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Methodenartikel

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

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DOI:

10.3791/51394

⸱

2. Juli 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Lewis & Clark College, 2Program in Biochemistry and Molecular Biology, Lewis & Clark College, 3Jungers Center for Neuroscience Research, Oregon Health & Science University, 4Department of Chemistry, Lewis & Clark College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen.

Zusammenfassung

Detektion von Fluoreszenz ist die Grundlage für viele weithin genutzt und rasch fort Mikroskopie-Techniken in der modernen biologischen und medizinischen Anwendungen eingesetzt. Stärken der Fluoreszenz sind seine Sensitivität, Spezifität und die Kompatibilität mit Live-Bildgebung. Leider konventionellen Formen der Fluoreszenzmikroskopie leiden an einer großen Schwäche, beugungsbegrenzten Auflösung in der Bildebene, die Untersuchungen von Strukturen mit Abmessungen kleiner als ~ 250 nm behindert. Vor kurzem hat diese Einschränkung mit der Einführung der Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie Techniken, wie photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) überwunden. Anders als ihre konventionellen Pendants, können PALM Bilder mit einer lateralen Auflösung von zehn Nanometern zu erzeugen. So ist es nun möglich, Fluoreszenz zu verwenden, mit seinen unzähligen Stärken, um ein Spektrum von bisher unzugänglichen Attribute der zellulären Struktur und Organisation aufzuklären. _content "> Leider ist PALM nicht trivial zu implementieren und erfolgreiche Strategien müssen oft auf die Art des untersuchten Systems angepasst werden. In diesem Artikel zeigen wir, wie einfarbige PALM Studien von vesikulären Strukturen in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. PALM ist ideal, um das Studium der Vesikel, die Dimensionen, die typischerweise im Bereich von ~ 50-250 nm. Schlüsselschritte in unserem Ansatz enthalten haben geeignet Kennzeichnung Neuronen mit photoconvertible (grün bis rot) Chimären Vesikel Fracht, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer Super-Resolution-Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, um eine hochauflösende Bild PALM produzieren. Wir haben auch die Wirksamkeit unseres Ansatzes zu demonstrieren indem außergewöhnlich gut aufgelöste Bilder der Dense-Core-Vesikel (dcvs) in kultivierten Hippocampus-Neuronen, die zu widerlegen die Hypothese, dass extrasynaptische Handel dcvs wird weitgehend von DCV-Cluster vermittelt.

Einleitung

Eine Reihe von zellulären Prozessen abhängig von genauen und effizienten Vesikel vermittelten Handel von Biomolekülen an spezifischen subzellulären Destinationen. Ein prominentes Beispiel ist die synaptische Versammlung, die durch langfris reichten, Vesikel-vermittelte Abgabe der synaptischen Bestandteile von Seiten der Biogenese der neuronalen Soma potenziell distalen prä-und postsynaptischen Websites 1 vorangestellt ist.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke und beliebte Methode der Untersuchung Vesikeltransport. Stärken der Methode sind seine Sensitivität, Spezifität und die Kompatibilität mit Live-Bildgebung 2. Leider bis vor kurzem die Technik von einer großen Schwäche, beugungsbegrenzten Auflösung 2, die Untersuchungen von Strukturen mit Abmessungen kleiner als ~ 250 nm behindert gelitten. Kürzlich laterale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie übertraf die Beugungsgrenze mit der Einführung der Super-Resolution-Fluoreszenz miMikroskopie-Techniken, wie PALM 3. Die laterale Auflösung von PALM, zehn Nanometern, ist ideal, um das Studium der Vesikel, die Dimensionen, die typischerweise im Bereich von 50 bis 250 nm ~ 4 haben geeignet. So ist es nun möglich, Fluoreszenz zu verwenden, mit seinen unzähligen Stärken, um ein Spektrum von bisher unzugänglichen Attribute von Vesikeln, darunter auch einige Aspekte ihrer Handel auf bestimmte Websites subzellulärer aufzuklären.

PALM ist nicht einfach zu implementieren und erfolgreichsten Strategien müssen oft von der Art des untersuchten Systems zugeschnitten werden. Hier beschreiben wir, wie man PALM Studien von vesikulären Strukturen zu implementieren, und wir zeigen die Wirksamkeit unseres Ansatzes für den Fall der dcvs in Hippocampus-Neuronen. Insbesondere verwenden wir PALM zu der Hypothese, dass der Menschenhandel zu dcvs Synapsen im Hippocampus-Neuronen-Adresse wird von DCV Cluster 8.5 vermittelt.

Cluster-vermittelte Handel Vesikel an Synapsen in Entwicklungs neurons ist eine faszinierende Möglichkeit, weil es schnelle synaptische Stabilisierung und Montage 9,10 erleichtern. Die Befürworter der Clusterhandel dcvs zitieren die große scheinbare Größe extrasynaptische Fluoreszenz puncta beherbergen exogene DCV Fracht, wie Nachweise für Clustering-6. Allerdings erscheinen diese puncta in Bildern erzeugt unter Verwendung von beugungsbegrenzten Fluoreszenzmikroskopie-Techniken, die nicht zu unterscheidende Größe Wirkungen, die sich aus der Beugung von denen aus Clustering geeignet sind.

Um dieses Problem zu beheben, haben wir für konventionellen Weitfeld-Fluoreszenz und PALM Bilder von Hippocampus-Neuronen, Chimären zu dcvs richtet. Die Analyse dieser Bilder ergab, dass> 92% der vermeintlichen extrasynaptische DCV-Cluster in konventionellen Bildern als 80 nm (Einzel DCV-Größe) 11 puncta in PALM Bildern behoben. Somit sind diese Daten weitgehend zum Erlöschen der Clustering-Hypothese über dcvs in Entwicklungs hippoca angewendetMPAL Neuronen.

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Protokoll

1. Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie einen DNA photoconvertible oder photoaktivierbares Chimäre gezielt auf dcvs, mit molekularbiologischen Standardtechniken codiert.
    Hinweis: Eine Möglichkeit ist, DNA, die für ein Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Dendra2 Chimäre (tPA-Dendra2). Dendra2 photoconvertible ist ein Protein, das von grün auf rot Emission bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht 12 schaltet.
  2. Kultur Neuronen im Hippocampus auf Hochleistungs # 1.5 Deckgläser für ca. 5-10 Tage, nach Standardprotokollen 13.
  3. Transfektion von Neuronen im Hippocampus entwickelt unter Verwendung eines kationischen Lipid-Reagenz.
    Hinweis: Viral-vermittelte Infektion ist effektiver für die reife Nervenzellen. Dieser alternative Ansatz wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben worden 14.
    1. Vorbereitung einer 1,5-ml-Röhrchen, enthaltend ~ 1 &mgr; g DNA und 250 &mgr; l von Minimal Essential Medium (MEM) und einem zweiten 1,5 ml Röhrchen, enthaltend 4 &mgr; l des kationischen Lipid-Reagens und 250 ulMEM.
    2. Inkubieren der Lösung für 5 min.
    3. Kombinieren der beiden Lösungen und Inkubieren der resultierenden Mischung für weitere 30 min.
    4. Während der Inkubation, bereiten ein Gericht mit mehreren ml Kulturmedium erwärmt auf 37 ° C
    5. Sanft übertragen Deckgläschen enthält Neuronen auf die Schale mit warmem Medium und fügen Sie die Transfektion Mischung.
    6. Kippen Sie die Schale vorsichtig und dann legen Sie sie in einem Brutschrank bei 37 ° C für 90 min.
    7. Zurück Neuronen, um ihre "Heimatgericht" und warten ~ 12-18 Stunden.
  4. Fix Zellen für 45 min in 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) auf 37 ° C
    Hinweis: PALM-Experimente ist es wichtig, gute Erhaltung der Ultrastruktur zu erreichen, und Standard-Formaldehyd-Fixierung Protokolle für Immunfluoreszenzfärbung verwendet in der Regel nicht ausreichend 15. Ein wichtiger Grund für die schlechte Strukturerhaltung ist nicht ausreichend fixation, weil Formaldehydfixierung beinhaltet Adduktbildung und Proteinvernetzung, und das letztere Verfahren ist ziemlich langsam 16. Ein 45 min Fixierung hilft, dieses Problem ohne nachweisbare overfixation induzierten Fluoreszenzverlust zu mindern.
  5. Wash Deckgläser ~ 10x mit gefiltertem PBS.
    Anmerkung: Dies reduziert fluoreszierende Verunreinigungen. Bild Proben relativ schnell nach der Fixierung. In den Zwischen, speichern Zellen bei 4 ° C in PBS gefiltert in einem lichtdichten Behälter.
  6. Berg Deckgläschen enthält Neuronen in einer Kammer in PBS gefiltert.
    Hinweis: Die Probe ist in einem wässrigen Medium, wie PBS, mit einem Brechungsindex niedriger als der von Glas angebracht werden, um totale interne Reflexion (TIRF)-basierten Beleuchtungs implementieren. TIRF-basierte Beleuchtung ist sehr nützlich, da nur Deckglas-proximalen Fluorophore sind aufgeregt, und es gibt eine große verbundenen Rückgang der Hintergrundfluoreszenz 17.

2. Image Acquisition

  1. Schalten Sie die Super-Resolution-Imaging-System.
    1. Einschalten des Bogenlampe.
    2. Klappen Sie den "System / pc" und "Komponente" Schalter (an der Stromfernschalter) auf "on".
    3. Schalten Sie den Computer (nach dem Mikroskopsteuerung Tablette / Dockingstation kommt auf).
      Hinweis: Die Docking-Station kann verwendet werden, zu steuern und zu überwachen viele Attribute der Optik und Lichtpfad, insbesondere Wahl der objektiven und Fokus werden.
    4. Doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, und wählen Sie die Option "Start-System" in der Login-Dialog.
  2. Untersuchen Sie die Probe.
    1. Öffnen Sie die vordere und Top-Access-Panels auf dem Laserschutzgehäuse.
    2. Neigen Sie den Durchlicht Arm auf die Bühne und Ziele zugreifen.
    3. Setzen Öl auf der alpha Plan-Apochromat 100X numerische Apertur / NA = 1,46 (TIRF) Ziel.
      Hinweis: Ein 63X High-NA Ziel kann anstelle des 100X verwendet werden.
    4. Montieren Sie die Probe auf der Bühne, und heben the Ziel in Richtung auf die Probe.
    5. Überwachen Sie die Objektivposition mit der XYZ-Funktion der Dockingstation. Stoppen Sie, wenn die Linse im Baseballstadion von Fokus (zB z ~ 2,50 mm).
    6. Komplett schließen Sie die Abdeckungen.
      Hinweis: Um die Lasersicherheit zu engagieren.
    7. Feinabstimmung der Fokus mit den Okularen und Schaltflächen in der Registerkarte finden.
      Hinweis: Die lokalisieren Registerkarte bietet Zugriff auf Tasten, die Bogenlampe-basierte Beleuchtung produzieren und ermöglicht eine direkte Beobachtung der Probe mit den Okularen. Ebenso bietet die Registerkarte Akquisition Zugang zu Tools, die laserbasierte Beleuchtung erzeugen und erleichtert die Aufnahme von Bildern von der Kamera.
      1. Gehen Sie zur Registerkarte zu finden, wählen Sie "Trans Am".
      2. Klicken Sie auf das Augensymbol Expansion.
        Hinweis: Dies bringt eine schematische Darstellung des Lichtweges. Attribute des Lichtweges kann durch Linksklick entsprechenden Symbole im Schaltplan oder über den Touchscreen auf der Dockingstation geändert werden. Zum Beispiel kann ein Filterfür die Betrachtung von Emissions Dendra2 geeignet sind, können mit Hilfe der Reflektorrevolver Symbol gewählt werden.
      3. Schauen Sie in die Okulare, und bringen die Zellen in den Fokus mit der Docking-Station als Leitfaden.
        Hinweis: Die Probe wird sehr dünn mit fluoreszierenden Zellen besiedelt, weil Neuronen im Hippocampus sind schwer zu transfizieren, und es kann somit ein wenig schwierig sein, mit Fokus reflektiert Beleuchtung. Wenn dies der Fall ist, benutzt der Durchlichtbeleuchtung und die z Lesen der Andockstation als Führung.
      4. Schalten Sie das Licht "Aus" nach der Fokussierung.
  3. Identifizieren Sie eine Zelle, die ziemlich hell ist, zeigt punktförmige Fluoreszenz und hat eine klassische Morphologie, die indikativ für eine gute Gesundheit ist.
    1. Wählen Sie reflektiert Licht und die entsprechenden Filter für die Anzeige grüne Emission Dendra2.
    2. Scannen Sie das Deckglas für Zellen, die Dendra2 Chimären mit geringer Intensität Anregungslicht.
  4. Wechseln Sie auf die ACQuisition Registerkarte.
    1. Mit der "Experiment-Manager", um eine PALM Erwerb Konfiguration, die richtig konzipiert wird oder leicht modifiziert zu laden.
      Hinweis: Wenn kein solches Experiment besteht, die Gestaltung eines experimentellen Startkonfiguration mit den folgenden Einstellungen als Leitfaden: Laserleistung Schieber: 405 nm (~ 0,01% für eine 50-mW-Laser); 488 nm (~ 3% für eine 100-mW-Laser); 561 nm (~ 40% für eine 100-mW-Laser); Belichtungszeit: ~ 50 msec; Camera gain: ~ 200; Mehrdimensionale Erfassung: Zeitreihen (= 30.000 Zyklen, Intervall = 0); Tracks: 488 nm mit epi-Beleuchtung, und 561 nm mit TIRF-basierte Beleuchtung (siehe Schritt 2.5.1); Ziel: 100X (NA = 1,46); TIRF-Winkel-Schieberegler: Einfallswinkel ~ 67-72 °; Pixelgröße: 100 nm; Sehfeld: TIRF (die alternative Wahlmöglichkeiten ergeben höhere Laserintensitäten und sind für Fluorophore, die schwieriger zu bleichen verwendet werden).
    2. Klicken Sie "Ja", wenn ein Pop-up-Menü mit einer Abfrage über die Umstellung auf Laser.
  5. Bringen Sie die Bildder Zelle in den Fokus an der Kameraebene.
    1. Wählen Sie die 488-nm-Laser-Auflicht-Strecke.
      Hinweis: Tracks sind Strahlkonfigurationen während der Bildgebung verwendet. Hier werden Track-Namen von der Anregungswellenlänge, die die Emission, die an die Kamera übergeben wird, produziert bestimmt. Zum Beispiel verwendet die 561 nm sowohl die Spur 405 und 561 nm Laserlinien, aber der Filterwürfel passiert nur Emission photokonvertiertem Dendra2 von 561 nm-Licht auf die Kamera angeregt.
    2. Stellen Sie das Bild von der Zelle auf der Kamera mit dem "kontinuierlich" Nahme-Taste.
  6. Sammeln Sie eine herkömmliche Bildweitfeld.
    1. Mit der Schaltfläche "Snap".
    2. Speichern Sie das Bild, indem Sie auf das Menü "Datei" und wählen Sie "Speichern / Speichern unter."
  7. Richten Sie die TIRF-basierte Beleuchtung.
    1. Wählen Sie die Spur 488 und wechseln Sie mit der EPI / TIRF Schaltfläche "TIRF".
    2. Wählen Sie "kontinuierlich" Akquisition.
    3. Stellen ter TIRF-basierte Beleuchtungsregler.
      Hinweis: TIRF wird erreicht, wenn es eine plötzliche Verdunkelung der Hintergrund und die Probe in einer Ebene 18 fokussiert werden. Wenn neue Funktionen werden durch eine Fokussierung bis in die Probe hervorgeht, ist der Einfallswinkel zu niedrig, weil in TIRF gibt es nur eine Ebene des Fokus.
    4. Überprüfen Sie die TIRF-Winkel mit der 561 Track mit dem 405-nm-Laser "off".
    5. Schalten Sie die 405-nm-Laser zurück "on", bevor sie eine PALM Experiment.
  8. PALM sammeln Daten.
    1. Hit "Start-Experiment."
      Hinweis: Wenn gewünscht, öffnen Sie die Registerkarte "Online-Verarbeitungsoptionen" und aktivieren Sie "Online-Verarbeitung PALM" und "Fit Gauss2D" (vor Beginn des Experiments), das rekonstruierte Bild PALM während Rohdatenerhebung überwachen. Dadurch wird die Bewertung der Qualität der Daten und somit der Wert der Fortsetzung der relativ zeitaufwendige Datenerfassungsprozess zu erleichtern.
    2. VisuellPhoto überwachen.
    3. Erhöhen Sie die Intensität der 405 nm (photoconverting)-Laser, wenn Dendra2 Photo abnimmt (in der Regel nach dem Erwerb von ~ 10.000 RAW-Bilder).
    4. Weiter, wenn das Experiment Photo steigt. Andernfalls stoppen Sie den Versuch (ohne Datenverlust) durch das Drücken der "Stopp"-Taste aktuellen Schritt.
    5. Speichern Sie die Bilder, wenn die Datenerhebung ist (nach ~ 15 min) abgeschlossen.

3. Bildverarbeitung, Display und Analyse

  1. In Abwesenheit von Online-Verarbeitung, Prozess-RAW-Bilder, die auf der Festplatte gespeichert wurden.
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte Verarbeitung, öffnen Sie die Registerkarte Verfahren, und wählen Sie "PALM".
    2. Wählen Sie "PALM" wieder aus den vier Unteroptionen.
    3. Gehen Sie auf die Datei-Menü, öffnen und die Datei von Interesse ist, und drücken Sie "wählen."
    4. Hit "anzuwenden."
      Hinweis: Damit werden Spitzen / Fluorophor Feststellung und Lokalisierung mit Spitzenmäßig opti initiierenons. Wenn nötig, Spitzen können auch über die Registerkarte "PAL-Group" zusammengefasst werden. Gruppierung weist Spitzen, die in mehreren aufeinanderfolgenden Frames scheinen einem einzigen Molekül, wenn die Spitzen Koordinaten ausreichend ähnlich sind. Darüber hinaus können die Daten für die Probendrift modellbasierte Option der Software Ausrichtungsdrift korrigiert werden.
  2. Filtern Sie schlecht lokalisiert und schlecht abgetastet Komponenten in den Spitzen lokalisierten Daten.
    1. Entsorgen Fluorophore mit Lokalisierung Genauigkeiten, σ,> 35 nm mit dem "PAL-Filter"-Tool.
    2. Verwerfen Fluorophoren in Gebiete, in denen der mittlere Abstand zwischen den Spitzen, d, ist zu groß, um Vesikel mit einem Durchmesser, D. beheben
      1. Entpacken Sie die mittlere Lokalisierungsgenauigkeit, σ, aus der Lokalisierungsgenauigkeit Histogramm.
      2. Berechnen Sie einen maximal zulässigen Wert für d basierend auf σ, und der Shannon-Nyquist criteron 19, wie in der Resolution Näherung 20 R verkörpert = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2.
      3. Stellen Sie die Schwelle in der "Entfernen PALM Ausreißer" Werkzeugspitzen von weniger als &pgr; D 2 / (4d 2) umgeben löschen Nachbarn innerhalb eines Kreises mit dem Radius D / 2.
    3. Die verarbeitete PALM Konvertieren von Daten in ein Bild mit dem PALM "PAL-Rendering"-Werkzeug; siehe Abbildung 1.
    4. Quantifizieren Größen und Trennungen, indem Sie die Funktion "Profil".
      1. Überprüfen Sie die zugehörigen Leitungs und Tabellenoptionen, und ziehen Sie eine Linie entlang der gewünschten Richtung im Bild.
      2. Quantifizieren Durchmessern durch die Bestimmung volle Breite bei halber maximaler Intensität.
      3. Quantifizieren Trennungen durch die Bestimmung Spitze-zu-Spitze-Abstände der Intensitätsprofile.

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Ergebnisse

Figur 1 zeigt ein Endprodukt Fassung und-verarbeitung. In diesem Bild PALM sind seitliche Koordinaten lokalisiert Fluorophore mit den Schwerpunkt-Anzeigemodus dargestellt, und der Super-Resolution-Bild der zugehörigen DCV wird mit dem Gauß-Display-Modus angezeigt.

2A zeigt analog Weitfeld und PALM Bilder der Soma und proximalen Prozesse eines 8 Tage in vitro Hippocampus-Neuronen exprimieren tPA-Dendra2. Wichtige Merkmale der Bilder sind die (1)<...

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Diskussion

PALM und verwandten Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken haben vor kurzem entstanden als eine wertvolle Ergänzung zum besser etablierten Formen der optischen Mikroskopie und Elektronenmikroskopie (EM) 22-24. Positive Attribute PALM sind relativ einfache Probenvorbereitung und minimale Proben Störung. Grundsätzlich PALM auch verwendet werden, um lebende Zellen zu untersuchen. Wahrscheinlich der Haupt negatives Attribut von PALM ist zeitaufwendig Datenerfassung, die erheblich behindert Studien sch...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt 2 GM061539 R15-02 (BAS), 2 NS40425 R15-03 (zu JEL), MH 66179 (Dr. Gary Banker der Oregon Health & Science University / OHSU) und P30 NS061800 (Dr. Sue Aicher von OHSU). Wir danken Barbara Smoody für umfangreiche Unterstützung mit der Kultur des Hippocampus-Neuronen und Drs. Brian Long und James Abney für eine kritische Durchsicht des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zeiss PALMCarl Zeiss, Inc.Elyra PS.1mit Zeiss Efficient Navigation (ZEN) Software und Fluoreszenzfilter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzLife Technologies11668-019
Minimum Essential MediumLife Technologies11095-080
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies10010049
ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences19208
SaccharoseSigma-AldrichS-8501
Wachstumsglas Deckgläser 18 mm 1,5DFisher ScientificNC0059095

Referenzen

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