Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir biochemische Assays, die zur Charakterisierung von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen verwendet werden können, um 1) ATP-abhängiges Nukleosomengleiten zu katalysieren, 2) mit Nukleosomensubstraten zu interagieren und 3) ATP auf nukleosomen- oder DNA-abhängige Weise zu hydrolysieren.

Zusammenfassung

Mitglieder der SNF2-Familie von ATPasen fungieren oft als Komponenten von Multi-Subunit-Chromatin-Remodeling-Komplexen, die die Nukleosomendynamik und DNA-Zugänglichkeit regulieren, indem sie den ATP-abhängigen Nukleosomenumbau katalysieren. Die biochemische Zerlegung der Beiträge einzelner Untereinheiten solcher Komplexe zur mehrstufigen ATP-abhängigen Chromatin-Umbaureaktion erfordert die Verwendung von Assays, die die Produktion von Reaktionsprodukten überwachen und die Bildung von Reaktionszwischenprodukten messen. Dieses JOVE-Protokoll beschreibt Assays, die es ermöglichen, die biochemischen Aktivitäten von Chromatin-Remodeling-Komplexen oder -Unterkomplexen zu messen, die verschiedene Kombinationen von Untereinheiten enthalten. Der Chromatin-Remodeling wird mit einem ATP-abhängigen Nukleosomen-Gleitassay gemessen, der die Bewegung eines Nukleosoms auf einem DNA-Molekül mit einer auf elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) basierenden Methode überwacht. Die Nukleosomenbindungsaktivität wird gemessen, indem die Bildung von komplexgebundenen Mononukleosomen im Umbau mit einer ähnlichen EMSA-basierten Methode überwacht wird, und die DNA- oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Aktivität wird mittels Dünnschichtchromatographie (DC) gemessen, um die Umwandlungsrate von ATP in ADP und Phosphat in Gegenwart von DNA oder Nukleosomen zu messen. Mit diesen Assays kann man die Funktionen von Untereinheiten eines Chromatin-Remodeling-Komplexes untersuchen, indem man die Aktivitäten des gesamten Komplexes mit denen vergleicht, denen eine oder mehrere Untereinheiten fehlen. Als Beispiel wird der humane INO80-Chromatin-Remodeling-Komplex verwendet; Die hier beschriebenen Methoden können jedoch auf die Untersuchung anderer Chromatin-Remodeling-Komplexe angepasst werden.

Einleitung

SNF2 Familie Chromatin-Remodeling Komplexe umfassen eine zentrale SNF2-ATPase-Untereinheit wie ^1,2. Einige SNF2 artigen ATPasen Funktion als einzelne Untereinheit Enzyme, andere Funktion als die katalytische Untereinheit von größeren Multi-Untereinheiten-Komplexen. Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch die jede der Untereinheiten von Chromatin-Remodeling-Komplexe beitragen, ihre Tätigkeit erfordert die Fähigkeit, biochemische Assays, die die Umbauprozess auszuführen sezieren.

ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling vom menschlichen INO80 Komplex und andere Chromatin-Remodeling-Enzyme können nach einem mehrstufigen Prozess, der mit der Bindung des Enzyms an Nukleosomen Umbau beginnt in Betracht gezogen werden, gefolgt von der Aktivierung der DNA-und / oder Nukleosom-abhängige ATPase, Translokation des Enzyms auf Umbau nukleosomalen DNA und eventuelle Neupositionierung der Nukleosomen ^1,2. Das Verständnis der molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess requires Dissektion der Umbau Reaktion in seine einzelnen Schritte des Wortes der Beiträge der einzelnen Untereinheiten des Chromatin-Remodeling-Komplexes, um jeden Schritt der Reaktion. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit zur Analyse Nukleosomen Umbau-und andere Aktivitäten mit definierten molekularen Substrate in vitro.

In einem früheren JOVE Protokoll beschrieben wir Verfahren verwendet werden, um INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe und Subkomplexe mit definierten Untereinheit ³ Kompositionen zu erzeugen. Hier präsentieren wir drei biochemischen Assays, die quantitative Analyse der Nukleosomen-Bindung, DNA und Nukleosomen-ATPase aktiviert, und Nukleosomen Umbau Aktivitäten mit solchen Komplexen assoziiert zu ermöglichen.

Protokoll

1. ATP-abhängigen Nucleosome Remodeling Assays

Zur Messung ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling-Aktivitäten, immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit ATP und einem mononucleosomal Substrat, welches eine einzelne Nukleosomen an einem Ende eines 216-bp-, ³² P-markierten DNA-Fragment enthält, angeordnet inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden dann einer Elektrophorese in nativen Polyacrylamid-Gelen unterzogen.

1. Die ³² P-markierten, "601"-DNA-Fragment zu erzeugen, zu verstärken, aus pGEM-3Z-601 ⁴ a 216 bp DNA-Fragment, enthaltend eine endständige 601 Nukleosomen Positionierungssequenz unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-und 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG als Vorwärts und Rückwärtsprimer.
   1. Einrichten einer 100 ul PCR-Reaktion, wie in Tabelle 1 beschrieben.
   2. Die PCR-Reaktionen durchzuführen in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 1 min bei 96 ° C, followed von 45 sec bei 94 ° C, 30 sec bei 57 ° C, 60 sec bei 72 ° C für 30 Zyklen; endend mit 7 min bei 72 ° C aufweist.
   3. Nach der PCR-Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die eingebauten Nukleotiden, indem die Reaktionsprodukte durch Nuclease-Free-Spin-Säulen zweimal.
   4. Versuch 5 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem 1,2% Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass die PCR-Reaktion erzeugt das gewünschte ~ 216 bp-DNA-Fragment.
   5. Verdünnen 5 ul des gereinigten PCR-Produkt 20-fach, und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer. Der Durchschnittsertrag ist ~ 40 ng / ul.
   6. Messung der Radioaktivität von 1 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem Szintillationszähler. Schätzen Sie die Markierungseffizienz durch die Berechnung der cpm / ng. Eine erfolgreiche Markierungsreaktion wird erwartet, ~ 15.000 cpm / ng von 601 DNA-Fragment erhalten.
2. HeLa-Zellen übertragen Nukleosomen auf der markierten DNA-601 über eine serielle Verdünnungsmethode ^5.
   1. Mix 2 pmol³² P-markierten 601-DNA-Fragment mit 6 ug von Hela Nukleosomen (hergestellt wie beschrieben ⁵⁾ in 50 ul eines Puffers, enthaltend 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 1 mM DTT und Inkubation bei 30 ° C für 30 min.
   2. Sequentiell verdünnt das Gemisch auf 0,8 M, 0,6 M und 0,4 M NaCl durch Verdünnen mit 12,5 ul, 20,8 ul, und 41,6 ul jeweils 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, und 1 mM DTT, mit einer 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C nach jeder Verdünnung.
   3. Weiteren Verdünnung der Mischung auf 0,2 M und 0,1 M NaCl durch Zugabe von 125 ul und 250 ul des gleichen Puffers, enthaltend 0,1% Nonidet P-40, 20% Glycerin und 200 ug / ml BSA, mit einem 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C zwischen den beiden letzten Verdünnungen. Speichern die mononucleosome Substrat bei 4 ° C für bis zu 3 Monate.
3. Führen ATP-abhängige Nukleosom Schiebe Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 10 ul. Das REAction Komponenten sind in Tabelle 2 aufgeführt. Da die optimale NaCl-Konzentration für INO80 Nukleosom Remodeling-Aktivität ~ 50 mM NaCl (unveröffentlichte Ergebnisse), passen die Gesamtkonzentration von NaCl in jedem Reaktions bis 50 mM, unter Berücksichtigung der Menge von NaCl in geschlossenen Zubereitungen von Nukleosomen und Enzym.
   1. Vor Beginn der Tests, um die Einrichtung, Guss nativen Polyacrylamid-Gele (18 x 16 cm). Um eine einzelne Gel mit 5% Acrylamid vorzubereiten (Acrylamid: Bisacrylamid 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris Borat, 1 mM EDTA), 0,01% Ammoniumpersulfat (APS) und 0,001% N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED), mischen Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Zutaten. Lassen Sie das Gel für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur polymerisieren.
   2. In der Zwischenzeit für jede Reaktion durchgeführt werden, verbinden sich in ein vorgekühltes 1,5 ml siliconisierten Mikrozentrifugenröhrchen ~ 20 nM INO80 oder INO80 Unterkomplex (hergestellt wie beschrieben ³⁾ mit einer Menge von EB100 Puffer ( Tabelle 4) ausreichend ist, um ein Volumen von 4,75 ul zu ergeben. Sofort wieder einfrieren alle verbleibenden INO80 haltigen Fraktionen in Pulver Trockeneis oder flüssigem Stickstoff.
   3. Einrichten einer Master-Cocktail mit dem Rest der Bestandteile, Skalieren um einen Faktor von "X" (X = Gesamtzahl der Reaktionen +3). Die Menge jedes Bestandteils für eine 10 ul-Reaktion benötigt wird, aufgelistet in Tabelle 5; das Rezept sollte entsprechend der Anzahl von Reaktionen durchgeführt werden skaliert werden. Gut mischen, indem Sie den Schlauch oder durch Auf-und Abpipettieren mit einer Pipetman und drehen Sie das Rohr für ein paar Sekunden in einer Tischmikrozentrifuge.
   4. Verzichten 5,25 ul des Master-Cocktail zu jedem der Reaktionsgefäße in Schritt 1.3.2. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Starten Sie die Reaktionen, die durch ein auf 30 ° C Wärmeblock oder Wasserbad Übertragung Reaktionsröhrchen und Inkubation für 2 Stunden.
   5. Unterdessen bereiten die "Beseitigung Mix" Cocktail enthält Konkurrenz-DNAund Nukleosomen, Skalieren um einen Faktor von X (X = Gesamtzahl der Reaktionen + 4). Die Menge jeder Zutat benötigt, um 1,5 ul Entfernen Mischung für einen einzigen Reaktion vorzubereiten ist in Tabelle 6; das Rezept sollte abhängig von der Anzahl von Assays durchgeführt werden skaliert werden.
   6. Beenden Reaktionen durch Zugabe von 1,5 ul der Mischung zu entfernen. Gut mischen, Spin-down, und Inkubation bei 30 ° C für weitere 30 min.
   7. Inzwischen Vorlauf die native Polyacrylamid-Gel in einer vertikalen Elektrophorese-Einheit bei 100 V für 30 min bei 4 ° C mit 0,5 x TBE als Laufpuffer mit einem magnetischen Rührstab in der unteren Kammer zu konstanten Pufferkreislauf aufrecht zu erhalten.
   8. , Um die Probe zu laden, fügen 2,5 ul Ladefarbstoff enthält 3x TBE, 30% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol FF. Gut mischen, kurz drehen die Proben, und laden Sie auf das Gel mit Lade Tipps.
   9. Die Elektrophorese bei 200 V für 4,5 h bei 4 ° C mit Puffer Zirkulation.
   10. Um das Signal zu erfassen, zu übertragen, um das Gel zu einem Stapel aus zwei Blättern Filterpapier. Wickeln Sie das Filterpapier mit dem Gel auf mit klaren Plastikverpackung, und dann setzen Sie es zu einem Speicherleuchtschirm bei 4 ° C für die gewünschte Zeit.
   11. Scannen Sie den Bildschirm mit einem Isotop Imaging-Scanner-System und mit einer geeigneten Software die Daten analysieren.

2. Mononucleosome Bindungstests

Um die Bindungsaffinität eines gegebenen INO80 komplex Mononukleosomen Assay, führen einem elektrophoretischen Mobility Shift Assay (EMSA) unter Verwendung der in Schritt 1.2 generiert mononucleosomal Substrat.

1. Bis die Reaktion eingestellt Mischungen für Bindungsassays für Nukleosomen Umbau Assays beschrieben, aber lassen Sie die ATP und Entfernen Mix aus den Reaktionen; Inkubieren bei 30 ° C für 30 min.
2. Fügen 2,5 ul Beladungsfarbstoff zu jeder Reaktionsmischung und gelten für eine native Polyacrylamidgel, enthaltend 3,5% Acrylamid (Acrylamid: Bis 37,5: 1), 1% Glycerin, 0,5 × TBE, 0,01% APS und 0,001% TEMED.
3. Mit 0.5x TBE als Laufpuffer, führen Sie das Gel bei 200 V für 2,5 h bei 4 ° C mit Pufferkreislauf und setzen auf ein Speicherleuchtschirm.

3. DNA und Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays

Führen ATPase-Assays in 5 ul Reaktionsmischungen, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl _2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% Glycerin, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi [α- ³² P] ATP (3000 Ci / mmol). Für jedes komplexe INO80 oder die Menge des Komplexes zu prüfen INO80 bis drei Parallelreaktionen, eine mit EB100 Puffer, um DNA-oder Nukleosomen-unabhängige ATPase, ein Set bestehend messen geschlossen zirkuläre Plasmid-DNA (5000 bp, ~ 30 nM) zu messen, werden DNA- abhängige ATPase und eine mit Hela Oligonukleosomen (~ 185 nm), um Nukleosomen-abhängige ATPase messen. Richten Sie alle Reaktionen auf Eis.

1. Für jede Reaktion kombinieren 10-50 nm der immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit einer Menge von EB100 Puffer ausreichend ist, um ein Volumen von 2,2 ul in vorgekühlte 1,5 ml geschmiert Mikrozentrifugenröhrchen geben. Sofort wieder einfrieren keine INO80 haltigen Fraktionen in Pulver Trockeneis oder flüssigem Stickstoff.
2. Richten Sie ein Master-Cocktail. Die Menge jedes Bestandteils für eine Reaktion benötigt, ist in Tabelle 7 aufgeführt. Maßstab das Rezept durch Skalieren um einen Faktor von 3 (X + 2) + 1, wobei X = Anzahl der INO80 Zubereitungen getestet werden.
3. Zur Vorbereitung 'Unter Cocktails ", die Puffer nur, DNA oder Nukleosomen, verzichten 2,5 (X + 2) ul des Master-Cocktail in drei getrennten Röhren. Fügen 0,3 (X + 2) ul entweder EB100, geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA (1,5 ug / ul) oder Hela Oligonukleosomen (1,5 ug / ul) und gut mischen.
4. Verzichten 2,8 ul der entsprechenden Sub-Cocktail auf die enzymhaltige Reaktionsgefäße bis in str gesetztEP 3.1. Sanft auf und ab pipettieren zu mischen; Einführung zu vermeiden Blasen.
5. Reaktionen beginnen, übertragen Sie die Reaktionsgefäße auf 30 ° C Wärmeblock.
6. Nach 5, 15, 30, und 60 min Inkubation, vor Ort 0,5 ul jeder Reaktionsgemisch auf ein Polyethylenimin Cellulose Dünnschicht-Chromatographie (DC) Platte (20 x 10 cm) in einer geraden Linie, die mindestens 1,5 cm von der Unterkante . Reaktionsgefäße sofort an die 30 ° C Wärmeblock so mehrere Zeitpunkte können aus einem einzigen Rohr genommen werden zurückkehren. Nach dem Spotten, trocknen die DC-Platten mit einem Föhn.
7. Übertragen Sie die DC-Platten auf einer Glaskammer, die genug 0,375 M Kaliumphosphat (pH 3,5), damit die unteren 0,5 cm von der DC-Platte in die Lösung eingetaucht werden.
8. Decken Sie die Kammer und zu entwickeln, bis die vor der Flüssigphase an die Spitze der DC-Platten erreicht. Sofort trocknen die Platten gründlich mit einem Föhn.
9. Setzen die getrockneten DC-Platten zu einem Storage Phosphor Screen bei RT.Scannen Sie den Bildschirm mit einem Isotop Imaging-Scanner-System und bestimmen die Menge an radioaktivem ATP und ADP-Substrat Produkt.
10. Um die Menge des ATP hydrolysiert berechnen, multiplizieren Sie die ATP% durch die Menge des vorhandenen ATP in der Startreaktionsmischung hydrolysiert nach der folgenden Formel: pmol ATP hydrolysiert = 10 pmol ATP in Ausgangsreaktions x [ADP / (ATP + ADP)]

Ergebnisse

Die Zahlen zeigen repräsentative Ergebnisse von biochemischen Tests zur INO80 Aktivitäten charakterisieren, einschließlich Nukleosomen Schiebe (Abbildung 1) und Bindung (Abbildung 2)-Assays und DNA-oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays (Abbildung 3).

Die in Figur 1 gezeigte Experiment vergleicht die Fähigkeit von intakten Komplexen durch INO80 FLAG-Ies2 oder FLAG-INO80E gereinigt und INO80 Subkomplexe durch entweder FLAG-...

Diskussion

Um sicherzustellen, dass Nukleosomen Umbau-und ATPase-Aktivitäten, die wir in Tests zu beobachten, hängt von der katalytischen Aktivität des INO80 Komplexe und nicht auf kontaminierende Umbau-und / oder ATPase-Enzyme, die wir routinemßig Assay Nukleosom Umbau-und ATPase-Aktivität der katalytisch inaktiven Versionen INO80 Komplexe, gereinigt parallel mit Wildtyp-INO80 mit dem gleichen Verfahren. Eine negative Kontrollreaktion fehlt ATP sollte auch bei der Untersuchung von Nukleosomen Umbau Aktivität, um das Vorhandensein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Protease-Inhibitor-Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR-Reaktionspuffer	Roche Angewandte Wissenschaften
Roche Taq DNA-Polymerase	Roche Angewandte Wissenschaft
NucAway Nuklease-freie Spin-Säulen	Ambion	Kat. # AM10070
hochreines ATP	USB/Affymetrix	77241 25 μm
Rinderserumalbumin	Sigma	A9418
40% Acrylamid/Bis 37,5:1	Amresco	0254-500ML
Beschallte Lachsspermien-DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10 % Ammoniumpersulfat (APS)	Thermo Scientific	17874
Benzonase	Novagen	Kat. Nr. 70664
dCTP, [α-32P]- 6.000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR-Thermocycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertikale Elektrophoreseeinheit	Hoefer	SE600X-15-1,5
geschmierte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Costar	3207
Speicher-Phosphor-Sieb	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM Filterpapier	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant Software	GE Healthcare	ver2003.02
DC-Glasplatten, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfermembran 7 x 8,4	Millipore	IPFL07810
Allzweck-Vermessungsmessgerät mit Endfenster oder Pfannkuchensonde GM (Geiger-Müller)	Biodex	Modell 14C