Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Ex-ovo Elektroporation Ansatz

Zusammenfassung

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Zusammenfassung

Die Kegelphotorezeptor-angereicherten Kulturen von embryonalen Hühnernetzhaut abgeleitet sind zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Forscher auf der ganzen Welt das Studium der Biologie der Netzhautneuronen, insbesondere Photorezeptoren. Die Anwendungen dieses Systems gehen über die Grundlagenforschung, da sie leicht zu Hochdurchsatztechnologien zur Wirkstoffentwicklung angepasst werden. Jedoch genetische Manipulation von retinalen Photorezeptoren in diesen Kulturen hat sich als sehr schwierig, sie eine erhebliche Einschränkung für die Nützlichkeit des Systems. Wir haben vor kurzem entwickelt und validiert eine ex ovo Plasmid Elektroporationstechnik die die Rate der Transfektion von Retinazellen in diesen Kulturen erhöht durch das Fünffache im Vergleich zu anderen gegenwärtig verfügbaren Protokolle ^1. Bei diesem Verfahren embryonalen Hühneraugen an Stufe 27 ausgeschält, die RPE wird entfernt, und das Netzhautbecher wird in einem Plasmid-haltigen Lösung gegeben und elektroporiert Verwendung einfach aufgebaut Kundenhergestellten Elektroden. Die Netzhaut werden dann dissoziiert und kultiviert Verwendung von Standardverfahren. Diese Technik kann durch die Verwendung von Plasmid-driven RNAi-Technologie zu Expressionsstudien sowie zu der Herunterregulierung der Genexpression verwendet werden, zum Beispiel, allgemein erzielen die Transgen-Expression in 25% der Photorezeptorpopulation. Das Videoformat der vorliegenden Veröffentlichung wird diese Technologie leicht zugänglich für Forscher auf dem Gebiet zu machen, so dass die Untersuchung von Gen-Funktion in der primären Netzhautkulturen. Wir haben auch detaillierte Erläuterungen der kritischen Schritte dieses Verfahrens für ein erfolgreiches Ergebnis und Reproduzierbarkeit.

Einleitung

Dissoziierten Zellkulturen von embryonalen Hühnernetzhaut wurden allgemein verwendet, um verschiedene Aspekte der Photorezeptor Zellbiologie, einschließlich deren Überleben ^2-9, Differenzierung ^10-12, Neuritenwachstum ¹³ und mehr zu studieren. Die Vorteile dieses Systems, in den 1980er Jahren von Ruben Adler und Mitarbeiter entwickelt und von seinem und anderen Gruppen ^14-20, perfektioniert liegen in den intrinsischen Eigenschaften des Kükens als Tiermodell ^21. Die Größe des Hühnerauge, auch bei embryonalen Stadien, bietet große Mengen an Material für Kulturen. Außerdem, wenn Kulturen mit embryonalen Tag (ED) dur....

Protokoll

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren wurden nach den von der Animal Care und Verwenden Ausschuss empfahl der Johns Hopkins University Richtlinien durchgeführt.

1. Ahead of Time: Herstellung von Instrumenten, Reagenzien und Geschirr

1. Herstellung der Eier: Inkubieren befruchteten White Leghorn Hühnereiern bei 37,5 ° C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit für 5 Tage in einem Brutkasten.
   HINWEIS: Ein Inkubator mit Schaukelkapazität kann hilfreich für die Standardisierung und die Synchronisierung der Embryonalentwicklung, aber Schaukel ist für den Ausgang dieses Protokoll unbedingt erforderlich.
2. Plasmidpräpara....

Ergebnisse

Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll für Plasmidtransfektion in entkernte Küken Netzhautbecher für nachfolgende dissoziierten Zellkultur. Transfektion durch Elektroporation unter Verwendung einfach individuelle Elektroden (- 2 Die Zahlen 1) Nutzen erzielt. Die in diesem Protokoll beschriebenen Parameter optimiert wurden Transfektionseffizienzen zwischen 20 und 27% (mit einem Durchschnitt von 22%) (Figur 3D) Bereich zu erhalten. Bemerken, dass bei den oben genannten Gründen werd.......

Diskussion

Der kritischste Schritt für den Erfolg dieses Protokolls ist die Auswahl des geeigneten Stadium der Embryonen. In früheren Veröffentlichungen wird ein Bereich von Embryonalstadien für diesen Kulturen gegeben, die typischerweise von den Tagen Inkubation oder embryonale Tage (ED) definiert sind; somit ist es in der Regel davon ausgegangen, dass die Verwendung von ED 5 bis ED 6 Embryonen zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Wir haben jedoch gefunden, dass auf der Bühne 27 (ED & sub5;), wird die Transfektionseffizienz .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparat	45-0052
Genetrode, L-förmig, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 Modell 512	Elektrode mit Goldspitze, die als Anode verwendet
wird Polyimidschlauch	Vention Medical	nach Maß	Innendurchmesser: 0,5 mm / Wandstärke: 0,15 - 0,2 mm. Wird zur Isolierung der Elektrode
mit Goldspitze verwendet2,5 mm quadratisches Box-Filament, 4,5 mm breit	Sutter Instrument Company	FB245B	Wird zur Herstellung von Kathodenelektroden
HBSS verwendet, kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot	Gibco - Life Technologies	14175-095
Moloney Pinzette	Roboz	RS-8254	Gezahnt; Leichte Kurve; 4,5"
Länge Dumont Pinzette 5/45	Roboz	RS-5058	Muster #5, 45 Grad Winkel; .10 x .06mm Spitzengröße; 109mm Länge
Bonn Mikropinzette, 1x2 Zähne	Roboz	RS-5172	Bindeplattform; 1x2 Zähne, 0.12 mm Zähne; 3.75" Länge; 0.3 mm Spitzenbreite