Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Summary

Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO _2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.

Abstract

Lipid-Doppelschichtmembranen zu bilden, die Plasmamembranen der Zellen und definieren die Grenzen der subzellulären Organellen. In der Natur werden diese Membranen sind heterogene Gemische von vielen Arten von Lipiden, enthalten membrangebundene Proteine ​​und sind dekoriert mit Kohlenhydraten. In einigen Experimenten, ist es wünschenswert, die biophysikalischen oder biochemischen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht von denjenigen der natürlichen Membran entkoppeln. Solche Fälle erfordern die Verwendung von Modellsystemen, wie Riesen-Vesikel, Liposomen oder unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs). Arrays von SLBs sind für Sensoranwendungen und imitiert die Zell-Zell-Interaktionen besonders attraktiv. Hier beschreiben wir ein neues Verfahren zur Bildung SLB-Arrays. Submicron-Durchmesser SiO _2-Kugeln werden zunächst mit Lipid-Doppelschichten beschichtet, um sphärische SLBs (SSLBs) zu bilden. Die Kügelchen werden dann in einer Anordnung von Mikro hergestellt Submikron-Durchmesser Vertiefungen abgeschieden. Die Herstellung Technik verwendet eine "Rakel", um die Substratoberfläche zu reinigen, während leaving hinter SSLBs, die in Mikrovertiefungen niedergelassen haben. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Modifikation des Mikrovertiefungs Substrat, noch eine besondere Zielliganden auf der SSLB. Mikrowells durch einzelne Perlen besetzt, weil der Durchmesser gut abgestimmt ist, nur größer als der Kugeldurchmesser sein. Typischerweise mehr 75% der Brunnen belegt sind, während der Rest leer bleiben. In Puffer SSLB Arrays anzuzeigen langfristige Stabilität von mehr als einer Woche. Mehrere Arten von SSLBs können in einem Array von seriellen Abscheidung gebracht werden, und die Anordnungen können zum Abtasten verwendet werden, was wir demonstrieren durch Charakterisierung der Wechselwirkung von Choleratoxin mit Gangliosid GM1. Wir zeigen auch, dass die Phospholipid-Vesikel ohne den Wulst Stützen und Biomembranen aus zellulären Quellen kann mit dem gleichen Verfahren angeordnet werden und Zell-spezifischen Membran-Lipide identifiziert werden.

Introduction

Lipid-Doppelschicht-Membranen sind wesentliche Strukturen in der Natur. Zellplasmamembranen und Organellen-Membranen sind aus Lipid-Doppelschichten, die eine Reihe von Molekülen, die für das Leben notwendig sind, zusammengesetzt zu integrieren. Viele lebenserhaltenden Prozesse auf der Oberfläche von Zellen vorkommen oder durch Moleküle mit Lipid-Doppelschichtmembranen assoziiert vermittelt. In der Tat sind viele Arzneimittel Ziel Prozesse oder Moleküle auf oder in Membranen ^1,2 gefunden. Es ist daher notwendig, analytisch untersuchen Prozesse wie chemische Reaktionen oder nichtkovalente Bindungsereignisse, die auf Membranoberflächen auftreten. Da die natürlichen Membranen kann schwierig sein, mit Sensoren zu isolieren und / oder eine Schnittstelle sein, viele Forscher beschäftigen vereinfachte Modellmembranen zur Durchführung von analytischen Studien. Eine Anzahl von Modellmembransysteme sind in der Literatur beschrieben, von Riesenvesikeln, die zehn bis hundert Mikrometer im Durchmesser, um Liposomen mit nanoskaligen Abmessungen ^3,4 sein kann. Alternverhältnismäßig planaren Lipid-Doppelschichten auf festen Trägern abgeschieden, dh unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs), können auf einer Reihe von verschiedenen Oberflächen hergestellt werden und wurden vielfach in der biophysikalischen, biochemischen und analytischen Anwendungen ⁵ verwendet. Koppeln SLBs mit elektrischen oder optischen Materialien ermöglicht Untersuchung von Membran Biochemie und Biophysik durch die Verwendung von verschiedenen analytischen Techniken. Fluoreszenzmikroskopie ^{6, 7} der Elektrochemie, optische Spektroskopie ^{8, 9} der Rastersondenmikroskopie, Oberflächen-Plasmon-Resonanz ¹⁰ und Massenspektrometrie ¹¹ wurden alle verwendet, um die Struktur und Eigenschaften von SLBs zu studieren.

SLB-Arrays bieten zusätzliche Flexibilität bei der Gestaltung von Sensoren für die Multiplex-Assays ^12,13. Andere Anwendungen verwenden SLB-Arrays, um die Verbindung, die zwischen Immunzellen ¹⁴ bildet imitieren. Aufbereitungsmethoden für SLB-Arrays wurden aus microFlu variiertidic nähert sich ¹⁵ bis diejenigen, die physikalischen Barrieren zwischen benachbarten SLB-Patches zu verwenden. Andere Gruppen haben ¹⁶ Druckverfahren verwendet, ^{17, 18} und photochemischen Strukturierung verschiedener Nanotechnik nähert sich ¹⁹ bis SLB-Arrays erstellen.

In diesem Papier und begleitende Video zeigen wir ein Verfahren zur Bildung SLB-Arrays durch Aufbringen von SLB-beschichtete SiO _2-Kugeln in geordnete Reihen von Vertiefungen ^20. Wir verweisen auf die SLB-beschichtete SiO _2-Kugeln als Kugel unterstützt Lipid-Doppelschichten (SSLBs). Diese Technik ist eine Erweiterung der früheren Arbeit, die Arrays von Phospholipid-Vesikeln und Biomembranen aus natürlichen Quellen, ^21, aus dem wir zeigen auch, beispielsweise Ergebnisse abgeleitet erstellt. Andere Methoden zum Ordnen Biomembran Partikel oder Vesikel auf Mustern der spezifischen Targeting-Liganden auf Oberflächen, die mit komplementären Liganden auf der Vesikel-Oberfläche enthalten assoziieren verlassen. Beispiele sind Biotin-Avidin Verein ^22,23 und DNA-Hybridisierungssysteme ^24. Unser Ansatz erfordert nur eine Mikrowell-Array ohne Targeting oder Erkennungsgruppen erforderlich. Die Größe SSLBs wird durch den Durchmesser der SiO _2-Trägern Wulst, die eine geringe Polydispersität aufweisen definiert. Durch die Abstimmung der Mikrowell-Durchmesser, nur größer als der Durchmesser SSLB, setzt sich nur eine einzige SSLB in jede Vertiefung. Ein Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Rakel entfernt dann von der Oberfläche SSLBs alle, die nicht in Mikro immobilisiert sind. Die Streifen und die daraus resultierende SSLB Arrays hoher Dichte (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ mit 3 um Mitte-zu-Mitte-Abstand und Sechskant Periodizität. Abscheiden von seriell SSLBs mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen ist es möglich, Mehrkomponenten-Arrays mit zufällig positionierten SSLBs erstellen. Um die Erfassungsfähigkeit SSLB Arrays zeigen, haben wir die Wechselwirkung von Choleratoxin (CTX) mit einem Gangliosid (GM1) in die SSLBs aufgenommen. Mitnatürlichen Membranpartikel, waren wir in der Lage, zellspezifische Lipide im Mehrkomponenten-Arrays enthalten Membranmaterial aus zwei unterschiedlichen Zelltypen zu detektieren.

Protocol

1. Microfabrication von Microwell-Array-Substrat

1. Beginnen mit einem 4-Zoll-Siliziumwafer mit 100 nm thermisch aufgewachsenes Oxid.
2. Spin SPR-955 0,7 Photoresist auf dem Wafer bei 4000 Upm für 30 Sekunden.
3. Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek.
4. Expose Photolack.
   1. Verwenden Sie eine Maske, die ein um Löcher in einem sechseckigen Feld mit einer 3 um Zeit, wo das Array umfasst eine 2 mm x 2 mm Bereich angeordnet schaffen wird.
   2. Aussetzen Wafer in einem i-Linien-Steppers mit einer Schrittweite von 6 mm und einer Belichtung von 200 mJ / cm ^2.
5. Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek.
6. Entwickeln Sie mit Hilfe eines Spin-Entwickler zu 2 Pfützen von CD-26 auf dem Wafer für eine Gesamtentwicklungszeit von 90 Sekunden zu hinterlegen.
7. Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N ₂ spülen.
8. Ätzen des Oxids in einer Blind Ionenätzer für 6 min mit 50 sccm Ar, 25 sccm CF _4, und 50 sccm von CHF ₃ floFlügel bei einem Druck von 75 mTorr.
9. Ätzen der Silizium in einem ICP-Deep-Trench-reaktiven Ionenätzer für 2 min mit 63 sccm C ₄ F _8, 27 sccm _SF &sub6;, 40 sccm Ar und 10 sccm O ₂ bei einem Druck von 14 mTorr fließt.
10. Spülen in Aceton, Methanol und Isopropanol zu entfernen, widerstehen.
11. In ein Bad aus H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ 1:1 für 10 min, um die Oberfläche zu reinigen.
12. Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N ₂ spülen.
13. Abzuscheiden 1.080 Å von Al ₂ O ₃ durch Atomlagenabscheidung bei 250 º C

2. Herstellung von Poly (dimethylsiloxan) Rakel

1. Wenn möglich, arbeiten in einem Reinraum. Ansonsten in der saubersten Umgebung möglich zu arbeiten.
2. Besorgen Sie sich eine Kunststoff-Petrischale (oder andere saubere Einweg-Container) mit ≥ 13 mm Seiten.
3. In diesem Gericht, gieße 5 g PDMS Härter, gefolgt von 50 g PDMS basE-Agent (oder irgendetwas mit einem Verhältnis von 1:10, die meist füllen wird die Petrischale). Mischen Sie gründlich mit einem Einweg-Kunststoff-Pipette oder Stange.
4. Blasen entfernen, indem man die Misch PDMS in einer Kammer mit einer Vakuumleitung, Anlegen von Vakuum bis Blasen mehr aus Gemisch (ca. 30 min).
5. Falls nicht bereits in der Petrischale gießen PDMS in Petrischalen, die Vermeidung Erzeugung von Luftblasen.
6. Heilung über Nacht auf einer Heizplatte bei> 50 ° C (höhere Wärme für weniger Zeit geht auch).
7. Mit neuen / sauberen Rasierklinge vorsichtig schneiden Sie ein rechteckiges Stück ca. 2,5 x 2,5 cm, halten Oberfläche so sauber wie möglich. Ziehen Sie mit einer sauberen Pinzette. Schneiden Sie eine Kante (bis 1,5 cm), indem Sie unten auf Rasierklinge in einer Bewegung, bis Oberkante so scharf wie möglich zu machen (dies wird der in der Rakelverfahren verwendet Kante sein).
8. Reinigen mit Aceton, Methanol, Isopropylalkohol und Reinstwasser DI-Wasser, und dann föhnen mit sauberem Stickstoffgas. Bewahren Sie in einem sauberen Petrischale.

3. Herstellung von Vesikeln

1. Sammeln Lipidstammlösungen von 25 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (PC) und 1 mg / ml 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N - (Lissamingrün Rhodamin B sulfonyl) Ammoniumsalz (Rho-DPPE) in Chloroform und eine 0,5 mg / ml Stammlösung von Monosialogangliosid GM1 in Chloroform / Methanol (2:1 v / v).
2. In einem kleinen Glasfläschchen stellen eine Mischung, die 97 Mol-% PC führt, 2 mol% GM1 und 1 Mol-% DPPE-Rho durch Zugabe von 18,9 &mgr; l von 25 mg / ml PC, 39,6 ul 0,5 mg / ml GM1 und 7,9 ul 1 mg / ml Rho-DPPE mit Glasspritzen.
3. Hinweis:. Das Zusatzmaterial für Nair et al ²⁵ eine ausgezeichnete anpassbare Excel-Tabelle für die Berechnung der Mengen von Lipiden erforderlich, um Vesikel beliebiger Zusammensetzung erstellen, enthält.
4. Zeigen Fläschchen im Vakuumtrockenschrank und das Lösemittel durch Verlassen der Ampulle unter Vakuum für 6 Stunden.
5. Stellen einer wässrigen Lösung von 0,1M NaCl. 0,5 ml der 0,1 M NaCl-Lösung in das Fläschchen, das das getrocknete Lipidfilm.
6. Lassen Sie die wässrigen Lipid-Mischung über Nacht ruhen.
7. Vortexen mischen, um eine Vesikelsuspension schaffen, dann beschallen für 20 min in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur.
8. Extrudieren der Vesikel Suspension durch eine Polycarbonatmembran mit 100 nm Porengröße. Übergeben Sie die Vesikelsuspension durch den Filter 17x.
9. Speichern der extrudierten Vesikel in einem Glasfläschchen bei 4 ° C

4. Bildung von sphärischen Unterstützte Lipiddoppelschichten

1. Sammeln Sie 700 nm Durchmesser SiO _2-Kugeln. Die Perlen werden in destilliertem Wasser mit einer Stammkonzentration von 1,4 x 10 ¹¹ Perlen / ml geliefert.
2. In einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen bereiten eine 1 ml Partikelsuspension mit einer Konzentration von 1,5 x ¹⁰ 10 Perlen / ml durch Zugabe von 107 ul Wulst Stammlösung auf 893 ul 0,1 M NaCl.
3. Mischen Sie den Suspension, um sicherzustellen, es ist gut, mixen.
4. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1700 g für 20 min dann den Überstand verwerfen. Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 0,1 M NaCl. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal gründlich waschen die Perlen.
5. Die SSLBs bilden, in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen werden 25 ul der SiO _{2-Partikelsuspension} zu 200 ul von 1 mg / ml Vesikel-Suspension. Vortex die Mischung und lassen Sie stehen für 1 h bei Raumtemperatur. In dieser Phase sollte die Konzentration SSLB 1,7 x 10 ⁹ SSLBs / ml.
6. Zentrifuge bei 1700 g für 20 min, um die SSLBs zu pelletieren. Das Pellet sollte rosa aufgrund der Ruptur der Vesikel mit Rho-DPPE auf den Perlen erscheinen.
7. Verwerfen des Überstandes und Resuspension in 225 &mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH = 7,4. Wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,7 zwei weitere Male, um alle unruptured Vesikel von der SSLB Suspension zu entfernen.

5. Versammlung SSLB Array

1. Cleave Wafer von Mikrowell-Arrays was in rechteckige Stücke mit 4-6 microwell Arrays pro Stück.
2. Vortex mischen SSLB Aufhängung, dann legen 10 ul SSLB Suspension auf jede Mikroarrays. Lest Rest für 1 Stunde, damit SSLBs, an die Oberfläche zu begleichen.
3. Waschen Sie vorsichtig die Mikrowell-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche, dann in einem PBS-Bad in einer flachen Schale vorbereitet einzutauchen.
4. Während untergetaucht ist, setzen die PDMS Rakel bündig auf dem Mikrowell-Array-Chip und ziehen Sie sie vorsichtig entlang der Oberfläche 5x bis SSLBs, die nicht in Mikro immobilisiert sind zu entfernen.
5. Fassen Sie die Mikrowell-Array-Chip mit einer Pinzette und schütteln in der PBS-Bad, um überschüssige SSLBs entfernen.
6. Schnelles Entfernen des Chips von der Rakel Bad und in ein frisches PBS-Bad bis zur weiteren Verwendung. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Chips, um die nassen SSLBs erhalten bleibt.

Hinweis: Die oben beschriebene Montageverfahren kann verwendet werden, um Arrays von natürlichen Membran-Teilchen zu erzeugen, wie Myelin Partikel aus Maushirn oder pho isoliertspholipid Vesikel ohne die SiO _2-Träger Perle. Diese Arbeit wird im Detail in Wittenberg et al. ²¹ beschrieben und repräsentative Ergebnisse sind unten dargestellt.

6. Cholera Toxin-Bindungsassay

1. Vorbereitung einer 2 mg / ml Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in PBS.
2. Es wird eine Lösung mit der gewünschten Konzentration von Alexa 488-konjugierten Choleratoxin B-Untereinheit in PBS mit 2 mg / ml BSA.
3. Entfernen Sie die SSLB-Array-Chip aus dem PBS-Bad und Docht meisten der PBS-Lösung entfernt mit einem Labor zu wischen. Lassen Sie gerade genug PBS auf dem Chip zu halten, der SSLB Array mit Feuchtigkeit versorgt.
4. Um nichtspezifische Bindung zu verhindern, 200 ul 2 mg / ml BSA Lösung des SSLB Array-Chip. Ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box.
5. Mit einer Mikropipette entfernen 200 ul-Lösung von der Spitze der SSLB Array-Chips.
6. In 200 ul von Choleratoxin Lösung des SSLB Array Chip und ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box.
7. Waschen Sie vorsichtig die SSLB-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche um ungebundenes Cholera-Toxin zu entfernen.
8. Wick überschüssige PBS mit einem Labor zu wischen. Vor Bildgebung Abdeckung Chip mit einem 24 mm x 40 mm Deckglas.
9. Bild-Arrays mit einem aufrechten Mikroskop mit Filtersätze für die Fluorophore von Interesse angemessen.
10. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität einzelner SSLBs in einem Array mit der automatisierten Partikelanalyse-Funktion von ImageJ Software.
11. Kompilieren mittleren Fluoreszenzintensitäten von einzelnen SSLBs in Histogramme, die die Intensitäten der SSLBs auf einem bestimmten Array gefunden zusammenzufassen.

Results

Wenn SiO _2-Kugeln werden mit einer Lösung von Vesikeln aus Phospholipiden, fluoreszierende Lipide und andere Lipide, wie Gangliosiden zusammen gemischt, reißen die Vesikel auf der SiO _{2-Oberflächen} SSLBs Wulst zu bilden, wie schematisch in Fig. 1a gezeigt. Nach dem Waschen der SSLBs wird ein Tropfen der Lösung SSLB auf einer Mikrowell-Array platziert, und die Perlen dürfen an der Oberfläche absetzen. (Fig. 1B1) Dies kann auch mit einer Suspension von Phospholipid-V...

Discussion

In dieser Arbeit wird gezeigt, dass monodisperse SiO _2-Kugeln mit unterstützten Lipiddoppelschichten überzogen werden können, ohne die Notwendigkeit von Zielliganden auf den Lipid-Doppelschichten und der Substratoberfläche in Mikrotiterplatten Arrays angeordnet werden, und die Anordnungen können zur Charakterisierung von Toxin-Lipid-Wechselwirkungen verwendet werden. Die Dissoziationskonstante wir CTx/GM1 Bindung berechnet vergleicht vorteilhaft, da die großen Unterschiede der Werte in der Literatur, mit eine...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Zoll-Siliziumwafer	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0,7 Fotolack	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 Entwickler	MicroChem	CD-26
i-line Stepper	Canon	2500 i3 Stepper
Vision 320 reaktiver Ionenätzer	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Reaktiver Ionenätzer in tiefen Gräben	Plasma Therm	SLR-770
Atomlagenabscheidungssystem	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 Poly(dimethylsiloxan) kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
Eiphosphatidylcholin	Avanti Polare Lipide	840051C
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Lissamin, Rhodamin, B-Sulfonyl), Ammoniumsalz	Avanti Polare Lipide	810158C
Monosialogangliosid GM1	Avanti Polare Lipide	860065P
Siliziumdioxidkügelchen	Bangs Laboratories	SS03N/4666	Auf der Verpackung auf dem Bead-Behälter ist angegeben, dass die Perlen einen Durchmesser von 900 nm haben. Nach Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie stellten wir jedoch fest, dass die Kügelchen einen Durchmesser von etwa 700 nm haben.
Choleratoxin B-Untereinheit, Alexa 488-Konjugat	Molekulare Sonden	C-34775
Anti-Oligodentrozyten-Antikörper IgM O4, NorthernLights 557 Konjugat	R& D Systems	NL1326R
FM1-43	Molekulare Sonden	T-3136
Eppendorf MiniSpin Zentrifuge	Fisher Scientific	05-401-09