nousprécédemment rapporté que PGRN s'enchaînant avec métalloprotéases ADAMTS-7 et ADAMTS-12, et protège la protéine de matrice du cartilage à partir de la dégradation de 19 COMP. Par ailleurs, il est bien établi que le TNF-α jouent un rôle essentiel dans la destruction du cartilage 24. Récemment, nous avons constaté que PGRN contrarié TNF-α et protégé contre la destruction du cartilage dans les modèles d'arthrite inflammatoire 14. Dans cette étude, nous avons provoqué modèle DMM en WT et PGRN-/ - souris, et comme prévu, PGRN-/ - souris ont montré une progression exagérée de l'arthrose après l'induction de DMM, qui a été indiqué par la perte plus grave de protéoglycanes dans la safranine O coloration et significativement plus élevée pointage de l'arthrite sur la base de l'histologie (figure 2). En outre, les expressions de marqueurs cataboliques ont été considérablement élevés dans PGRN-/ - groupe (données non publiées), ce qui suggère la progression de l'arthrose accélérée en cas de carence de PGRN.
En conclusion, notre protocole pour l'établissement de DMM modèle deuccessfully induit un phénotype de OA dans WT et PGRN-/ - souris, et l'induction était conforme et reproductive. La génération réussie de modèle DMM chez la souris C57/B6 fournit un outil utile pour évaluer les agents thérapeutiques et des gènes liés OA OA pour l'avenir. Dans l'étude actuelle, le résultat de modèle DMM documente un rôle protecteur de PGRN dans le développement de l'arthrose.
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Disclosures
Nous ici déclarer que nous n'avons pas de conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par les NIH subventions de recherche R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, et une maladie ciblée de subventions de recherche de la Fondation de recherche en rhumatologie (le juge en chef Liu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
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