Methodenartikel

Zell-basierte Therapie bei Herzinsuffizienz in Rat: Doppel Thorakotomie für Herzinfarkt und Epikardiale Implantation von Zellen und Biomatrix

DOI:

10.3791/51390

⸱

22. September 2014

 ,  ,  ,  , 
1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implantation eines biograft Myokardinfarkt durch LAD-Ligation in einem Nagetiermodell induzierte Behandlung wurde üblicherweise erforderlichen zwei Operationen am offenen Herzen. Um die Sterblichkeit zu reduzieren und optimale Bedingungen für die Fixierung von festen und gallertartige Biomatrices mit Zellen verbunden sind, haben minimal-invasive Verfahren entwickelt worden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herzzelltherapie wird zunehmend Interesse und die Implantation von Biomaterialien mit Zellen verbunden ist zu einem wichtigen Thema zu Herzmuskelzelle Lieferung optimieren. Nagetiermodell von Myokardinfarkt (MI), die aus linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) Ligation üblicherweise über eine Thorakotomie durchgeführt worden ist; eine zweite Operation am offenen Herzen über eine Sternotomie traditionell für epikardiale Anwendung der Behandlung durchgeführt. Seit der Beschreibung der LAD-Ligation-Modell, hat nach der Operation Sterblichkeitsrate von 35 bis 13% gesunken, aber die zweite Operation hat kritische geblieben. Zur Verbesserung der postoperativen Erholung und verringern Schmerzen und Infektionen, sind minimal-invasive Operationsverfahren vorgestellt. Zwei Thorakotomien durchgeführt wurden, die die ursprüngliche für KOP-Ligation und die zweite für die Behandlung epikardialen Verwaltung. Biografts bestehend aus Zellen, die mit festen oder gelartigen Matrizen assoziiert wurden auf die Infarkt ar angewendetea. LAD-Ligation führte zu Verlust der Herzfunktion, wie durch Echokardiographie nach 2 und 6 Wochen durchgeführt bestätigt. Goldner Trichrom-Färbung auf Herz Abschnitten durchgeführt bestätigt transmurale Narbenbildung. Ersten und zweiten Operationen führten zu weniger als 10% der postoperativen Mortalität.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seit dem Ende des 19. Jahrhunderts hat sich Herz-Kreislauf-Krankheit die Nummer eins Serienmörder in den Industrieländern blieb. Unter ihnen, koronare Herzkrankheit stellt die Haupt Ätiologie. Die akute Phase Ergebnisse in Myokardinfarkt (MI) und wird durch maladaptive Umbau, die schrittweise entwickelt zu einer chronischen Phase und schwerer Herzinsuffizienz gefolgt. Trotz der jüngsten bedeutenden technologischen und therapeutische Fortschritte, die Morbidität und Mortalität aufgrund der Progression der Herzinsuffizienz noch wächst 1. In diesem Zusammenhang hat die Zelltherapie zunehmend Interesse als eine neue therapeutische Option, um die Progression der Krankheit zu Herzversagen zu stoppen und die kürzlich identifizierten Regenerationsfähigkeit des Herzmuskels stimulieren gewonnen. Experimentelle und klinische Untersuchungen haben überzeugende Beweise für die nach Herztransplantation von verschiedenen Zelltypen erhalten wohltuende Wirkung zur Verfügung gestellt. Wichtigsten Ergebnisse enthalten verbesserte Cardiac Kontraktionsfunktion, Abnahme der linksventrikulären Remodeling, reduzierte die Infarktgröße und erhöhte Gefäßdichte im Infarktgebiet. Die niedrige Zellzahl Retention nach Zellinjektion blieb jedoch ein wichtiger Nachteil. Verband der Zellen mit einer Biomatrix auf der Zellliefer 2 zu verbessern, haben kürzlich Forscher gefördert und klinische Interessen.

Ligation der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD) ist ein Referenzmethode für MI in der Kleintiermodell, das in transmuralen Infarkt und einer reifen Narbe führt. Zelltherapie in der chronischen Phase der MI angewendet erfordert einen zweiten chirurgischen Eingriff. Eine mediane Sternotomie wird üblicherweise durchgeführt, um intramyokardiale Injektion der Zellen oder epikardiale Implantation biografts ermöglichen. Solche invasive chirurgische Verfahren erhöhen die Sterberate, postoperative Erholungszeit, Schmerzen und Infektionsrisiko. Die minimal-invasive Ansatz hier präsentierten nicht nur verhindert, dass solche Voreingenommenheit, sondern bietet auch optimale Zugänglichkeit des Herzens zur Behandlung Anwendung. MI und epikardialen Implantation von Zellen, die mit einem gelartigen Biomatrix verbunden sind an einem schlagenden Herz über linke Rippenthorakotomien geführt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Lewis männlichen und weiblichen Ratten wurden 200-220 g unter Standardlaborbedingungen (12 Stunden Licht und Dunkel-Zyklus, ad libitum Wasser und Nahrung, IVC-Käfig) untergebracht. Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des FELASA und der Schweizer Tierschutzgesetzes behandelt.

1. Zell Zubereitung: mesenchymale Stammzelle Isolierung aus dem Knochenmark

  1. Betäuben die Ratten mit Isofluran 5% O 2 und 5 l / min in einer Induktionskammer für 5 min. Legen Sie das Tier die Schnauze in ein Nasenkegel auf die Anästhesie-System verbunden. Führen Sie eine Zehe oder Schwanz Prise zu Sedierung bestätigen.
  2. Entfernen Sie die Haut von dem Bein mit der Schere, indem die Haut vom Knöchel bis zur Hüfte. Entfernen Sie die Muskeln und schneiden Sie die Oberschenkelarterie für Tier Ausbluten. Setzen Sie das Hüftgelenk und den Oberschenkelknochen verrenken Kopf. Es ist wichtig, den Oberschenkelkopf beschädigen. Zeigen die Knochen in sterilem PBS in ein 50 ml-Kunststoffröhrchen.
  3. Entfernen Sie alle muscles und Bänder aus den Knochen, ohne zu brechen. HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Knochen intakt bleibt, um die Verknüpfung von Spüllösung oder Kontamination mit Ethanol zu vermeiden. Spülen Sie die geschälten Knochen in 70% Ethanol für 5 min.
  4. Unter der sterilen Laminarströmungshaube werden, beide Spitzen der Knochen mit einer Schere. Spülen Sie das Knochenmark durch die Injektion von sterilem PBS aus dem Knochen Extremität. Sammeln Mark in einen 15-ml-Tube. Zentrifuge 7 min bei 300 x g.
  5. Entfernen Sie den Überstand. Hängen Sie das Pellet in 3 ml Lyse der roten Blutkörperchen Puffer. Inkubieren der Suspension für 1 min bei Raumtemperatur vor dem Verspinnen erneut für 7 Minuten bei 300 x g beträgt. In einem 150 ml-Kulturflasche, fügen sterile Zellkulturmedium (395 ml IMDM-Medium, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 100 ml FBS) und Samen die Zellen.
  6. Ändern Medium der zweite Tag zu nicht-adhärenten Zellen zu entfernen.
    1. Führen Mediumwechsel jeden zweiten Tag für 2-3 Wochen, bis die gewünschte Zellmenge erreicht ist.
    2. Alternativ bereiten die biograft durch Samening der Zellen auf der festen Matrix nach Bedarf und an anderer Stelle beschrieben 3.
  7. Der Tag der Herzimplantation, bereiten Sie die Zellen oder ernten die biograft kurz vor epikardialen Anwendung.
    1. Sammeln Sie die Zellen mit Zellablösung Accutase Lösung. Zählen Sie die Zellen. Füllen einer 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen mit dem Volumen der Zelle berechnet, um die gewünschte Menge zu erhalten Zellsuspension. Zentrifuge für 7 min bei 300 g und entfernen Sie den Überstand.
    2. Alternativ ernten biograft von Zellkulturmedium gründlich in sterilem PBS und in frischem Kulturmedium ohne Serum zu halten.

2. Erste Thorakotomie und LAD-Ligation

  1. Wiegen die Ratte. Schalten Sie das Heizkissen bei 37 ° C aufweist. Betäuben die Ratte mit 5% Isofluran und 5 l / min 100% O 2 in einer Induktionskammer für 5-7 min. Führen Sie eine Zehe oder Schwanz Prise zu Sedierung bestätigen. Legen Sie die Ratte auf dem Heizkissen.
  2. Intubieren das Tier mit einem 14G IV-Katheter. Verbinden der Intubation Katheters zu einem 2,5 l / min Sauerstoff, 2,5% Isofluran, Atemvolumen von 2 ml, und einer Atemfrequenz von 90 Atemzügen / min programmiert Nagetier Ventilator.
  3. Bereiten Sie ein Buprenorphin-Lösung bei 0,1 mg / kg. Injizieren subkutan ein Drittel der Lösung. Rasur den linken Teil des Brustkorbs. Desinfektion mit einer 1% Betadine Lösung.
  4. Inzision der Haut senkrecht auf das Brustbein an der vierten Zwischenrippenraum. Trennen Sie die 3 Schichten des Brustmuskels (M. pectoralis major, aufsteigend Brustmuskel, und äußeren schrägen pectoralis). Öffnen Sie den vierten Zwischenrippenraum (zwischen den Rippen 4 und 5).
  5. Verwenden Sie einen kleinen Aufroller, um die Rippen zu verbreiten und das Herz freizulegen. Öffnen Sie den Herzbeutel vorsichtig. Lokalisieren und zu ligieren den linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD) mit einem 7,0 Faden 4 mm unterhalb des Atrium.
  6. Schließen Sie die Zwischenrippenraum mit zwei Maschen mit 3,0 Nähten. Positionieren Sie die beiden Fäden proximal und distal vom Brustbein. Erstens tighten das distale Naht. Spannen Sie den Ventilator Abluftschlauch für 2 Sekunden, um die Brust aufpumpen und vermeiden Sie jegliche Pneumothorax. Ziehen Sie die zweite Naht. Positionieren Sie die Muskeln Schichten wieder an Ort und Stelle (keine Nähte erforderlich sind). Schließen Sie die Haut mit einem 5,0 Faden.
  7. Desinfizieren Sie die Naht mit 1% Betadine Lösung. Injizieren den Rest der Buprenorphin-Lösung. Schalten Sie das Anästhesiesystem. Intubation Katheter zu entfernen.
  8. Halten Sie die Ratte im Käfig unter einer warmen Lampe für 1-2 Stunden. Halten ein Thermometer in den Käfig und Steuerung des Abstandes zwischen der warmen Lampe und dem Käfig, um ein Überhitzen zu vermeiden. Bringen Sie die Ratte in der IVC-Einheit. Injizieren subkutan Buprenorphin 0,05-0,1 mg / kg nach -operatively alle 6-12 h für 48 Stunden.

3. Epikardiale Verwaltung der Behandlung über eine zweite Thorakotomie

  1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3.
  2. Inzision der Haut senkrecht auf das Brustbein an der fünften Zwischenrippenraum. Trennen Sie die 3-Schichts der Brustmuskel (pectoralis major, aufsteigend pectoralis und äußeren schrägen pectoralis). Öffnen Sie den fünften Zwischenrippenraum (zwischen den Rippen 5 und 6).
  3. Verwenden Sie einen kleinen Aufroller, um die Rippen zu verbreiten und das Herz freizulegen. Wenn es einige Festhalten, sorgfältig entfernen Sie sie mit einer feinen Pinzette.
  4. Suchen Sie den Infarktbereich, der als hell Bereich unterhalb der Ligatur erscheint. HINWEIS: Wenn nötig, verwenden Sie ein 10 cm Stück Faden (7,0) an der Spitze eingesetzt, um den linken Ventrikel besser zu visualisieren. Ziehen Sie vorsichtig an der Naht lose durch eine Klammer gehalten, um das Herz freizulegen.
  5. Tragen Sie eine der folgenden Behandlungen:
    1. Positionieren Sie den biograft an der Oberfläche des Herzens. Verwenden Sie die vorgefüllte Spritze Fibrinkleber bei Raumtemperatur für 10 min vorgewärmt. Geben Sie einen Tropfen (50-100 ul) Fibrinkleber unter der biograft mit einem 25 G Luer Nadel. Stellen Sie sicher, dass die biograft ist perfekt abgedichtet.
    2. Alternativ gilt das Zellpellet mit einer Pipettenspitze an der Oberfläche gesammelt of Herzen auf dem blassen Bereich unterhalb der Ligatur. Geben Sie einen Tropfen (50-100 ul) Fibrinkleber auf dem Zellpellet.
  6. Entfernen Sie das Stück Faden von der Spitze.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.8.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tiere innerhalb 1 Stunde nach Thorakotomien erholt. Die Wundheilung war schnell. Keine Infektion oder Ödeme beobachtet.

Das Doppel Linksthorakotomie erlaubt optimalen Zugang zum Herzen (Abbildung 1). Schmerzen und postoperative Mortalität waren gering. Das Tier erholte sich schnell von der Operation und nahm an Gewicht zu (Abbildung 2). Kaplan Meir Überleben Prozent betrug 96% für die erste Thorakotomie. Vier Ratten über 104 starben innerhalb von 24 Stu...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die dauerhafte Unterbindung der LAD irreversiblen Myokard-Schädigung. Die erste Tiermodell wurde im Jahre 1960 4 beschrieben. Seitdem es als Standard und geeignetes Modell für chronische MI berücksichtigt. Seine Stabilität und Reproduzierbarkeit erlaubt experimentelle Evaluation von Therapien für MI 5. Verbesserte Verfahren nach der ersten Beschreibung meldete einen operativen Mortalitätsrate von 35-13% 6.

Wie erwartet, LAD-Ligation induzierte innerhalb von 2...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Prof. Hendrik Tevaearai und die Abteilung für Gefäßchirurgie für die finanzielle Unterstützung für die erste Teil der Studie.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Polysorb 3-0 NahtCovidienUL 204
Polysorb 5-0 NahtCovidienUL 202
Surgipro II 7-0 NahtCovidienVP904X
Katheter Insyte 14 GBD381267
Inspira Advanced Volume Controlled VentilatorHarvard Apparatus557058
Dumont #7 PinzetteFST Germany11274-20
Fibrin-DichtstoffBaxter1501441TISSEEL Kleber, gefroren -20 > C
Castroviejo AugenspekulaHarvard Gerät72-8925Verwendung als Retraktor für die Rippen
IMDM GlutaMAXGibco31980
Pen/StrepGibco15140
FBSPAA Klon         A15-101
KnochenschereFine Science Tools16044-10
Lösung zur Lyse roter BlutkörperchenGentra SystemsD-50k1
Accutase ZellablösungslösungStammzelltechnologie7920

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
  2. Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
  3. Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
  4. Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
  5. Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
  6. Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
  7. Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
  8. Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
  9. Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
  10. Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
  11. Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
  12. Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
  13. Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
  14. Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

RattenmodellLAD LigationThorakotomie VerfahrenEchokardiographie UntersuchungHistologische AnalyseKnochenmarkisolierung

Verwandte Artikel