Ved hjelp av protein microarrays inneholder nesten hele S. cerevisiae proteom blir undersøkt for rask objektiv avhør av tusenvis av protein-protein interaksjoner i parallell. Denne metoden kan benyttes for protein-lite molekyl, posttranslasjonell modifikasjon, og andre assays i high-throughput.
Høy tetthet funksjonelle protein microarrays inneholder ~ 4200 rekombinante gjær proteiner blir undersøkt for kinase protein-protein interaksjoner ved bruk av en affinitetsrenset gjær kinase fusjonsprotein som inneholder en V5-epitop tag for avlesning. Renset kinase oppnås gjennom kultur av en gjærstamme som er optimalisert for høyt kopiproteinproduksjon huse et plasmid som inneholder en kinase-V5-fusjonskonstruksjon som under en GAL-induserbar promoter. Den gjær dyrkes i media restriktive med en nøytral karbonkilde i 6 timer, fulgt av induksjon med 2% galaktose. Deretter blir kulturen høstet og kinase ble renset ved hjelp av affinitets-standard kromatografiske teknikker for å oppnå et høyt renset protein kinase for anvendelse i analysen. Det rensede kinase fortynnes med kinasebuffer til et passende område for analysen og protein microarrays blokkeres forut for hybridisering med proteinet microarray. Etter hybridisering, blir arrays probet med monoklonale V5 Antibody for å identifisere proteiner som er bundet av den kinase-V5 protein. Til slutt blir de arrays skannet ved bruk av en standard microarray scanner, og data blir ekstrahert for nedstrøms informatics analyse 1,2 for å bestemme en høy tillit sett av protein interaksjoner nedstrøms for validering in vivo.
Behovet for å utføre globale analyser av protein biokjemi og bindende aktivitet in vivo har resultert i utviklingen av nye metoder for profilering protein-protein interaksjoner (PPI) og post-translasjonelle modifikasjoner av hele proteom 1,3-8. Protein mikromatriser er produsert som funksjonelle protein microarrays bruker helaftens funksjonelle proteiner 4-6,8,9 eller analytiske protein microarrays inneholder antistoffer 10,11. De er konstruert for å inneholde en høy tetthet av proteiner oppstilt på objektglass med en variasjon av overflatekjemi for å lette en rekke eksperimentelle betingelser som kreves for å gjennomføre omfattende biokjemiske analyser 12. Nitrocellulose og aldehyd overflatekjemi for kjemisk vedlegg gjennom lysin eller affinitet festemetoder som nikkel- chelated lysbilder for å feste His-tagget proteiner og glutation for tilhørighet vedlegg blant andre 13. </p>
Bruk av funksjonelle protein mikromatriser å påvise protein-protein interaksjoner krever tilgang til en høy kvalitet funksjonelt protein-bibliotek 14. S. cerevisiae er mottagelig for å produsere et slikt bibliotek gjennom sammenkobling av high-kopi affinitet merket protein konstruksjoner med høy gjennomstrømming kromatografisk renseteknikker. Det store flertallet av gjær genomet har blitt sekvensert og nesten hele proteom- kan uttrykkes fra en høy-kopiplasmid for rensing og biokjemiske analyser 12. Når proteiner er innhentet og kledd i 384-brønners format, de skrives ut på et objektglass slik at for rask parallell multi-parametrisk biokjemisk analyse og bioinformatiske avhør 8,14-16. Protein mikromatriser har vært brukt for enzymatiske analyser og interaksjoner med proteiner, lipider, små molekyler, og nukleinsyrer blant mange andre anvendelser. Tilgjengeligheten av proteiner på overflaten av proteometarrays gjøre dem mottagelig for forskjellige typer av analytisk påvisning inkludert, immun-affinitet, overflate-plasmonresonans, fluorescens og mange andre teknikker. Dessuten gir det mulighet for god kontroll av den eksperimentelle tilstand der det kan være vanskelig å gjøre in vivo.
Målet med denne protokollen er å demonstrere riktig bruk av funksjonelle protein microarrays å påvise protein-protein interaksjoner. Dette programmet gjør det mulig for høy gjennomstrømming parallelt biokjemisk analyse av proteinbinding aktiviteter ved hjelp av et høyt renset analytt (protein) av interesse. En C-terminal (karboksy-terminal) merket V5-fusjonsprotein agn av interesse produseres fra en høy-kopi-plasmid i en gjærstamme som er optimalisert for proteinrensing. C-terminal merking sikrer at full-lengde protein er blitt oversatt. Proteinet anvendt i denne studien er Tda1-V5-fusjonsprotein kinase, som renses ved hjelp av nikkel affinitet harpiks via en His6X tag. Den Tda1-V5 fusion bygt er renset gjennom serie eluering med et imidazol gradient for å eluere det meste sterkt anriket fraksjon for anvendelse i analysen.
Protokollen present ble opprinnelig utført ved hjelp av 85 unike gjær protein kinase-V5 fusjonsproteiner å sammenligne bindingsaktivitet over distinkte og beslektede familier av gjær proteinkinaser resulterer i identifisering av nye kinase interaksjons nettverk in vivo 1. Som en voksende proteomikk profilering teknologi, utvikling av høy gjennomstrømning (HTP) screening av proteom bruker protein microarrays stolt på peptid biblioteker og eukaryote og prokaryote modellorganismer 8,17;</sup…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
Dextrose | Sigma | D9434 | |
Raffinose | Sigma | R0514 | |
Galactose | Sigma | G0750 | |
Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
Centrifuge JA-10 rotor | |||
Centrifuge tubes (500 mL) | |||
Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
Triton X100 | Sigma | P4417 | |
DTT | Sigma | D9779 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
PMSF | Sigma | 93482 | |
Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
ATP | Sigma | A1852 | |
Shaking Incubator (30 °C) | |||
Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
Nutator | VWR/Fisher | ||
SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |