Summary
Cultures embryonnaires de cellules rétiniennes chiches constituent des outils précieux pour l'étude de la biologie photorécepteur. Nous avons mis au point une technique de transfert de gène efficace sur la base de plasmide électroporation ex ovo de la rétine antérieure à la culture. Cette technique augmente considérablement les efficacités de transfection sur des protocoles actuellement disponibles, ce qui rend possible une manipulation génétique pour ce système.
Abstract
Les cultures photoréceptrices enrichi cône provenant de rétines chiches embryonnaires sont devenus un outil indispensable pour les chercheurs du monde entier qui étudient la biologie des neurones de la rétine, en particulier les photorécepteurs. Les applications de ce système vont au-delà de la recherche fondamentale, car ils peuvent facilement être adaptés aux technologies à haut débit pour le développement de médicaments. Toutefois, la manipulation génétique des photorécepteurs de la rétine dans ces cultures est avérée très difficile, ce qui constitue une limitation importante de l'utilité du système. Nous avons récemment développé et validé un plasmide ex ovo technique d'électroporation qui augmente le taux de transfection de cellules de la rétine dans ces cultures par cinq fois par rapport à d'autres protocoles actuellement disponibles 1. Dans cette méthode yeux chiches embryonnaires sont énucléés à l'étape 27, l'EPR est enlevée, et la coupe de la rétine est placé dans une solution contenant le plasmide et électroporation utilisant CUSTOM- facilement construitsélectrodes faites. Les rétines sont ensuite dissociés et cultivées en utilisant des procédures standard. Cette technique peut être appliquée à des études de surexpression, ainsi que la régulation négative de l'expression génique, par exemple via l'utilisation de la technologie d'ARNi induite par le plasmide, la réalisation couramment l'expression du transgène dans 25% de la population ayant une photorécepteur. Le format vidéo de la présente publication rendre cette technologie facilement accessible aux chercheurs dans le domaine, ce qui permet l'étude de la fonction des gènes dans les cultures primaires rétiniennes. Nous avons également inclus des explications détaillées sur les étapes essentielles de cette procédure pour le succès et la reproductibilité.
Introduction
Des cultures de cellules dissociées à partir de rétines embryonnaires de poulet ont été largement utilisés pour étudier les différents aspects de la biologie des cellules de photorécepteur, y compris leur survie 09/02, 12/10 différenciation, la croissance des neurites 13, et plus encore. Les avantages de ce système, mis au point dans les années 1980 par Ruben Adler et collaborateurs et perfectionné par ses et d'autres groupes 14-20, résident dans les caractéristiques intrinsèques de la nana comme un modèle animal 21. La grande taille de l'œil de poulet, même à des stades embryonnaires, fournit de grandes quantités de matériel pour les cultures. En outre, lorsque les cultures sont réalisées en utilisant jour embryonnaire (ED) 5 - 6 rétines, de 55 à 80% de leurs cellules progénitrices différencier en photorécepteurs 14,15,18,22,23, et puisque environ 86% des photorécepteurs de cet animal sont cônes 24, ces cultures sont particulièrement adaptés pour les études portant sur ce type de cellule.
Nous avons récemment déveped et caractérisé une technique simple qui permet à haut rendement plasmide transfection des cellules dans ces cultures, élargissant ainsi l'utilité de ce système en facilitant les études de génétique missexpression 1. Le développement de cette technique découle d'un vide dans la littérature scientifique des méthodes qui permettraient un niveau acceptable de transfection pour permettre l'étude de la fonction des gènes d'une manière autonome cellulaire. Ceci est en partie à cause des cultures de neurones primaires sont notoirement difficiles à transfecter 25,26. Certaines des techniques les plus couramment utilisées précédemment disponibles à cet effet inclus méthodes de transfection chimiques tels que la lipofection ou phosphate de calcium, transfection qui se traduisent par des rendements de l'ordre de 3-5% et peuvent exercer une toxicité considérable 27-32. Même si l'utilisation de plasmides avec un système rapporteur enzymatique peut contourner le problème de la mauvaise efficacité de la transfection par l'amplification du signal, ils ne le font pasdiscriminer les effets spécifiques des cellules, et leurs résultats sont basés sur une petite population de cellules qui peuvent ne pas être représentative de l'ensemble. Une autre méthode largement utilisée dans le poussin, infection par le virus RCAS, est applicable uniquement aux cellules proliférantes et ne conviennent donc pas pour cette primaire système de culture de la rétine 33.
Dans le protocole actuel yeux chiches embryonnaires sont énucléés à l'étape 27 (ED 5), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est enlevée, et la coupe de la rétine est placé dans une chambre d'électroporation rempli d'une solution contenant le plasmide et électroporation en utilisant sur mesure des électrodes, suivie de dissociation de la rétine et de la culture en utilisant des techniques standards 21. Après l'optimisation de cette procédure, nous avons été en mesure de réaliser systématiquement des efficacités de transfection de l'ordre de 22% du nombre total de cellules en culture et 25% au sein de la population de photorécepteur seul, sans compromettre les caractéristiques de survie et la différenciation descultures 1. Ici, nous fournissons un protocole détaillé décrivant toutes les étapes importantes de cette procédure afin d'assurer le succès et la reproductibilité de cette technique.
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans cet ouvrage ont été réalisés selon les directives recommandées par la protection des animaux et l'utilisation Comité à l'Université Johns Hopkins.
1. Ahead of Time: préparation d'instruments, réactifs et Plats
- Préparation des oeufs: incuber des oeufs fertilisés de poulet White Leghorn à 37,5 ° C et 60% d'humidité relative pendant 5 jours dans un incubateur d'œufs.
REMARQUE: Un incubateur avec des rocking capacité peut être utile pour la normalisation et la synchronisation du développement embryonnaire, mais bascule est pas strictement nécessaire pour l'issue de ce protocole. - Le plasmide Préparation:
- Conception construction plasmidique pour la surexpression ou la régulation négative du gène (par exemple par l'utilisation de la technologie ARNi 1,34) selon les besoins. Inclure un gène rapporteur (tels que EGFP, RFP ou LacZ) dans le produit d'assemblage chaque fois que possible.
NOTE: Certains promoteurs couramment utilisés, tels que le CMV, peuvent se taire après le temps. Le Promot CAGer (poulet bêta-actine promoteur CMV activateur) est une très bonne alternative, fournissant une expression efficace à long terme du gène d'intérêt 35-37. - Préparer une solution de plasmide à une concentration de 1,5 ug / ul dans du PBS stérile. OPTION: Préparer la solution de plasmide à l'avance et de le stocker au congélateur jusqu'au moment d'utiliser.
NOTE: Des concentrations plus élevées de plasmide ne conduisent pas à une augmentation significative de l'efficacité, tandis que l'utilisation des concentrations de plasmide moins élevés abaissent l'efficacité de transfection 1.
- Conception construction plasmidique pour la surexpression ou la régulation négative du gène (par exemple par l'utilisation de la technologie ARNi 1,34) selon les besoins. Inclure un gène rapporteur (tels que EGFP, RFP ou LacZ) dans le produit d'assemblage chaque fois que possible.
- Électrodes:
- Pour l'utilisation de l'anode une médaille d'or épaisse basculé électrode (voir le tableau des matériaux spécifiques / Équipement). Essuyer avec 70% d'éthanol.
REMARQUE: Isolation de l'électrode à bout l'or, ce qui laisse environ 0,5 mm apparentes, est souhaitable pour minimiser les fuites de courant électrique. Information pour matériau isolant peut être trouvé dans le tableau des matériaux spécifiques. - Faire une cathode sur un carré de 2,5 mm bboeuf filament, 4,5 mm de large (normalement utilisé dans les extracteurs de micropipette). Avec l'aide de forceps, annuler la boîte carrée et redresser filament en une longue bande. Puis, sous la dissection microscope et en utilisant une règle comme guide, plier le filament dans une forme carrée 'U' 3 mm de long à la base et 2 mm de haut sur un côté, de l'autre côté de la longueur restante du filament (Figure 1 , C - D). En utilisant des pinces, tremper l'électrode dans 96% d'éthanol et de la flamme pour stériliser. Ensuite, fixez un fil électrique avec une petite pince crocodile à bras le plus long de l'électrode.
- Pour l'utilisation de l'anode une médaille d'or épaisse basculé électrode (voir le tableau des matériaux spécifiques / Équipement). Essuyer avec 70% d'éthanol.
- Électroporation Chambre Setup:
- Préparer la chambre d'électroporation en coupant le couvercle d'un tube de 1,5 ml à centrifuger stérile et en l'apposant, côté plat vers le bas, à un 100 mm boîte de Petri en utilisant du ruban (figure 1E).
REMARQUE: un autre récipient sous la forme d'un puits de taille similaire pourrait fonctionner; Toutefois, un couvercle de microtube est facilement accessible et autoclavable. Le puitdoit être suffisant pour abriter une électrode poussin oeil et la cathode grand, mais pas si grand qu'il en résulte une perte de solution de plasmide.
- Préparer la chambre d'électroporation en coupant le couvercle d'un tube de 1,5 ml à centrifuger stérile et en l'apposant, côté plat vers le bas, à un 100 mm boîte de Petri en utilisant du ruban (figure 1E).
2. Ex ovo procédure électroporation
- Préparation des instruments:
- Stériliser les outils micro-dissection (2 grosses paires de pinces Moloney courbes pour l'ouverture des coquilles d'oeufs et creusant embryons, 2 paires de fine pointe recourbée pinces Dumont pour enlever RPE, une paire de Bonn dentée pince pour enlever la lentille et vitreuse) en plongeant le conseils dans 96% d'éthanol et enflammées. Champ de dissection propre en utilisant des lingettes trempées dans 70% d'éthanol. Réchauffez une bouteille de solution saline équilibrée de stérile de calcium-magnésium sans Hank (CMF-HBSS) dans un bain d'eau à 37 ° C. Remplissez 100 mm boîtes de Petri stériles à 3/4 avec de chaleureux CMF-HBSS.
- Placez chambre d'électroporation sous un autre microscope de dissection propre et remplir avec 120 pi de solution de plasmide. Connectez électrodes pour appareil d'électroporation, faisantassurer électrode sur mesure est relié au pôle négatif et l'or basculé électrode au pôle positif.
- Embryon Collection:
- Nettoyez les oeufs en les essuyant avec coquilles lingettes humidifiées dans 70% d'éthanol. Maintenir procédure stérile dans le reste du protocole à éviter de transporter la contamination dans les cultures. Utilisation de grandes pinces Moloney courbes ouvrir soigneusement un trou dans la coquille d'oeuf en tapotant doucement sur le bout arrondi d'un œuf (plus de la chambre à air), puis saisir et tirer des morceaux de coquille.
- Avec une autre paire de pinces supprimer membranes et de recueillir embryon en écopant de l'œuf (en faisant attention à ne pas endommager l'embryon). Placez-le dans un plat avec le FMC HBSS.
REMARQUE: Recueillir autant d'embryons que nécessaire pour obtenir le nombre de tasses désiré rétiniennes pour électroporation comme spécifié dans 2.4.4 - Étape critique: stade, les embryons selon Hamburger et Hamilton 38.
REMARQUE: Pour obtenir des embryons d'efficacité optimalesdoit être au stade 27 (figure 2A). - Euthanasier les embryons par décapitation à l'aide de forceps Moloney.
- Obtention Coupes de la rétine:
- En utilisant des pinces de Dumont fines, énucléer attentivement les yeux et de les transférer à un nouveau plat CMF-HBSS.
- A partir de la partie postérieure de chaque œil, à proximité de la tête du nerf optique, et l'aide de deux pinces de Dumont fines, introduire une pointe de chaque paire de pinces entre la rétine neurale et RPE et soigneusement disséquer l'EPR être prudent pour ne pas endommager l'neuronal rétine (figure 2B).
NOTE: Le manque de Ca 2+ et Mg 2+ dans la solution aidera le RPE détacher de la rétine neurale plus facilement.
- Électroporation:
- Mettre en place les paramètres de électroporateur de livrer 5 impulsions carrées de 15 Volts, 50 msec et 950 msec intervalle. Place 'U' électrode négative en forme de l'intérieur de la chambre d'électroporation (couvercle remplissage à centrifugered avec 120 pi d'une solution contenant le plasmide-).
- L'aide de pincettes Dumont courbes transférer une tasse de la rétine à la chambre d'électroporation (en creusant, pas touche), et le placer dans l'électrode en forme de «U», avec la partie postérieure de la rétine vers le fond de l'électrode et la lentille vers le haut ( Figure 2D).
- Placer l'anode de sorte qu'il touche la partie antérieure de l'oeil, à côté de la lentille, et l'utilisation de la pédale de l'électroporateur délivrer des impulsions électriques.
- Transfert tasse rétinienne électroporation à une nouvelle boîte de Pétri avec FMC-HBSS et répéter la procédure d'électroporation avec chacune des tasses rétiniennes restantes.
NOTE: jusqu'à 6 coupes rétiniennes peut être une électroporation avec la même solution de plasmide sans une diminution significative de l'efficacité de transfection. - Retirez la lentille et le corps vitré de chaque tasse rétinienne électroporation en les saisissant avec une pince à Bonn dentées et en tirant doucement à travers til élève ouverture en gardant l'œil en place avec le dos de la pince à épiler Dumont courbes.
- Passer à la dissociation et la culture des cellules de la rétine électroporation suivant les procédures standard.
NOTE: Pour un protocole détaillé sur la dissociation et la culture de cellules rétiniennes chiches réfèrent à Vergara et Canto-Soler, 2012, fichier complémentaire 4 21 Dans ce protocole, les cellules sont ensemencées à faible densité sur des plaques 6 puits polyornithine enduit ou 35. -MM plats (6 x 10 5 cellules / 35 mm de diamètre ainsi ou plat). Le milieu utilisé est un milieu 199 avec de la pénicilline / glutamine, 10% de sérum de veau foetal (FCS), et de l'acide linoléique-BSA à 100 ug / ml. Les cultures sont maintenues dans un 37 ° C humidifié incubateur avec 5% de CO 2. En utilisant cette procédure, 5 - 6 x 10 6 cellules peuvent généralement être obtenus par chaque étape 27 oeil électroporation.
NOTE: Dans l'idéal, pas plus de 3 h devrait passer entre la collecte des embryons et le placage de cellules, pour assurer une bonne survie des celluleset minimiser le stress. Un calendrier typique pour l'observation et l'analyse plus approfondie est au bout de 4 jours de culture, car à ce stade, les cellules ont réalisé une bonne différenciation morphologique et moléculaire et la survie est encore élevé.
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Representative Results
Nous présentons ici un protocole simple pour le plasmide transfection dans énucléés chiches tasses rétiniennes pour la culture cellulaire dissociée ultérieure. La transfection est réalisée par électroporation en utilisant facile à faire personnalisés électrodes (Figures 1 - 2). Les paramètres décrits dans ce protocole ont été optimisés pour obtenir des efficacités de transfection qui se situent entre 20 et 27% (avec une moyenne de 22%) (Figure 3D). Notez que, pour les raisons indiquées ci-dessus, ces résultats sont quantifiés après 4 jours de culture. Dans ce contexte, l'efficacité de transfection se réfère au pourcentage de cellules qui expriment le transgène au sein de la population cellulaire totale. Si seule la population de photorécepteur est considéré, les efficacités de transfection augmente à une moyenne de 25% (figure 3D). Ceci est une caractéristique importante car ces types de cultures sont principalement utilisés pour étudier les photorécepteurs.
Les cultures de cellules qui ont été electroporat ed utilisant cette technique sont impossibles à distinguer de leurs homologues non électroporés dans leur morphologie DIC sous illumination, des caractéristiques de survie de la cellule, et l'expression de marqueurs moléculaires tels que visinin (un marqueur couramment utilisé des photorécepteurs) et une Pax6.
Figure 1. Fabrication des électrodes. (A - D) La cathode est faite d'un filament de boîte carrée (A), qui est d'abord redressé (B) et ensuite plié avec une pince dans un «U» forme carrée (C - D). L'anode est une électrode en or d'épaisseur à bout (D); Remarquez l'isolant autour de l'électrode d'anode, ne laissant que 0,5 mm de la pointe exposée. De configuration (E) électroporation. Encart montre un plus fort grossissement de la zone encadrée.pg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Préparation de la rétine Coupes pour l'électroporation. (A) d'embryons de poulet au Hamburger et Hamilton stade embryonnaire 27. (B) L'EPR est soigneusement enlevé les yeux énucléés en utilisant une pince à épiler de Dumont pointus. (C) La coupe de la rétine sur la droite est dépourvue de RPE et prêt pour l'électroporation. (D ) L'électrode de cathode est placée à l'intérieur d'une chambre d'électroporation faite d'un 1,5 ml couvercle microtube rempli avec une solution de plasmide. La coupe de la rétine est soigneusement transférée dans la cathode vers le haut, et l'électrode d'anode est placé sur le dessus, à côté de l'objectif. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grandede ce chiffre.
Figure 3. L'efficacité de l'expression transgénique dans des cellules cultivées après électroporation (A - C). Coupes rétiniennes ont été électroporées avec un plasmide d'expression de la GFP, dissocié et cultivées pendant 4 jours. Des micrographies de fluorescence montrent DAPI des noyaux colorées (A) et exprimant la GFP cellules rétiniennes (B). Anti-Visinin coloration d'anticorps a été effectuée pour identifier les cellules photoréceptrices (C). (D) Graphique illustrant l'efficacité de transfection obtenue par ex ovo électroporation, représentée comme le pourcentage de la GFP exprimant des cellules dans la population cellulaire totale (DAPI positif), ou entre le photorécepteur population, en particulier (Visinin positif). Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences indépendantes. La barre d'échelle en
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Discussion
L'étape la plus critique pour le succès de ce protocole est de sélectionner le stade approprié des embryons. Dans les publications précédentes, une série de stades embryonnaires est donnée pour ces cultures, généralement définie par les jours d'incubation ou embryonnaires jours (ED); donc il est généralement supposé que l'utilisation ED ED 5 à 6 embryons donnera des résultats équivalents. Cependant, nous avons constaté que sur scène 27 (ED 5), l'efficacité de transfection sera autour de 22% de la population totale de la cellule, comme indiqué ci-dessus; encore l'efficacité diminuera à 16% en cas d'utilisation étape 28 embryons (ED 5.5), et à 12% au stade 29 (ED 6) 1. Autres étapes critiques comprennent le maintien des conditions stériles au long du processus; l'acquisition de la dextérité manuelle nécessaire pour éviter d'endommager la rétine lors de la dissection et l'électroporation; et d'éviter de longues lacunes à partir du moment de la collecte d'embryons au moment de l'étalement des cellules.
Une autre considération importante pour assurer une bonne efficien de transfectionpoli- est la concentration de la solution contenant le plasmide: la 1,5 pg / pl recommandé est la plus faible concentration que nous avons testé qui n'a pas abouti à une diminution de l'efficacité. Cette concentration se traduit par une grande quantité de matériau de plasmide lors de l'examen de la rétine ce que les gobelets sont baignées dans cette solution. Utilisation de la plus petite taille de puits qui va accueillir l'œil (par exemple un couvercle de tube de microcentrifugation) peut minimiser ce problème. En outre, plusieurs yeux peuvent être soumis à une électroporation en utilisant la même solution; nous avons pas vu une réduction de l'efficacité quand électroporation jusqu'à 6 tasses rétiniennes consécutivement dans la même solution de plasmide, et plus pourrait être effectué, mais nous ne pouvons pas attester de la différence d'efficacité par la suite.
Protocoles publiés précédemment ont généralement fourni faible efficacité de transfert de gènes pour ce type de culture, et donc ils ont dû souvent compter sur des techniques qui mesurent le produit de réactions enzymatiques sur une cellule lysate afin d'augmenter la sensibilité. Une telle approche présente l'inconvénient de ne pas permettre pour un type de cellule discrimination et de compter sur un faible nombre de cellules étant responsable du résultat observé, qui peut ne pas toujours refléter le comportement de la population de plus grande cellule. Une autre façon de contourner le problème de la faible efficacité est d'effectuer transfection de gènes in vivo, avant l'énucléation et la culture oeil. Ceci est une approche viable, mais il peut généralement être appliquée uniquement aux paradigmes expérimentaux spécifiques, puisque les deux plasmide électroporation et infection par le virus RCAS (un vecteur de transduction du gène commun chez le poulet) doivent généralement être réalisée à des stades précoces de développement, créant un décalage entre transfection et la culture. Ceci est une considération importante, car pendant ce laps de temps les cellules sont exposées à la fois les effets de l'microenvironnement extracellulaire ainsi que les facteurs intracellulaires, ayant des implications importantes dans l'interprétation de l'experimental résultats. En revanche, l'augmentation substantielle de l'efficacité du transfert de gènes obtenue avec l'approche ex ovo permet d'électroporation pour l'étude de la fonction des gènes d'une manière intrinsèque aux cellules. En outre, l'avantage de ce taux de transfection élevée peut être encore accrue quand il est utilisé en conjonction avec un haut débit automatisée-analyse de cellules 1.
Lors des premières étapes de la mise au point de cette technique, nous avons maintenu une électroporation oculaires tasses RPE-dépourvue de culture pendant 24 heures pour évaluer l'efficacité de l'électroporation réalisé avec différentes conditions 1. Bien que nous ne tentons de la culture eux pour une longue période de temps, notre expérience indique que le protocole décrit ici pourrait également être appliqué à des études reposant sur des explants organotypiques rétiniennes, sous réserve de conditions de culture des explants appropriés à long terme sont utilisés.
Enfin, il serait possible d'étendre l'applicabilité de l'eest ex ovo approche d'électroporation à d'autres modèles animaux. Par exemple, dans notre expérience transfection des yeux de souris au jour post-natal 1 ou 4 en utilisant ce protocole donné qualitativement bons résultats dans les cultures d'explants, mais lorsque les cultures de cellules dissociées ont été tentées efficacité de la transfection était de l'ordre de 6%, similaire à celle des autres techniques. Ainsi, cela pourrait être une alternative simple aux autres protocoles pour ce modèle animal, mais il devrait être optimisée pour le système particulier si des rendements élevés sont nécessaires. De la note, comme indiqué ci-dessus, stade embryonnaire au moment de l'électroporation était la clé de l'issue de haute efficacité obtenue dans la poule que ce paramètre doit être soigneusement examinée lors de l'application de la technique à d'autres modèles.
En conclusion, l'ex ovo technique d'électroporation peut étendre l'applicabilité des systèmes rétiniennes in vitro comme des outils puissants pour compléter des études in vivo, offrant npossibilités nouvelles pour des recherches de la rétine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco - Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1x2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width |
References
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