Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل Published: November 2, 2015 doi: 10.3791/52002
Automatic Translation
1, 1, 1
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

الجنينية الفرخ الثقافات خلايا شبكية تشكل أدوات قيمة لدراسة مبصرة علم الأحياء. قمنا بتطوير تقنية نقل الجينات الفعالة القائمة على البيضة السابقين البلازميد Electroporation للمن شبكية العين قبل الثقافة. هذا الأسلوب يزيد إلى حد كبير من الكفاءة ترنسفكأيشن عبر بروتوكولات المتوفرة حاليا، مما يجعل من الممكن التلاعب الجيني لهذا النظام.

Abstract

أصبحت الثقافات التخصيب مبصرة مخروط المستمدة من شبكية العين الفرخ الجنينية أداة لا غنى عنها للباحثين في جميع أنحاء العالم دراسة بيولوجيا الخلايا العصبية للشبكية، وبخاصة خلايا مستقبلة للضوء. تطبيقات هذا النظام تتجاوز البحوث الأساسية، لأنها يمكن بسهولة أن تتكيف مع تقنيات إنتاجية عالية لتطوير الأدوية. ومع ذلك، فقد ثبت التلاعب الجيني للخلايا مستقبلة للضوء في شبكية العين في هذه الثقافات أن تكون صعبة للغاية، مما يشكل قيدا هاما لفائدة النظام. لقد وضعت مؤخرا والتحقق من صحتها والبيضة السابقين تقنية البلازميد Electroporation للأن يزيد من معدل ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية في هذه الثقافات من خمسة أضعاف بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات المتوفرة حاليا 1. في هذه الطريقة يتم منزوعة النواة عيون الفرخ الجنينية في المرحلة 27، تتم إزالة RPE، ويتم وضع الكأس في شبكية العين في حل تحتوي على البلازميد و electroporated باستخدام اخملصصة شيدت بسهولةأقطاب بها. ثم يتم فصلها شبكية العين ومثقف باستخدام الإجراءات القياسية. ويمكن تطبيق هذه التقنية لدراسات overexpression وكذلك إلى downregulation التعبير الجيني، على سبيل المثال من خلال استخدام تكنولوجيا رني يحركها البلازميد، وتحقيق عادة التعبير التحوير في 25٪ من السكان مبصرة. فإن صيغة الفيديو من هذا المنشور جعل هذه التكنولوجيا في متناول الباحثين في هذا المجال، مما يتيح دراسة وظيفة الجين في الثقافات الشبكية الأولية. لقد قمنا بإدراج أيضا شرح مفصل لخطوات حاسمة من هذا الإجراء لتحقيق نتيجة ناجحة والتكاثر.

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع مزارع الخلايا فصلها من شبكية العين الفرخ الجنينية لدراسة مختلف جوانب بيولوجيا الخلايا المستقبلة للضوء، بما في ذلك بقائهم 2-9، والتمايز 10-12، ثمرة neurite 13، وأكثر من ذلك. مزايا هذا النظام، وضعت في 1980s من قبل روبن أدلر والمتعاونين والكمال من قبل له وغيرها من الجماعات 14-20، يقيمون في الخصائص الجوهرية للفرخ كنموذج للحيوانات 21. الحجم الكبير للعين الفرخ، حتى في المراحل الجنينية، يوفر كميات كبيرة من المواد للثقافات. وعلاوة على ذلك، عندما يتم تنفيذ الثقافات باستخدام اليوم الجنينية (ED) 5-6 شبكية العين، 55-80٪ من الخلايا الاصلية التي تفرق كما مبصرات 14،15،18،22،23، ومنذ ما يقرب من 86٪ من خلايا مستقبلة للضوء في هذا الحيوان هي المخاريط 24، هذه الثقافات هي مناسبة خاصة للدراسات التركيز على هذا النوع من الخلايا.

لدينا develo مؤخراإدخال رقم التعريف الشخصي وتتميز تقنية بسيطة التي تسمح للذات الكفاءة العالية البلازميد ترنسفكأيشن من الخلايا في هذه الثقافات، وبالتالي توسيع فائدة هذا النظام من خلال تسهيل الدراسات الجينية missexpression 1. تطوير هذه التقنية تنبع من فراغ في الكتابات العلمية من الأساليب التي من شأنها أن توفر مستوى مقبول من ترنسفكأيشن للسماح لدراسة وظيفة الجين بطريقة خلية مستقلة. هذا هو في جزء منه بسبب الثقافات العصبية الأولية من الصعب المعروف ل transfect 25،26. وشملت بعض من الأكثر استخداما التقنيات المتاحة مسبقا لهذا الغرض طرائق نقل المواد الكيميائية مثل lipofection أو الكالسيوم ترنسفكأيشن بوساطة الفوسفات، مما يؤدي إلى زيادة الكفاءة في ترتيب 3-5٪ ويمكن أن تمارس سمية كبيرة 27-32. على الرغم من أن استخدام البلازميدات مع مراسل النظام الأنزيمي يمكن الالتفاف على مشكلة سوء كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق تضخيم إشارة، لم يفعلوا ذلكتميز آثار خلية محددة، وتستند نتائجها على السكان الخلية الصغيرة التي قد لا تكون ممثلة للمجلس بكامل هيئته. آخر الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في الفرخ، عدوى فيروس تقييمات النتائج والكفاءات، لا ينطبق إلا على الخلايا المتكاثرة، وبالتالي لا تصلح لهذا النظام الثقافة الشبكية الأساسي 33.

في البروتوكول الحالي ومنزوعة النواة عيون الفرخ الجنينية في المرحلة 27 (ED 5)، تتم إزالة الظهارة الصباغية الشبكية (RPE)، ويتم وضعها في كوب شبكية العين في غرفة Electroporation للمليئة حل تحتوي على البلازميد و electroporated باستخدام حسب الطلب الأقطاب، تليها التفكك شبكية العين والثقافة باستخدام التقنيات القياسية 21. بعد تحسين هذا الإجراء كنا قادرين على تحقيق باستمرار الكفاءة ترنسفكأيشن بناء على أمر من 22٪ من العدد الكلي للخلايا في الثقافة و25٪ بين السكان مبصرة وحده، دون المساس البقاء على قيد الحياة والتمايز خصائصثقافات 1. هنا نقدم بروتوكول مفصلة تبين جميع الخطوات الهامة في هذا الإجراء من أجل ضمان نجاح واستنساخ هذه التقنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا العمل وفقا للمبادئ التوجيهية الموصى بها من قبل رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في جامعة جونز هوبكنز.

1. في وقت مبكر: إعداد الأدوات والكواشف وأطباق

  1. إعداد البيض: احتضان بيض الدجاج المخصب الأبيض ليفورنو في 37.5 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60٪ لمدة 5 أيام في حاضنة البيض.
    ملاحظة: حاضنة مع هزاز القدرة قد تكون مفيدة لتوحيد واكبت التطور الجنيني، ولكن هزاز ليست ضرورية لنتائج هذا البروتوكول.
  2. إعداد البلازميد:
    1. تصميم البلازميد بناء على overexpression الجينات أو downregulation (على سبيل المثال من خلال استخدام تكنولوجيا رني 1،34) حسب الحاجة. تشمل الجينات مراسل (مثل EGFP، RFP أو LacZ) في بناء كلما كان ذلك ممكنا.
      ملاحظة: بعض المروجين شائعة الاستخدام مثل CMV، يمكن أن تصبح الصمت بعد مرة. وpromot CAGإيه (دجاج بيتا أكتين المروج مع محسن CMV) هو بديل جيد للغاية، وتوفير التعبير فعال على المدى الطويل من الجينات في المصالح 35-37.
    2. يعد حل البلازميد بتركيز 1.5 ميكروغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني العقيمة. اختياري: يعد حل البلازميد في وقت مبكر وتخزينها مجمدة حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة: ارتفاع تركيزات البلازميد لا يؤدي إلى زيادة كبيرة في كفاءة، في حين باستخدام تركيزات أقل البلازميد تقلل من كفاءة ترنسفكأيشن 1.
  3. أقطاب:
    1. لاستخدام الأنود الذهب سميكة يميل القطب (انظر الجدول مواد محددة / المعدات). محو نظيفة مع الايثانول 70٪.
      ملاحظة: العزل من الذهب يميل القطب، وترك ما يقرب من 0.5 ملم المكشوفة، وينصح للحد من تسرب التيار الكهربائي. معلومات عن مواد عازلة يمكن العثور عليها في جدول المواد المحددة.
    2. جعل الكاثود من 2.5 ملم مربع بخيوط ثور، 4.5 ملم واسعة (تستخدم عادة في جر micropipette). مع المعونة من الملقط، التراجع عن مربع مربع وتصويب خيوط في شريط طويل. ثم تحت المجهر تشريح وباستخدام مسطرة كدليل، ثني خيوط في شكل مربع 'U' 3 مم طويل في القاعدة و2 مم عالية في جانب واحد، مع الجانب الآخر من طول ما تبقى من خيوط (الشكل 1 ، C - D). باستخدام ملقط، وتراجع القطب في 96٪ من الإيثانول واللهب لتعقيم. ثم إرفاق الرصاص الكهربائي مع مقطع التمساح الصغير إلى الذراع الطويل من القطب.
  4. إعداد غرفة Electroporation لل:
    1. إعداد غرفة Electroporation للعن طريق قطع غطاء العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والالصاق ذلك، الجانب المسطح إلى أسفل، إلى 100 ​​مم طبق بتري باستخدام شريط (الشكل 1E).
      ملاحظة: حاوية أخرى في شكل جيد مشابهة من حيث الحجم ستعمل؛ ومع ذلك، فإن غطاء أنبوب microcentrifuge يمكن الوصول إليه بسهولة وautoclavable. البئريجب أن تكون كبيرة بما يكفي لإيواء كتكوت العين والكاثود القطب، ولكن ليست كبيرة بحيث يؤدي إلى مضيعة للحل البلازميد.

2. خروج البيضة Electroporation للإجراءات

  1. إعداد الأدوات:
    1. تعقيم الأدوات الدقيقة تشريح (2 أزواج من كبيرة ملقط مولوني منحنية لفتح قشر البيض ويغرف من الأجنة، 2 أزواج من غرامة غيض منحني ملاقط دومون لإزالة RPE، زوج واحد من بون مسننة ملقط لإزالة العدسة والجسم الزجاجي) من خلال غمس نصائح في 96٪ من الإيثانول والمشتعلة. نظيف نطاق تشريح باستخدام مناديل انخفضت في 70٪ من الإيثانول. تدفئة زجاجة محلول الملح عقيمة خالية الكالسيوم والمغنيسيوم، هانك المتوازن (CMF-HBSS) في حمام مائي 37 ° C. ملء 100 ملم أطباق بتري معقمة ل3/4 كامل مع دافئ CMF-HBSS.
    2. ضع دائرة Electroporation للتشريح تحت المجهر نظيف آخر وملء مع 120 ميكرولتر من الحل البلازميد. توصيل الأقطاب الكهربائية لجهاز Electroporation لل، مما يجعليتم توصيل متأكد حسب الطلب القطب إلى القطب السالب والذهب يميل القطب إلى القطب الموجب.
  2. جنين مجموعة:
    1. تنظيف البيض بواسطة المسح قذائف مع مناديل المبللة في 70٪ من الإيثانول. الحفاظ على إجراءات عقيمة طوال ما تبقى من البروتوكول لتجنب تحمل التلوث في الثقافات. باستخدام ملقط كبيرة مولوني منحني فتح بعناية ثقب في قشرة البيضة من خلال استغلال بلطف على طرف مقربة من بيضة (أكثر من غرفة الهواء) ثم تجتاح وسحب قطع قذيفة.
    2. مع زوج آخر من ملقط إزالة الأغشية وجمع الجنين عن طريق شفط للخروج من البيض (والحرص على عدم الاضرار الجنين). وضعه في طبق مع CMF-HBSS.
      ملاحظة: كما جمع العديد من الأجنة عند الضرورة للحصول على العدد المطلوب من أكواب شبكية ل electroporation كما هو محدد في 2.4.4
    3. خطوة حاسمة: مرحلة الأجنة وفقا للهمبرغر وهاميلتون 38.
      ملاحظة: للحصول على الأجنة المثلى الكفاءةيجب أن يكون في مرحلة 27 (الشكل 2A).
    4. الموت ببطء الأجنة عن طريق قطع الرأس باستخدام ملقط مولوني.
  3. الحصول على الكؤوس الشبكية:
    1. باستخدام الملقط دومون غرامة، استأصل بعناية العينين ونقل إلى طبق CMF-HBSS الجديد.
    2. بدءا من الجزء الخلفي من كل عين، على مقربة من رأس العصب البصري، واستخدام اثنين من ملاقط دومون غرامة، وإدخال طرف واحد من كل زوج من ملاقط بين الشبكية العصبية وRPE وبعناية تشريح خارج RPE يكون حذرا حتى لا تضر العصبية شبكية العين (الشكل 2B).
      ملاحظة: عدم وجود الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ في حل من شأنه أن يساعد RPE فصل من العصبية في الشبكية بشكل أكثر سهولة.
  4. Electroporation لل:
    1. إعداد المعلمات electroporator على تقديم 5 نبضات مربع من 15 فولت، 50 ميللي ثانية مدتها، و 950 مللي ثانية فاصل. مكان 'U' على شكل القطب السالب داخل غرفة Electroporation لل(microcentrifuge لملء غطاءإد مع 120 ميكرولتر من محلول التي تحتوي على البلازميد).
    2. باستخدام الملقط دومون منحني نقل كوب الشبكية واحدة إلى غرفة Electroporation لل(عن طريق شفط، وليس الضغط)، ووضعه داخل القطب على شكل "U"، مع الجزء الخلفي من شبكية العين باتجاه الجزء السفلي من القطب والعدسة التي تواجه صعودا ( الشكل 2D).
    3. وضع القطب الموجب بحيث يلامس الجزء الأمامي من العين، بجانب العدسة، واستخدام دواسة القدم electroporator لتسليم النبضات الكهربائية.
    4. نقل electroporated كوب الشبكية إلى طبق بتري جديد مع CMF-HBSS وتكرار الإجراء Electroporation للمع كل ما تبقى من أكواب شبكية العين.
      ملاحظة: ما يصل إلى 6 أكواب شبكية العين يمكن electroporated مع الحل البلازميد نفسه دون حدوث انخفاض كبير في كفاءة ترنسفكأيشن.
    5. إزالة العدسة والجسم الزجاجي من كل كوب شبكية العين electroporated التي تجتاح لهم بون ملقط مسنن وسحب بلطف من خلال رانه تلميذ افتتاح حين الضغط على العين في مكان مع الجزء الخلفي من ملاقط دومون منحنية.
    6. انتقل إلى التفكك والثقافة من الخلايا الشبكية electroporated فقا للإجراءات العادية.
      ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصلة على التفكك والثقافة من الخلايا في شبكية العين الفرخ الرجوع إلى فيرغارا وكانتو-سولير، 2012، ملف إضافي 4 21 في هذا البروتوكول هي المصنفة الخلايا في كثافة منخفضة على 6 لوحات جيدا المغلفة polyornithine أو 35. أطباق -MM (6 × 10 5 خلايا / 35 مم القطر جيدا أو صحن). الوسيلة المستخدمة متوسط ​​199 مع البنسلين / الجلوتامين، و 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، واللينوليك وحمض BSA في 100 ميكروغرام / مل. تتم المحافظة على الثقافات في ترطيب 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ CO 2. باستخدام هذا الإجراء، 5-6 × 10 6 خلايا ويمكن عادة الحصول عليها في كل مرحلة 27 العين electroporated.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، يجب أن لا يزيد عن 3 ساعة تمر بين جمع الأجنة والطلاء الخلية، لضمان بقاء الخلية جيدوالحد من التوتر. A توقيت نموذجي للمراقبة ومزيد من التحليل هو بعد 4 أيام في الثقافة، منذ عند هذه النقطة قد حققت خلايا جيدة التمايز المورفولوجية والجزيئية والبقاء على قيد الحياة لا يزال مرتفعا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا نقدم بروتوكول بسيط لالبلازميد ترنسفكأيشن إلى منزوعة النواة فرخ أكواب شبكية العين للثقافة الخلية فصلها اللاحقة. ويتحقق ترنسفكأيشن بواسطة الصعق الكهربائي باستخدام سهلة لجعل أقطاب مخصصة (الأرقام 1-2). وقد تم تحسين المعلمات الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على الكفاءات ترنسفكأيشن التي تتراوح بين 20 و 27٪ (بمتوسط ​​22٪) (الشكل 3D). لاحظ أنه، للأسباب المذكورة أعلاه، كميا هذه النتائج بعد 4 أيام في الثقافة. في هذا السياق، يشير كفاءة ترنسفكأيشن إلى النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن التحوير ضمن مجموع السكان الخلية. وإذا اعتبر فقط السكان مبصرة، وزيادة الكفاءة ترنسفكأيشن إلى ما متوسطه 25٪ (الشكل 3D). هذه هي ميزة هامة لأن هذه الأنواع من الثقافات وتستخدم في المقام الأول لدراسة المستقبلات الضوئية.

مزارع الخلايا التي تم electroporat إد باستخدام هذه التقنية هي تمييزه عن نظرائهم غير electroporated في التشكل تحت DIC الإضاءة، والخصائص بقاء الخلية، والتعبير عن الواسمات الجزيئية مثل visinin (علامة استخداما من المستقبلات الضوئية) وPax6 1.

الشكل 1
الشكل 1. جعل من الأقطاب الكهربائية. (A - D) ويتكون الكاثود من فتيلة مربع مربع (A)، الذي تقويمها أولا (B) ثم عازمة بالملقط إلى 'U' شكل مربع (C - D). الأنود هو الذهب سميكة يميل القطب (D)؛ لاحظ العزل حول القطب الموجب، ولم يتبق سوى 0.5 ملم من طرف عرضة للخطر. الإعداد (E) Electroporation لل. يظهر أقحم التكبير أعلى من منطقة محاصر.خريج "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. إعداد الشبكية الكؤوس ل electroporation. (A) الفرخ الجنين في همبرغر وهاميلتون المرحلة الجنينية 27. (B) يتم إزالة RPE بعناية من عيون منزوعة النواة باستخدام الملقط دومون حادة. (C) والكأس في شبكية العين على اليمين يخلو من RPE وعلى استعداد ل electroporation. (D ) يتم وضع القطب السالب داخل غرفة Electroporation للمصنوعة من 1.5 مل أنبوب microcentrifuge غطاء مملوءة بمحلول البلازميد. يتم نقل الكأس في شبكية العين بعناية إلى القطب السالب تواجه صعودا، ويتم وضع القطب الموجب على القمة، بجانب العدسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبرمن هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. كفاءة التعبير التحوير في الخلايا المستزرعة بعد Electroporation لل(A - C). تم electroporated أكواب الشبكية مع GFP التعبير البلازميد، فصلها وتربيتها لمدة 4 أيام. تظهر الميكروسكوب الإسفار دابي الملون نوى (A) وGFP معربا عن الخلايا الشبكية (B). تم إجراء لمكافحة Visinin تلوين الأجسام المضادة لتحديد خلايا مستقبلة للضوء (C). (D) رسم بياني يوضح كفاءة ترنسفكأيشن من قبل البيضة السابقين Electroporation للتحقيق، ممثلة نسبة GFP معربا عن الخلايا بين مجموع السكان الخلية (دابي إيجابي)، أو بين مبصرة السكان بشكل خاص (Visinin إيجابي). وتمثل النتائج يعني ± SEM من 5 تجارب مستقلة. شريط النطاق في (A - C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية لنجاح هذا البروتوكول هو اختيار المرحلة المناسبة من الأجنة. في المنشورات السابقة، وتعطى مجموعة من المراحل الجنينية لهذه الثقافات، الذي يعرف عادة قبل أيام من الحضانة أو الجنينية أيام (ED)؛ وبالتالي فإنه عادة ما يفترض أن استخدام ED 5 إلى 6 ED الأجنة سوف تسفر عن نتائج مماثلة. ومع ذلك فقد وجدنا أن على خشبة المسرح 27 (ED 5)، الكفاءة ترنسفكأيشن ستكون حوالي 22٪ من مجموع السكان الخلية، كما ورد أعلاه؛ بعد الكفاءة ستنخفض إلى 16٪ في حالة استخدام المرحلة 28 الأجنة (ED 5.5)، وإلى 12٪ في المرحلة 29 (ED 6) 1. وتشمل الخطوات الحاسمة الأخرى الحفاظ على ظروف معقمة طوال العملية. الحصول على ما يلزم من البراعة اليدوية لتجنب إتلاف شبكية العين خلال تشريح و electroporation. وتجنب فجوات طويلة من الوقت لجمع الجنين الى وقت الطلاء الخلية.

اعتبار آخر مهم لضمان حسن ترنسفكأيشن كفاءهكاالت هو تركيز المحلول التي تحتوي على البلازميد: الموصى بها 1.5 ميكروغرام / ميكرولتر هو أدنى تركيز التي اختبرناها التي لم ينتج عنها انخفاض في الكفاءة. هذا التركيز يترجم على كمية عالية من المواد البلازميد عندما اعتبر أن أكواب شبكية العين واستحم في هذا الحل. يمكن استخدام أصغر حجم جيد من شأنها أن تستوعب العين (مثل أنبوب microcentrifuge غطاء) تقليل هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك، العديد من العيون يمكن electroporated باستخدام نفس الحل. لم نر انخفاضا في كفاءة عندما electroporating تصل إلى 6 أكواب شبكية العين على التوالي في حل البلازميد نفسه، وأكثر من ذلك ربما يمكن أن يؤديها لكننا لا يمكن أن يشهد على الفرق في الكفاءة بعد ذلك.

وقد وفرت البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا عادة انخفاض كفاءة نقل الجينات لهذا النوع من الثقافة، وبالتالي كان لديهم في كثير من الأحيان إلى الاعتماد على التقنيات التي قياس الناتج من التفاعلات الإنزيمية على خلية لysate من أجل زيادة الحساسية. هذا النهج لديه عيب عدم السماح للخلية من نوع التمييز والاعتماد على عدد قليل من الخلايا هي المسؤولة عن النتيجة الملحوظة، التي قد لا تكون دائما تعبيرا عن سلوك السكان الخلية أكبر. وهناك طريقة أخرى للتحايل على مشكلة انخفاض الكفاءة هي أداء ترنسفكأيشن الجينات في الجسم الحي، قبل قلع العين والثقافة. هذا هو نهج عملي ولكنه عادة ما يمكن تطبيقه فقط على نماذج تجريبية محددة، لأن كلا Electroporation للالبلازميد وعدوى فيروس تقييمات النتائج والكفاءات (الجين المشترك تنبيغ ناقلات في فرخ) تحتاج عادة لانجازها في مراحل النمو المبكرة، وخلق فجوة زمنية بين ترنسفكأيشن والثقافة. هذا اعتبار مهم، لأن تتعرض الخلايا خلال ذلك الوقت تأخر لآثار كل من المكروية خارج الخلية وكذلك العوامل داخل الخلايا، لها آثار كبيرة في تفسير إكسبالنتائج erimental. في المقابل، فإن زيادة كبيرة في كفاءة نقل الجينات تحقق مع البيضة السابقين نهج Electroporation لليسمح لدراسة وظيفة الجين بطريقة الخلايا الذاتية. وعلاوة على ذلك، والاستفادة من هذا المعدل ترنسفكأيشن عالية ويمكن زيادة أبعد من ذلك عندما تستخدم بالاقتران مع الآلية الإنتاجية العالية خلية التحليل 1.

في المراحل الأولى من تطوير هذه التقنية، حافظنا على electroporated أكواب العين RPE خالية في الثقافة لمدة 24 ساعة لتقييم كفاءة Electroporation للتحقيق مع ظروف مختلفة 1. على الرغم من أننا لم تحاول ثقافة لهم لفترة أطول من الأوقات، فإن تجربتنا تشير إلى أن بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تطبق على الدراسات التي تعتمد على إإكسبلنتس عضوي النمط الشبكية، شريطة أن يستخدم على المدى الطويل ظروف ثقافة يزدرع المناسبة.

وأخيرا، سيكون من الممكن توسيع نطاق انطباق عشرهو البيضة السابقين نهج Electroporation لللنماذج حيوانية أخرى. على سبيل المثال في تجربتنا ترنسفكأيشن من العيون الماوس في يوم ما بعد الولادة 1 أو 4 باستخدام هذا البروتوكول حققت نتائج جيدة نوعيا في الثقافات يزدرع، ولكن عندما جربت مزارع الخلايا نأت كان كفاءة ترنسفكأيشن بناء على أمر من 6٪، مماثلة لتلك التي من غيرها من التقنيات. وهكذا، وهذا يمكن أن يكون بديلا بسيط لبروتوكولات أخرى لهذا نموذج حيواني، ولكنه في حاجة إلى أن يكون الأمثل لنظام معين إذا كانت هناك حاجة الكفاءة العالية. وتجدر الإشارة، كما ذكر أعلاه، كانت المرحلة الجنينية في وقت Electroporation للرئيسية إلى نتائج ذات الكفاءة العالية التي حصل عليها في الفرخ، لذلك ينبغي النظر هذه المعلمة بعناية عند تطبيق هذه التقنية لنماذج أخرى.

في الختام، يمكن أن البيضة السابقين تقنية Electroporation للتوسيع تطبيق في المختبر أنظمة شبكية العين وأدوات قوية لاستكمال الدراسات المجراة، وتقدم نالاحتمالات مصريات للبحث في شبكية العين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
  2. Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
  3. Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
  4. Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
  5. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
  6. Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
  7. Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
  8. Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
  9. Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
  10. Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
  11. Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
  12. Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
  13. Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
  14. Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
  15. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  16. Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
  17. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
  18. Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
  19. Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
  20. Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
  21. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
  22. Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
  23. Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
  24. Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
  25. Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
  26. Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
  27. Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
  28. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
  29. Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
  30. Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
  31. Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
  32. Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
  33. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
  34. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
  35. Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
  36. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  37. You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
  38. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 105، شبكية العين، مبصرة والثقافة الخلية الأولية، Electroporation لل، البلازميد ترنسفكأيشن والحمص
كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vergara, M. N., Gutierrez, C.,… More

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter