Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

Zusammenfassung

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Zusammenfassung

Eine große Herausforderung in der Neurobiologie besteht darin, die molekularen Grundlagen neuronaler Schaltkreise zu verstehen, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Sobald die spezifischen molekularen Mechanismen identifiziert sind, können neue therapeutische Strategien entwickelt werden, um Anomalien in bestimmten Verhaltensweisen zu behandeln, die durch degenerative Erkrankungen oder Alterung des Nervensystems verursacht werden. Die Meeresschnecke Aplysia californica eignet sich gut für die Untersuchungen der zellulären und molekularen Verhaltensgrundlagen, da neuronale Schaltkreise, die einem bestimmten Verhalten zugrunde liegen, leicht bestimmt und die einzelnen Komponenten der Schaltung leicht manipuliert werden könnten. Diese Vorteile der Aplysie haben zu mehreren grundlegenden Entdeckungen der Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses geführt. Hier beschreiben wir eine Vorbereitung des Aplysia-Nervensystems für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen. Kurz gesagt, Ganglien aus dem Nervensystem seziert wird Protease ausgesetzt, um die Ganglienscheide so zu entfernen, dass Neuronen exponiert sind, aber neuronale Aktivität wie bei dem intakten Tier behalten. Dieses Präparat wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen von einzelnen oder mehreren Neuronen durchzuführen. Wichtig ist, dass die Neuronen nach der Aufzeichnung mit einer einfachen Methodik direkt aus den Ganglien für die Genexpressionsanalyse isoliert werden könnten. Diese Protokolle wurden verwendet, um gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von L7- und R15-Neuronen durchzuführen, ihre Reaktion auf Acetylcholin zu untersuchen und die Expression des CREB1-Gens in isolierten Einzel-L7-, L11-, R15- und R2-Neuronen von Aplysienzu quantisieren.

Einleitung

Das menschliche Gehirn ist außerordentlich komplex mit fast 100 Milliarden Neuronen und Billionen synaptischer Verbindungen. Es gibt fast eine gleiche Anzahl von nicht-neuronalen Zellen, die mit Neuronen interagieren und ihre Funktion im Gehirn regulieren. Neuronen sind in Schaltkreise organisiert, die bestimmte Verhaltensweisen regulieren. Trotz der Fortschritte in unserem Verständnis von Gehirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen ist wenig über die Identität von Schaltkreiskomponenten bekannt, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Das Wissen um die Identitäten verschiedener Komponenten einer Schaltanlage wird unser Verständnis sowohl der zellulären als auch der m....

Protokoll

1. Vorbereitung von Abdominal Ganglia, elektrophysiologische Messungen und Isolierung von Single Identified Neurons from Abdominal Ganglion of Aplysia californica

1. Aplysie im Laboraquarium mit zirkulierendem künstlichem Meerwasser (ASW) bei 16 °C unter 12:12 Licht:dunkel halten.
2. Isolierung von Bauchganglien.
   1. Anästhesisieren Sie Tiere durch Injektion von 380 mM MgCl₂ Lösung für 5-10 min (entspricht 30-35% des Körpergewichts des Tieres).
   2. Identifizieren Sie das Bauchganglien basierend auf seiner Position im zentralen Nervensystem^24,28.
   3. Entfernen Sie die Ganglien durch chirurgische Op....

Ergebnisse

Die Gewichte der Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, reichten von 100-200 g. Nach den beschriebenen Protokollen führten wir elektrophysiologische Messungen und molekulare Analysen von Neuronen von Bauchganglien durch, die von Tieren im Bereich von 2-5 g bis 200-300 g isoliert wurden.

Die Standardisierung der Proteasebehandlung ist wichtig für erfolgreiche elektrophysiologische Messungen von Neuronen in den Ganglien. Zunächst wurden mehrere Protease-Konzentrationen (Dispase) und -daue.......

Diskussion

Das Neuron R15 ist an der Regulierung von Herz-Kreislauf-, Verdauungs-, Atem- und Fortpflanzungssystemen^{beteiligt 30}. Eine regelmäßig rhythmische Berstaktivität des AP ist ein Merkmal von R15. Wie im Ergebnisbereich gezeigt, zeigen gepaarte Aufnahmen von R15 und L7, dass das Ganglienpräparat die Aktivität von R15-Neuronen erhalten hat. R15 und L7 Neuronen reagierten angemessen auf Ach. Diese Ganglienpräparation konnte bis zu 8-10 Stunden aufrechterhalten werden und die elektrophysiologische Aktivität konnte ko.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aplysia	National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl	SIGMA	S 3014-1KG
KCl	SIGMA	P 9333-500G
CaCl2• 2H2O	SIGMA	C5080- 500G
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific	BP 214-501
NaHCO4	SIGMA	S 6297-250G
HEPES	SIGMA	H 3375-500G
Protease	GIBCO	17105-042
Trizol	Ambion	15596-026
Chloroform	MP Biomedicals	2194002
100% Ethanol	ACROS	64-17-5
GlycoBlue	Ambion	AM9515
3 M NaOAc, pH 5,5	Ambion	AM9740
Nukleasefreies Wasser	Ambion	AM9737
MessageAmp II aRNA-Amplifikationskit	Ambion	AM1751
qScript cDNA SuperMix	Quanta Biosciences	95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
Pinzette	Fine Science Tools	11252-20
Schere	Fine Science Tools	15000-08
Edelstahl Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10 oder
26002-20
Veriti Thermocycler	Applied Biosystems	Veriti Thermal Cycler
5430R Zentrifuge	Eppendorf	5430R Zentrifuge
7900HT Schnelle Real-Time PCR	Applied Biosystems	7900HT Schneller Real-Time PCR
Verstärker	BRAMP-01R	NPI Elektronik
Digidata Konverter	Instrutech ITC-18	HEKA ELEKTRONIK
Mikromanipulator	Patch Star	Scientifica