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Methodenartikel

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

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DOI:

10.3791/51075

⸱

13. Januar 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Zusammenfassung

Eine große Herausforderung in der Neurobiologie besteht darin, die molekularen Grundlagen neuronaler Schaltkreise zu verstehen, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Sobald die spezifischen molekularen Mechanismen identifiziert sind, können neue therapeutische Strategien entwickelt werden, um Anomalien in bestimmten Verhaltensweisen zu behandeln, die durch degenerative Erkrankungen oder Alterung des Nervensystems verursacht werden. Die Meeresschnecke Aplysia californica eignet sich gut für die Untersuchungen der zellulären und molekularen Verhaltensgrundlagen, da neuronale Schaltkreise, die einem bestimmten Verhalten zugrunde liegen, leicht bestimmt und die einzelnen Komponenten der Schaltung leicht manipuliert werden könnten. Diese Vorteile der Aplysie haben zu mehreren grundlegenden Entdeckungen der Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses geführt. Hier beschreiben wir eine Vorbereitung des Aplysia-Nervensystems für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen. Kurz gesagt, Ganglien aus dem Nervensystem seziert wird Protease ausgesetzt, um die Ganglienscheide so zu entfernen, dass Neuronen exponiert sind, aber neuronale Aktivität wie bei dem intakten Tier behalten. Dieses Präparat wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen von einzelnen oder mehreren Neuronen durchzuführen. Wichtig ist, dass die Neuronen nach der Aufzeichnung mit einer einfachen Methodik direkt aus den Ganglien für die Genexpressionsanalyse isoliert werden könnten. Diese Protokolle wurden verwendet, um gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von L7- und R15-Neuronen durchzuführen, ihre Reaktion auf Acetylcholin zu untersuchen und die Expression des CREB1-Gens in isolierten Einzel-L7-, L11-, R15- und R2-Neuronen von Aplysienzu quantisieren.

Einleitung

Das menschliche Gehirn ist außerordentlich komplex mit fast 100 Milliarden Neuronen und Billionen synaptischer Verbindungen. Es gibt fast eine gleiche Anzahl von nicht-neuronalen Zellen, die mit Neuronen interagieren und ihre Funktion im Gehirn regulieren. Neuronen sind in Schaltkreise organisiert, die bestimmte Verhaltensweisen regulieren. Trotz der Fortschritte in unserem Verständnis von Gehirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen ist wenig über die Identität von Schaltkreiskomponenten bekannt, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Das Wissen um die Identitäten verschiedener Komponenten einer Schaltanlage wird unser Verständnis sowohl der zellulären als auch der molekularen Verhaltensgrundlagen und der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für neuropsychiatrische Störungen erheblich erleichtern.

Die Meeresschnecke Aplysia californica war ein Arbeitspferd zur Bestimmung neuronaler Schaltkreise, die spezifischen Verhaltensweisen zugrunde liegen1-14. Das Aplysia Nervensystem enthält etwa 20.000 Neuronen, die in 9 verschiedene Ganglien organisiert sind. Die Neuronen von Aplysia sind groß und können leicht anhand ihrer Größe, elektrischen Eigenschaften und Position in den Ganglien identifiziert werden. Aplysia hat ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen, die studiert werden können. Eines der gut untersuchten Verhaltensweisen ist der Kiemen-Entzugsreflex (GWR). Die zentralen Bestandteile dieses Reflexes befinden sich in Bauchganglien. Komponenten der GWR-Schaltung wurden kartiert und Beiträge verschiedener Komponenten ermittelt. Wichtig ist, dass GWR-Schaltungen assoziatives und nichtassoziatives Lernen durchlaufen5,6,15-19. Jahrzehntelange Studie über diesen Reflex haben auch mehrere Signalwege identifiziert, die eine Schlüsselrolle beim Lernen und Gedächtnis20-24haben.

Mehrere verschiedene Präparate von Aplysia wurden verwendet, um zelluläre und molekulare Grundlagen der Speicherspeicherung zu studieren. Dazu gehören das intakte Tier2,3, halbintakte Zubereitung1,7,13,14,16 und Rekonstitution von Hauptkomponenten der neuronalen Schaltung25-29. Hier wird eine reduzierte Vorbereitung auf die Erforschung von Aplysia-Ganglien für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen identifizierter neuronaler Schaltkreise beschrieben. Die folgenden vier identifizierten Neuronen wurden untersucht. R15, ein platzendes Neuron, L7 und L11, zwei verschiedene motorische Neuronen und R2, ein cholinerge Neuron wurden untersucht. R2 ist das größte Neuron, das im wirbellosen Nervensystem beschrieben wird. Kurz gesagt, beinhaltet diese Methode protease Behandlung von Ganglien, elektrophysiologische Messungen vor und nach pharmakologischen Behandlungen, und Isolierung von einzelnen Neuronen für die quantitative Analyse der Genexpression. Diese Methode ermöglicht es uns, molekulare Analysen mit gleichzeitiger Aufzeichnung von mehreren Neuronen zu kombinieren. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um Reaktionen von R15 und L7 Neuronen auf Acetylcholin (Ach) durch gepaarte intrazelluläre Aufnahmen zu studieren. Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15 und L7 und andere identifizierte Neuronen wie L11 und R2 für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Expression von CREB1 isoliert, einem Transkriptionsfaktor, der für die Speicherspeicherung wichtig ist.

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Protokoll

1. Vorbereitung von Abdominal Ganglia, elektrophysiologische Messungen und Isolierung von Single Identified Neurons from Abdominal Ganglion of Aplysia californica

  1. Aplysie im Laboraquarium mit zirkulierendem künstlichem Meerwasser (ASW) bei 16 °C unter 12:12 Licht:dunkel halten.
  2. Isolierung von Bauchganglien.
    1. Anästhesisieren Sie Tiere durch Injektion von 380 mM MgCl2 Lösung für 5-10 min (entspricht 30-35% des Körpergewichts des Tieres).
    2. Identifizieren Sie das Bauchganglien basierend auf seiner Position im zentralen Nervensystem24,28.
    3. Entfernen Sie die Ganglien durch chirurgische Operation und lagern Sie sofort in künstlichem Meerwasser bestehend aus 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3und 10 mM HEPES (pH 7.4).
  3. Protease-Behandlung.
    1. Inkubieren Bauchganglien für 30 min bei 34 °C±0,5 in einer Petrischale mit 0,1% Protease (Dispase) in ASW beschrieben oben beschrieben.
      HINWEIS: Die Menge der verwendeten Protease muss mit dem Alter und Gewicht der Tiere standardisiert werden. Im Allgemeinen würden ältere und größere Tiere mehr Protease benötigen.
  4. Entfernung von Ganglienscheide.
    1. Nach der Enzymbehandlung die Ganglien auf die Sylgard-Silikonbasis einer Zellkammer (= 1 cm; Vol. = 0,3 ml) festsetzen und mit ASW (Durchflussrate: 150 l/min) bei Raumtemperatur (18 °C±2 ) durchdringen.
      HINWEIS: Um die Sichtbarkeit der identifizierten Neuronen zu erhöhen, legen Sie das Ganglien auf die Oberseite eines Polycarbonat-Glaszylinders (Abbildung 1) (Durchmesser = 2 mm modifizierte Zellkammer), die mit einem binokularen Stereomikroskop mit 20-facher und 40-facher Vergrößerung leicht von unten beleuchtet werden kann.
    2. Entfernen Sie vorsichtig den Mantel aus dem Ganglion mit Zangen und Mikroschere.
  5. Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung von zwei Neuronen.
    1. Identifizieren Sie Neuron von Interesse.
    2. Impale das Neuron mit einer einzigen intrazellulären scharfen Mikroelektrode mit Widerstand 10-15 M, gefüllt mit 3 M KCl-Lösung.
    3. Aufzeichnen der neuronalen Aktivität (10 kHz Bandpass) mit einem intrazellulären Aufzeichnungssystem.
    4. Verarbeiten Sie die Aufzeichnungsdaten mit einer elektrophysiologischen Software wie Axograph.
      HINWEIS: Man kann leicht Aufnahmen von mehreren Neuronen durchführen. Die Neuronen L7, L11 oder R15 und R2 lassen sich anhand ihrer Position leicht identifizieren. Für die gleichzeitige Aufnahme von zwei L7- und R15-Neuronen werden zwei Verstärker und zwei Mikromanipulatoren benötigt (Abbildung 2).
  6. Drogenanwendung.
    1. Tragen Sie ein Medikament der Wahl durch sanftePipettierung oder direkte Injektion in Neuronen in die Zellkammer auf.
    2. Führen Sie elektrophysiologische Messungen durch.
      HINWEIS: Je nach versuchsweisem Ziel könnte man verschiedene elektrophysiologische Parameter von Neuronen messen, wie z. B. die Veränderungen des Membranpotenzials (MP) oder des Aktionspotentials (AP) vor, während und nach der Anwendung des Arzneimittels.
  7. Isolierung einzelner Neuronen.
    1. Am Ende der elektrophysiologischen Experimente, stoppen Sie die Perfusion von ASW und waschen Sie das Ganglien mit 100% Ethanol.  Die Exposition gegenüber Ethanol versteinert die Neuronen und macht es mit feinen Zangen einfach, einzelne Neuronen zu entfernen, ohne andere Neuronen aus dem Ganglion zu beschädigen.
    2. Entfernen Sie einzelne Neuronen unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie sie in eine kleine Eppendorf-Röhre, die eiskaltes 500-l-RNA-Extraktionsreagenz enthält. Isolierte Einzelneuronen können für zukünftige Analysen in RNA-Extraktionsreagenz bei -80 °C gespeichert werden.

2. RNA-Isolation aus Einzelnen Neuronen und Genexpressionsanalyse durch quantitative Real Time PCR (qPCR)

  1. Vorsichtsmaßnahmen zur Minimierung des RNA-Abbaus:
    Ribonukleasen (RNasen) abbauen die RNA und sind sehr stabile und aktive Enzyme. Führen Sie die folgenden Schritte bei der Behandlung von RNAs aus.
    1. Reinigen Sie den Arbeitsbereich und die Instrumente mit RNase-Deaktivierungsmitteln.
    2. Tragen Sie beim Umgang mit RNA jederzeit Handschuhe und wechseln Sie oft handschuhe.
    3. Verwenden Sie nur RNase-freie Kunststoffe, um RNAs zu handhaben.
  2. Isolierung der Total-RNA aus einzelnen Neuronen:
    1. Standard-Trizol-Protokoll für RNA-Isolierung kann verwendet werden, um RNAs aus einzelnen Neuronen zu isolieren. Kurz 20% v/v Chloroform zu Trizol hinzufügen, durch kurzes Wirbeln gut vermischen.
    2. Legen Sie die Rohre 10 min bei 4 °C auf den Rotator. Die Trizol-Chloroform-Mischung bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C drehen.
    3. Sammeln Sie die wässrige Phase und übertragen Sie in ein frisches Rohr.
    4. Natriumacetatlösung (pH 5.5) zu einer Endkonzentration von 0,3 M, 100 ng/ml des Coprecipitantglycos GlycoBlue und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzufügen, um DIE RNA auszufällen.
    5. Mischen Sie die Proben gut und brüten Sie bei -80 °C über Nacht.
    6. Drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C und ein kleines blaues Pellet wird an der Unterseite des Rohres sichtbar sein.
    7. Den Überstand entfernen und das Pellet mit 850 l 75% eiskaltem Ethanol bei 12.000 x g 10 min bei 4 °C waschen.
    8. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und trocknen Sie das RNA-Pellet für maximal 7-10 min.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die RNA nicht lange zum Trocknen als über- dasTrocknen des RNA-Pellets macht die Löslichkeit sehr schwierig.
    9. Nach dem Trocknen setzen Sie das RNA-Pellet in 10 l RNAs freies Wasser wieder auf und bestimmen die RNA-Konzentration.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Wenn Sie die RNA nicht sofort verwenden, lagern Sie die RNA bei -80 °C.
  3. aRNA-Synthese aus einzelnen Neuronen:
    1. Amplizieren Sie die RNA (eine oder zwei Runden je nach experimentellem Ziel) mit dem handelsüblichen linearen RNA-Verstärkungssystem.
      HINWEIS: Die gesamte RNA aus einzelnen Neuronen reichte von 10-60 ng. Die erwartete Ausbeute der ersten Amplifikationsrunde beträgt 100-300 ng und die zweite Verstärkerrunde beträgt 0,8-1,5 g RNA.
  4. Reverse Transkription der RNA:
    1. Um cDNA aus aRNA zu erzeugen, verwenden Sie 1,0 g aRNA in 20 l einer umgekehrten Transkriptionsreaktion. Mehrere Kits sind für diesen Zweck im Handel erhältlich.

      HINWEIS: cDNA wurde gemäß dem Herstellerprotokoll unter Verwendung der folgenden Einstellungen auf Thermocycler synthetisiert.
      5 min bei 25 °C
      30 min bei 42 °C
      5 Min. bei 85 °C
      Halten bei 4 °C
    2. Nach dem umgekehrten Transkriptionsschritt die cDNA bei -20 °C für eine Langzeitlagerung aufbewahren.
  5. Primer-Design und Standardisierung:
    Für die Entwicklung von Primern für Echtzeitverstärkungen stehen ihnen kostenlos mehrere hervorragende Softwareprogramme zur Verfügung.
    1. Wählen Sie 18-24 mer Oligonukleotide, die 70-110 bp Amplicons produzieren und die Primer mit kommerziellen Quellen synthetisieren.
      HINWEIS: Für jedes Gen von Interesse sollten zwei bis drei Primerpaare entworfen werden. Jeder Primer-Satz muss durch qPCR standardisiert werden. Die Vorwärts- und Reverse-Primer-Paare, die für das Gen CREB1 (Abbildung 4) verwendet wurden, sind unten:

      Primer-Set 1
      Vorwärts: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAAGA-3'
      Rückseite: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Primer Set 2
      Vorwärts: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Umgekehrt: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Um den besten Primer auszuwählen, der für die nachgeschalteten Analysen verwendet werden soll, überwachen Sie den Ct-Wert und die Form der Amplifikationskurve in qPCR.
      HINWEIS: Primer, die Ct-Werte (Zyklusschwelle) zwischen 10-35 in der 40-Runden-Verstärkung und glatte Kurven während der exponentiellen Phase der PCR geben, gefolgt von einem glatten Plateau, sind optimal für Genexpressionsanalysen.
  6. Quantitative Real Time PCR (qPCR):
    Hinweis: Verwenden Sie geeignete Rohre oder Platten, die mit der qPCR-Maschine kompatibel sind.
    1. CDNA mit nukleasefreiem Wasser auf 5x verdünnen.
    2. Fügen Sie auf 2 l verdünnte cDNA 8 l eines qPCR-Master-Mix hinzu, der 2 lH 2O, 5 l 2x SYBR Green Master-Mix und 1,0 l von 10 m (jeweils) vorwärts und rückwärts grundiert.
    3. Schließen Sie die Rohre und versiegeln Sie die Platte nach dem Pipetieren cDNA und Master-Mix. Mischen Sie den Inhalt durch sanftes Antippen und Abdrehen bei 1.500 U/min für 30 Sek.
    4. Fahren Sie mit der Einrichtung des qPCR-Computers fort.

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Ergebnisse

Die Gewichte der Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, reichten von 100-200 g. Nach den beschriebenen Protokollen führten wir elektrophysiologische Messungen und molekulare Analysen von Neuronen von Bauchganglien durch, die von Tieren im Bereich von 2-5 g bis 200-300 g isoliert wurden.

Die Standardisierung der Proteasebehandlung ist wichtig für erfolgreiche elektrophysiologische Messungen von Neuronen in den Ganglien. Zunächst wurden mehrere Protease-Konzentrationen (Dispase) und -daue...

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Diskussion

Das Neuron R15 ist an der Regulierung von Herz-Kreislauf-, Verdauungs-, Atem- und Fortpflanzungssystemenbeteiligt 30. Eine regelmäßig rhythmische Berstaktivität des AP ist ein Merkmal von R15. Wie im Ergebnisbereich gezeigt, zeigen gepaarte Aufnahmen von R15 und L7, dass das Ganglienpräparat die Aktivität von R15-Neuronen erhalten hat. R15 und L7 Neuronen reagierten angemessen auf Ach. Diese Ganglienpräparation konnte bis zu 8-10 Stunden aufrechterhalten werden und die elektrophysiologische Aktivität konnte ko...

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Offenlegungen

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken der Whitehall Foundation aufrichtig für ihre finanzielle Unterstützung und Start-up-Mittel vom Scripps Research Institute für die Durchführung dieser Arbeit.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2• 2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2• 6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5,5AmbionAM9740
Nukleasefreies WasserAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA-AmplifikationskitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
PinzetteFine Science Tools11252-20
SchereFine Science Tools15000-08
Edelstahl Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 oder
26002-20
Veriti ThermocyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R ZentrifugeEppendorf5430R Zentrifuge
7900HT Schnelle Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Schneller Real-Time PCR
VerstärkerBRAMP-01RNPI Elektronik
Digidata KonverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
MikromanipulatorPatch StarScientifica

Referenzen

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