Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Summary

Hier präsentieren wir eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der intrinsischen Adhäsionseigenschaften von mutmaßlichen Zelladhäsionsmolekülen. Die sezernierte, mit Epitopen markierte Ektodomäne eines Zelladhäsionsmoleküls wird aus dem Kulturmedium auf kleinen, einheitlich funktionalisierten Kügelchen eingefangen. Diese Kügelchen können dann sofort in einfachen Bead-Aggregations-Assays verwendet werden.

Abstract

Zell-Zell-Adhäsion ist von grundlegender Bedeutung für Vielzeller und wird durch eine Vielfalt von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Jedoch sind die adhäsiven Wechselwirkungen vieler dieser Proteine ​​schlecht verstanden. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der Hafteigenschaften von mutmaßlichen homophile Zell-Adhäsionsmoleküle. Kultivierten HEK293-Zellen mit Plasmid-DNA, kodierend eine sekretierte, Epitop-tagged Ektodomäne eines Zelloberflächenprotein transfiziert. Unter Verwendung von für die Epitop-Markierung funktionalisierten Kügelchen wird das lösliche, sekretierte Fusionsprotein aus dem Kulturmedium festgehalten. Die beschichteten Perlen können dann direkt in Perlenaggregationstests oder fluoreszierende Perle Sortier Assays für homophile Adhäsion zu prüfen. Falls gewünscht, kann die Mutagenese dann verwendet, um die spezifische Aminosäuren oder Domänen für die Haftung erforderlichen aufzuklären. Dieser Test erfordert nur geringe Mengen an exprimiertem Protein, nicht die Herstellung von stabilen Zelllinien erfordern, und kann acco werdeninnerhalb von 4 Tagen mplished.

Introduction

Zell-Zell-Adhäsion ist wesentlich für die Entwicklung und die Integrität von mehrzelligen Organismen und durch eine Vielfalt von Zelloberflächenmolekülen vermittelt. Viele dieser Adhäsionsmoleküle wurden identifiziert und charakterisiert, obwohl viele noch zu entdecken sind. Verschiedene Methoden werden verwendet, um die Eigenschaften von Zelladhäsionsmolekülen (CAMs), einschließlich Zellsortierung Assays, Zellaggregationsassays ^1-8 und biophysikalische Methoden, wie die Rasterkraftmikroskopie und Oberflächenkraftspektroskopie ^9-12 untersuchen.

Die Komplexität auch in vitro-Systemen unter Verwendung von Zelllinien vereinfacht macht es schwierig, die Hafteigenschaften eines mutmaßlichen CAM bestimmen. Typischerweise wird ein Molekül als ein CAM, wenn die Zellaggregation induziert, wenn sie in einem nicht-klebenden Zelllinie transfiziert. Es ist jedoch klar, dass dies keine direkte Hinweise auf Haftungsaktivität. Beispielsweise erleichtert die Zelloberfläche Lieferung oder Stabilität einesCAM würde auch zu einer erhöhten Zellaggregation ^1,13 führen. Darüber hinaus kann eine wahre CAM nicht, Zellaggregation vermitteln, wenn die Zelllinie fehlt anderen Co-Faktoren für Zelloberflächen Lieferung oder Stabilisierung erforderlich.

Um diese erschwerenden Faktoren zu vermeiden, mehr direkte Assays eingesetzt werden, die auf der Idee basieren, dass adhäsive Wechselwirkungen sollte eine intrinsische biochemische Eigenschaft der extrazellulären Domäne sein. Während Perlen wurden zunächst zur Ng-CAM ² zu charakterisieren, haben diese Tests, um Cadherin-vermittelte Adhäsion ^12,14,15 untersuchen erweitert. Verwendung Fusion des C-Cadherin-Ektodomäne-Fc-Fusionen zeigten die Gumbiner Labor dass mehrere Cadherin Wiederholungen tragen zu Interaktionen ¹⁴ homo. Mit vergleichbaren Wulst Aggregationstests, E-Cadherin und N-Cadherin-Haft wurden ebenfalls gekennzeichnet ^12,15, als eine Reihe von Protocadherinen ^1,15-18 und Dscam Isoformen von Drosophila haben ^19. Hier beschreiben wir einen relativ einfachen und schnellen Test zur Charakterisierung der Klebstoff Aktivität sezerniert Epitop markierte Ektodomäne von mutmaßlichen homo Nocken (Abbildung 1). Wir haben diesen Test verwendet hauptsächlich die Mitglieder der Cadherin-Oberfamilie charakterisieren.

Protocol

1. Zellpräparation (Tag -2 bis 0)

1. Split HEK293-Zellen 1: 5 unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung und Inkubation in Wachstumsmedium bei 37 ° C mit 5% CO _2, bis 60 bis 80% konfluent (2 - 3 Tage). Für jede Bedingung Kulturzellen in 2 x 100-mm-Schalen.

2. Zell Transfektion (Tag 1)

1. Transfektion von HEK293-Zellen mit Plasmid-Codierung Fc-Fusion mit einem Transfektionsreagenz Lipofectamine wie. Alternative Methoden, die in vergleichbaren Transfektionseffizienzen führen, können ebenfalls verwendet werden.
2. Rück transfizierten Zellen für 24 Stunden Inkubator.

3. Zellvermehrung (Tag 2)

1. Vorheiz Growth Medium ohne fötales Rinderserum (-FBS) bis 37 ° C beträgt.
2. Spülen Geschirr 2x mit 10 ml Wachstumsmedien -FBS, und geben die Gerichte an die 37 ° C-Inkubator für 1 Stunde.
3. Spülen der Kulturen Geschirr noch einmal mit 10 ml Wachstumsmedien -FBS, für insgesamt 3 Waschungen.
4. IncuBeize die transfizierten HEK293-Zellen bei 37 ° C für weitere 48 h ohne FBS vor dem Sammeln Medien.

4. Bead Aggregation (Tag 4)

1. Medien von Kulturschalen sammeln, übertragen Sie Medien von jedem Paar von Gerichten zu 50 ml konischen Röhrchen und Spin bei 500 g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren.
2. Filtermedien 50 ml konischen Röhrchen in ein Zentrifugalfilter mit einer 30 ml Spritze und 0,45 um-Spritzenfilter.
3. Spin Zentrifugalfilter bei 4.000 × g und 4 ° C bis zum Volumen der konzentrierten Kulturmedium beträgt etwa 500 ul (etwa 15 min). Wiederholen, bis alle Kulturmedien wurde hinzugefügt und eingeengt.
4. Fügen 1,5 ul Protein G magnetischen Kügelchen auf 1 ml eiskaltem Bindungspuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe, auf ein Magnet und entfernen Puffer. Sofort die geballte Kulturmedien, um das Protein G magnetischen Beads hinzuzufügen.
5. Drehen Röhrchen bei 4 ° C für 2 Stunden.
6. PlAss Rohre auf einem Magneten und Medien zu entfernen. Waschen schnell Perlen zweimal mit eiskaltem 1 ml Binding Buffer, und dann wieder zu suspendieren Perlen in 300 ul Binding Buffer.
7. Split resuspendiert Perlen in 2 Röhren, 150 ul in jedes Rohr, und fügen Sie 1,5 ul 200 mM CaCl ₂ oder 200 mM EDTA für die "Calcium" und "kein Kalzium" Bedingungen auf.
8. Transfer 100 ul von jedem Zustand in einen Depression gut schieben und sammeln mikroskopischen Aufnahmen mit einem Durchlichtmikroskop (Abbildung 2). Sammeln Sie Bilder von 5 Sichtfelder für jedes Experiment an jedem gewünschten Zeitpunkt.

5. Datenanalyse

1. Mit ImageJ oder vergleichbare Bildanalyse-Software, öffnen Sie eine der fünf Bilddatensätze mit dem Import / Bildsequenz ... aus dem Pulldown-Menü Datei. Diese werden als Bildstapels geöffnet werden.
2. Im Dialogfeld Bild ... / Eigenschaften, ändern Sie die iMagier Einheiten auf Pixel und setzen Pixel Breite und Höhe bis 1,0 Pixel.
3. Konvertieren Sie die Bilder in dual mit dem Anpassen / Schwellenwert ...-Befehl in der Bild Pulldown-Menü. Stellen Sie den Schwellenwert auf Pixel, die Perlen oder Perlen Aggregate beitragen, umfassen, aber das auszuschließen Hintergrund und kleinen Partikeln. Gelten für alle Bilder im Stapel.
4. Im Dialogfeld Set Maße, überprüfen Sie die Umgebung und Stack Position Boxen.
5. Analyze Particles ... in der Analyse Pulldown-Menü. Dadurch wird eine Liste der identifizierten Partikel, einschließlich ihrer Größe (Fläche) und das Bild in der sie erkannt zu generieren.
6. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Experimente und Versuchsbedingung.

Results

Ein Beispiel ist in Abbildung 2, die Kalzium-abhängige Aggregation zeigt Wulst von der Ektodomäne von N-Cadherin-Fc (NcadEC-Fc) fusioniert dargestellt. In Abwesenheit von Calcium, Perlen weisen eine geringe oder keine Tendenz zu aggregieren, und es gibt keine Zunahme der Gesamtgröße mit der Zeit (1A, C). In Anwesenheit von Calcium, Perlen mit NcadEC-Fc-Show robust Aggregation beschichtet, mit Aggregatgröße über die Zeit (Abbildung 1B, C) ​​zu. Dieses Experiment wurde dr...

Discussion

Zelladhäsion ist ein wesentliches Merkmal der vielzelligen Leben und wird von einem breiten Spektrum von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Von diesen sind die detaillierten Klebeeigenschaften nur für einen relativ kleinen Anteil verstanden. Hier haben wir ein einfaches, schnelles Protokoll zur Untersuchung der homophile Haftfähigkeit von sekretierten Ektodomänen in einem geeigneten Epitop-Tag fusioniert beschrieben. Dieser Ansatz hat eine Reihe von wichtigen Vorteilen. Zuerst werden die stabilen Zelllinien nicht erfo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFc-N1 Plasmid	Addgene	Einzureichen
HEK293 Zellen	American Type Culture Collection	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
0,05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300054
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668030
Dynabeads – Protein G	Life Technologies	10003D
Rinderserumalbumin	Sigma	A3294
Objektträger	Elektronenmikroskopie Sciences	71878-06
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-10-Membran	Millipore	UFC901024
0,45 mm	Spritzenfilter Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Fidschi (ImageJ) Bildanalysesoftware	http://fiji.sc/Fiji<
Wachstumsmedien	DMEM + 10% FBS + Pen-Strep	Filter: Sterilisieren und lagern bei 4 °C.
Wachstumsmedien – FBS	DMEM + Pen-Strep Filter	sterilisieren und lagern bei 4 °C.
Bindungspuffer	50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA	Vortex bis zum Auflösen, auf Eis halten.