Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

Zusammenfassung

Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit zweiten Harmonischen Nanopartikel (HNPs) vorgesehen ist. Letztere sind eine neue Gruppe von Sonden kürzlich zur Markierung von biologischen Proben für Mehrphotonenabbildungs ​​eingeführt. HNPs der Lage sind, eine Verdoppelung der Frequenz der Anregungslicht durch die nichtlinearen optischen Prozeß der Erzeugung der zweiten Harmonischen, ohne Beschränkung auf die Anregungswellenlänge.

Multi-Photonen-basierte Methoden für die hESC Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden im Detail vorgestellt. Insbesondere ist Beweis, wie die intensive zweiten Harmonischen (SH) Emission von isolierten HNPs während der 3D-Überwachung von Herzgewebe zu schlagen in 3D gezeigt maximieren. Die Analyse der entstandenen Bilder, 3D-Verschiebungsmuster abzurufen ist auch beschrieben.

Einleitung

Lineare Mikroskopiesysteme, die dank ihrer inhärenten dreidimensionalen Schneidefunktionen ausgelöst zunehmend die Nachfrage nach fotostabilen Fluorophore mit Zwei-Photonen-Absorptionsbanden im nahen Infrarot. Nur in den letzten paar Jahren, um die Entwicklung der Fluoreszenz-basierten Etiketten (Farbstoffe, Quantenpunkte Up-Converting-Nanopartikel), eine unterschiedliche bildgebende Methode ist die Verwendung einer neuen Familie von Natur aus nicht-linearen Nanopartikel als Etiketten zu nutzen, dh ergänzen Harmonische Nanopartikel (HNPs), die speziell für Multiphotonenmikroskopie entwickelt wurden. Diese Etiketten, basierend auf nicht-zentrosymmetrischen anorganischen Kristallen, ausüben optischen Kontrast Erzeugen des SH der Anregungsfrequenz: z. B. durch Umsetzen einer Fraktion von Nahinfrarot-Pulsanregungslicht (λ = 800 nm) in sichtbares blaues Licht (λ / 2 = 400 nm) . Mehrere Autoren in der jüngsten Vergangenheit haben verschiedene Materialien getestet, darunter Eisen Fe Jodat (IO _{3) 3 ^1, Kaliumniobat (KNbO 3) ^2, Lithiumniobat (LiNbO ³⁾ 3, Barium-Titanat (BaTiO 3) ^4,5-, Kalium-Titanyl-Phosphat (KTiOPO &sub4;, KTP) ^6-8, und Zinkoxid (ZnO ) ^5,9,10. Verglichen mit Fluoreszenzsonden, HNPs besitzen eine Reihe von attraktiven Eigenschaften, wie vollständiger Abwesenheit von Bleichen und blinkt, schmalen Emissionsbanden, Anregungswellenlängen-Abstimmbarkeit (von Ultraviolett bis Infrarot), Orientierung Gewinnungsfähigkeit und kohärente optische Antwort. Diese einzigartigen Eigenschaften wurden kürzlich in zwei umfassende Überprüfung Papiere ^11,12 erklärt. Die Möglichkeit der Arbeit in den infraroten Spektralbereich, die Bildtiefe erhöht sich durch die Minimierung Streuung und Absorption, drastisch begrenzt Beispielfoto Abbau ^13,14. Darüber hinaus ist die unendlich Foto-stabiles Signal von HNPs garantiert macht sie zu idealen Sonden für die langfristige Zellverfolgung, die ichist besonders attraktiv für die regenerative Medizin-Anwendungen ^15.}

In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit nicht funktionalisierten HNPs Verfügung gestellt. Die Synthese und Herstellung von kolloidalen Suspensionen in einer früheren Veröffentlichung und die darin aufgeführten ¹⁶ und geht über den Umfang dieser Arbeit. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden vorgestellt. Menschliche ESC lassen kann innerhalb sog. Embryoid Bodies (EBs) auf zwei verschiedenen Wegen, entweder durch EB Bildung von Kolonie-Fragmente in Suspension oder alternativ Zwangs Aggregation von einzelnen Zellen in EBs mit der Aggrewell Platte, wie in 1A dargestellt zu unterscheiden . Kultivierung schlagen Cluster von Herzzellen von Polytetrafluorethylen (PTFE), poröse Filter facilitates ihre langfristige Wartung für weitere Untersuchungen (z. B. elektrophysiologischen Messungen von Aktionspotentialen).

Die Anregungsquelle des Rastermikroskops ist in der Lage, ultrakurze Pulse (mit einer Pulsdauer kleiner als 300 fs bei der Probe), um die Spitzenleistung benötigt, um zweite harmonische Bildgebung HNPs zuführen erreichen liefern. Zum Beispiel, die häufigste Quelle für fs-Bildgebung verwendet werden abstimmbaren Ti: Saphir-Laser. Alternativ können andere Ultrakurzpulslaser eingesetzt werden, beispielsweise mit ^{Erbium-Ionen-17} Chrom Forsterit ¹⁸ oder Ti: Saphir-gepumpten optischen parametrischen Oszillatoren Infrarot. Das Mikroskop mit einem Objektiv mit vorzugsweise einem relativ hohen numerischen Apertur ausgestattet werden. Sehr wichtig ist, vor der Messung, und jedes Mal, wenn die Ziel ersetzt wird, ist es zwingend notwendig, in den Aufbau (Linsen), die die vorliegende Dispersion durch Optimieren der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter an der Arbeits minimierenWellenlänge der Wahl. Dieses Verfahren, das in dem Protokoll beschrieben, stellt sicher, dass der Laserimpuls ist so nah wie möglich an der zu transformieren begrenzter Dauer (dh kürzesten wie möglich) in der Brennebene und maximiert die Probe nichtlinearen Antwort.

Das Ziel des am Ende des Protokolls beschriebenen Bildanalyse ist die Identifizierung und Verfolgung in 3D HNPs Bewegungen mit den rhythmischen Kontraktionen des Herz schlagen Cluster verbunden. Tracking-Nanopartikel in der Bildebene wird einfach durch Ermittlung ihrer Positionen in aufeinanderfolgenden Filmrahmen realisiert. Informationen über eine axiale Bewegung zu extrahieren, ist eine vorherige Kalibrierung der Intensität nichtlinearen Antwort als eine Funktion der axialen Verschiebung zwingend. Beachten Sie, dass für Langzeitmessungen, eine aktive Steuerung der interferometrischen Probe axialen Position ist erforderlich, um die Gültigkeit der Kalibrierungskurve in Gegenwart von thermischen und / oder mechanischen Drifts zu halten.

Die auf trac welche hier HNPse gegen Zellen innerhalb Aggregate werden auf Kaliumniobat Oxid (KNbO ₃₎ auf, aber auch andere zur Verfügung nichtlineare Nanomaterialien sind im Detail in der Arbeit von Staedler et al ¹⁶ prüft.

Die nichtlineare optische Effizienz der meisten der bisher untersuchten Nanomaterialien sind sehr vergleichbar. Die Wahl für KNbO ₃ wurde im Wesentlichen durch die gute Stabilität der kolloidalen Lösung und ihre gute Biokompatibilität auf mehreren menschlichen Zelllinien auch bei ziemlich hohe Konzentration und lange Expositionszeiten ¹⁶ getestet motiviert.

Angesichts der Neuartigkeit der für diese Arbeit eingesetzten Nanomaterialien werden die wichtigsten Merkmale der HNPs im Vergleich zu fluoreszierenden / lumineszierende Biomarker in einer kurzen ursprünglichen Computer-Videoanimation von den Autoren klar gezeigt.

Protokoll

1., Kultur und Erweiterung des menschlichen ESC

1. Vorbereitung der Zellausbreitungsmedium (PM genannt), die Knockout DMEM, ergänzt mit 20% Knockout Serum, 1% MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin und 3,5 ul β-Mercaptoethanol.
2. Auftauen menschlichen ESC (hES) in 8 ml PM-Medium und zentrifugieren 5 min bei 115 x g DMSO-Gefriermedium ergänzt verwerfen.
3. 1 ml der PM-Medium mit 10 mM Rock-Hemmstoff, um Apoptose zu verhindern und das Überleben der Zellen zu verbessern, auf dem Auftauen (nur 24 Stunden Inkubation).
4. Hinzufügen basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) mit dem PM in der gewünschten Konzentration (4-10 ng / ml) für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz.
5. Plate Die HES an bestrahlten menschlichen Vorhaut-Feeder-Zellen (γHFF) (Fig. 1A), die zuvor in einer Konzentration von 2 x 10 ⁴ Zellen / cm ² ausplattiert.
6. Medium täglich ändern und, falls erforderlich, Teile von c zu entfernenolonies beginnen zu differenzieren durch Aspiration mit einer länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette.
7. Einmal in der Woche, Passage Kolonien enzymatisch:
   1. Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS.
   2. Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO _2.
   3. Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neue PM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min.
8. Alternativ können Kolonien mechanisch durch Abkratzen agiert werden:
   1. Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS.
   2. Manuelles kratzen Kolonien mit der StemPro EZPassage Rollenschälgerät (Abbildung 1B).
   3. Kolonie-Fragmente zu sammeln und zu zentrifugieren dann 3 min bei 115 · g, um den Überstand zu entfernen.
   4. Plattenfragmente auf γHFF oder verarbeiten sie zur Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG).

2. Menschen ESC DifferenzierungProtokoll

1. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) mit Knockout DMEM mit 2% Hyclone Serum, 1,0% MEM Non-Essential Amino Acids, 1,0% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin, 3,5 ul β-Mercaptoethanol.
2. Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS.
3. EB Bildung der Kolonie Fragmente in Suspension:
   1. Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO _2.
   2. Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neuen DM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min.
   3. Kultur sie in Suspension in Ultra-Low-Befestigung 6-Well-Platten (2 ml pro Well) für 4 Tage (Abbildung 1C).
   4. Sammeln und Platte die neu gebildeten EBs auf 0,1% Gelatine beschichtete 24-Well-Platten (ca. 3 EVG / well) (Abbildung 1D).
4. Alternativ gezwungen Aggregation von Einzelzellen in EVG mit der Aggrewell Platte:
   1. PBS und entfernendistanzieren Kolonien in einzelne Zellen mit Accutase (0,5 ml / Vertiefung).
   2. Zentrifuge und resuspendieren Zellen in DM auf 1,2 x 10 ⁶ / ml.
   3. 2 ml pro Aggrewell Kammer für 1 Tag (Abbildung 1B).
   4. Sammeln neugebildeten EBs (Fig. 1C) und der Platte sie auf 0,1% Gelatine beschichteten 24-well-Platten (etwa 3 EBs / Vertiefung).
   5. Ändern DM alle 2-3 Tage bis zum Erscheinen des Schlagens Cluster von Kardiomyozyten (15-30 Tage).

3. Klima flüssigen 3D-Kulturen von Beating Cluster und Markierung mit HNPs

1. Identifizieren und manuell sezieren Cluster schlagen Kardiomyozyten (1D), in der Regel nach 2-4 Wochen der Kultur erscheinen, mit einem länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette.
2. Kaution 4 PTFE-Filter pro Einsatz, der auf einem 6-Well-Platte (Abb. 1F) gestellt werden.
3. 1 ml der DM Medium auf der Oberseite des each gut.
4. In einem seziert schlagen Cluster auf jedem PTFE-Filter (1E), maximale 4/well, dh 24 Aggregaten pro Platte (1F).
5. Ändern DM Medium alle 2-3 Tage.
6. Um die Cluster zu markieren, entfernen Sie die PTFE-Filter, der die Prügel-Cluster und legte es auf 3,5 cm Glasbodenschale (170 um dick).
7. 1 ml HNP in einer Konzentration von 50 ug / ml für 30 min.

4. Nichtlinearen optischen Imaging

1. Probenvorbereitung. Nach HNP-Kennzeichnung (siehe Schritt 3.6), Transfer entweder ganz früh differenzier HeBS oder Herz-Schlagen-Cluster (bei Kontraktion Aussehen seziert) auf PTFE-Filter über einen 170 um dicke Glasbodenschale mit der Arbeitsabstand von hoher numerischer Apertur Zielen vereinbar. Alternativ tragen Sie eine Direktbeschichtung gegen Cluster auf die Glasbodenschale mit 0,1% Gelatine vor, beschichtet.
2. Über Proben einall-in-one-Mikroskop mit Inkubationskammer eine stabile Temperatur, Feuchtigkeit und CO _2-Regelung über längere Zeit ausgestattet.
3. Nach der ersten Inspektion, Bild der Probe über Weitfeld-Bildgebung unter Beleuchtung mit weißem Licht, um Strukturen von Interesse innerhalb differenzierten EBs oder aktive Schlagen Cluster, die für weitere Untersuchungen ausgewählt werden identifizieren.
4. Wenn die Zelle Autofluoreszenz von NADH und SH aus HNPs gleichzeitig erworben werden müssen, eine kürzere Laser-Anregungswellenlänge (zB 720 nm), um die molekulare Absorption entsprechen. Verwenden einen schmalen Bandpassfilter bei spektralen halben Anregungswellenlänge zentriert ist (dh λ = 360 ± 10 nm) bis SH erfassen, und eine weitere, um Autofluoreszenz zu detektieren.
5. Erstens eine schnelle, niedrige Auflösung, dreidimensionale Scan, um die Gesamt Morphologie des Herzcluster erneut, und wählen Sie eine Bildebene innerhalb der Cluster-Volume mit mehreren sichtbaren HNP durchführens.
6. Wenn nötig, ändern Sie die Anregungswellenlänge frei optischen Eigenschaften der Probe am besten entsprechen oder Photobleaching, Foto-Schäden und Bild tiefer in Gewebe mit einem IR-Wellenlänge (dh 790 nm) zu vermeiden und die zweite Harmonische Filter ersetzen entsprechend (dh 395 nm ). Optimierung der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter bei der Arbeitswellenlänge der Wahl durch die Maximierung der zweiten harmonischen Signal der HNPs auf die Probe aufgebracht.
7. Um in Echtzeit überwachen die Herzkontraktionen Cluster, stellen Sie das Mikroskop optischen Scanner im schnellsten Modus wie Resonanzmodus, so dass mit hoher Geschwindigkeit Erwerb von zweidimensionalen Bildern.
8. Wählen Sie die Einstellungen als beste Kompromiss zwischen Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit, wie etwa:
   • Scan Mittelung: 4
   • Pixelverweilzeit: 0,1 Mikrosekunden
   • Bildrate: 3,75 Bilder pro Sekunde (fps)
9. Laserleistung wird nach Brennfleck s eingestelltize-und Scan-Geschwindigkeit. 50 mW (gemessen am Eingang des Objektivs) ist ein typischer Wert für 0,1 us Pixelverweilzeit und Plan APO 20x NA 0,75 Ziel die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen.

5. Bildanalyse

1. Axial-Kalibrierung. Wählen Sie ein einzelnes HNP auf einer blanken Substrat abgeschieden. Die Scharfeinstellung (dh der axialen Position des Nanopartikels) zur Maximierung der Intensität SH. Variieren, in einer kontrollierten Art und Weise die axiale Position des Mikroskoptisches, um die Kalibrierungskurve, die SH-Intensität als Funktion der HNP erhalten von der Fokalebene versetzt sind. Der Ausgang dieses Kalibrierungsverfahren für den Plan APO 20X 0,75 NA Objektiv in 4C angegeben.
2. Wählen Sie in allen Video-Frames vorhanden HNPs und bestimmen deren periodische Bewegungen. Dieses Verfahren kann leicht automatisiert werden, zum Beispiel durch einen eigenen Code auf der Suche nach maximaler Intensität Signal-Spots in einem definierten Bereich von Interesse undunter verschiedenen Rahmen verbindet sie (ein Beispiel-Code in Matlab R2009 b mit Hilfe der Funktion "Region Requisiten" der Image Processing Toolbox geschrieben wird vorgelegt).
3. Bewerten Sie die Quantifizierung der Out-of-Plane-Verschiebungen, mit nicht-kontinuierlich nachvollziehbar HNPs sich entlang der optischen Achse, durch die Umwandlung ihrer Intensität Modulationen in ganz verschiedenen Rahmen in axiale Verschiebung anhand der Eichkurve in Schritt 5.1 fest verbunden. Beachten Sie, dass diese Prozedur ermöglicht den Zugriff auf axiale Bewegungen, aber nicht verwendet werden, um die absolute Richtung (nach oben oder unten) zu bestimmen.

Ergebnisse

Vor der Bewertung der Schlagaktivität durch konfokale Bildgebung wurde eine sorgfältige Charakterisierung der nichtlinearen optischen Antwort der PTFE-Filter durchgeführt wird, entweder allein oder in Gegenwart von HNPs bei hoher Konzentration (1 mg / ml). Es wurde sichergestellt, dass: i) die blanke Substrat Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz ist sehr schwach und kann nicht die Messung der relevanten biologischen Proben zu verhindern, und ii) das SH-Emission aus isolierten HNPs kann leicht durch Abbilden durch das Su...

Diskussion

Die Anwendung der Nanotechnologie zur Stammzellforschung ist ein relativ neues, aber rasch wachsenden Bereich. Wie durch verschiedene Übersichtsartikel zu diesem Thema erwähnt, kann die Verwendung von Nanopartikeln verwendet werden, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen Forschung, die von Zellverfolgung (sowohl in vitro als auch in vivo), um die intrazelluläre Abgabe von Proteinen und Genen, nicht zuletzt die Schaffung biomimetische zellulären Umgebungen für Vorzugs Stimulation / Hemmung der spezifischen Differe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikroskop-Inkubator	OKO LAB	UNO Paket (obere Stufe)	37 ° C, 5 % CO2, mit Feuchtigkeit
Multiphotonenmikroskop	Nikon	AR1-MP
Schnelles Scannen, vier Descan-Detektoren
Filter SHG und Autofluoreszenz	Semrock	FF01-360/12-25
FF01-395/11-25
FF02-485/20-25
Mikroskopobjektive	Nikon
CFI Plan Fluor 10X			NA 0,30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20X			NA 0,75, WD 1,0 mm, VC
CFI Apo 40X			NA 1,25, WD 0,18 mm λ S, Nano-Crystal Coat
Rhock Inhibitor	Sigma	Y-27632
Knockout DMEM	Invitrogen	10829
Knockout Serum	Invitrogen	10828
MEM, nicht-essentielle Aminosäuren	Invitrogen	1140
L-Glutamin 200 mM	Invitrogen	25030
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Kollagenase IV	Gibco	17104-019
Walzenzieher-Werkzeug	StemPro EZPassage, Invitrogen	23181-010
StemPro Accutase	Gibco	S11105-01
Aggrewell-System	StemCell Technologies	27845
Hyclone Serum	Thermo Scientific	SH30070.03
Gelatine	Sigma	G9391
6-Well-Platten	Falcon	353046
24-Well-Platten	Nunclon	142475
Filter aus Polytetrafluorethylen (PTFE)	Millipore	NA76/25
Einsätze	Millipore	PICM03050