Summary
Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.
Abstract
Embriyonik civciv retina elde edilen koni fotoreseptör zenginleştirilmiş kültürler retinal nöronların, özellikle fotoreseptör biyoloji okuyan dünyadaki araştırmacılar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kolayca ilaç gelişimi için yüksek verimli teknolojileri için adapte edilebilir, bu sistemin uygulamalar temel araştırma ötesine geçmektedir. Bununla birlikte, bu kültürlerde retina fotoreseptörlerinin genetik manipülasyon sisteminin yararlılığını önemli bir sınırlandırma getirmeden, çok zor olduğu kanıtlanmıştır. Biz son zamanlarda geliştirilen ve diğer mevcut protokoller 1 ile karşılaştırıldığında beş kat bu kültürlerde retina hücrelerinin transfeksiyon hızını artırır plazmid elektroporasyon tekniği ovo bir eski valide. Bu yöntemde, civciv embriyosu gözler RPE çıkarılır, evre 27 de enükle edilir ve retina kap bir plasmid ihtiva eden bir çözeltiye yerleştirilmiş ve kolaylıkla inşa alışılagelmiş kullanılarak elektroporasyonayapılan elektrotlar. Retinalar sonra ayrışmış ve kültürlü standart prosedürleri kullanıyor. Bu teknik genel olarak, fotoreseptör nüfusunun% 25 transgen ekspresyonunu elde plazmit odaklı RNAi teknolojisinde kullanımı ile, örneğin, fazla sentezlenme çalışmaları yanı sıra, gen ekspresyonunda azalma uygulanabilir. Mevcut yayın video formatı primer retina kültürlerde gen fonksiyonu çalışma sağlayan, alanında araştırmacılara bu teknoloji kolayca erişilebilir hale getirecektir. Biz de başarılı bir sonuç ve tekrarlanabilirlik için bu prosedürün kritik adımlar ayrıntılı açıklamalar dahil ettik.
Introduction
Embriyonik civciv retina gelen ayrışmış hücre kültürleri yaygın olarak kendi yaşam 2-9, farklılaşma 10-12, neurite akıbet 13, ve daha fazlasını içeren fotoreseptör hücre biyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için kullanılmıştır. Ruben Adler ve işbirlikçileri tarafından 1980'li yıllarda geliştirilen ve onun ve diğer gruplar 14-20 tarafından mükemmelleştirilmiş bu sistemin avantajları, bir hayvan modelinde 21 olarak civciv içsel özelliklerinin bulunması. Hatta embriyonik aşamada civciv gözün büyük boy, kültürlerin için malzeme büyük miktarlarda sağlar. Kültürler embriyonik gün (ED) 5 kullanılarak yapılır Dahası, - 6 retinalar, 55 - Bu hayvanda fotoreseptör yaklaşık% 86 olduğu için kendi progenitör hücrelerin% 80 Fotoreseptörlerin 14,15,18,22,23 olarak ayırt ve koniler 24, bu kültürler, bu hücre tipi ilgili çalışma için özellikle uygundur.
Biz son zamanlarda develo varped ve böylece, genetik missexpression çalışmaları 1 kolaylaştırarak bu sistem kullanışlılığı genişletilmesi, bu kültürlerde hücre yüksek verimli plazmid transfeksiyon sağlayan basit bir teknik ile karakterize edilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, bir hücre bağımsız bir şekilde gen fonksiyonlarının araştırılmasında izin vermek için transfeksiyon kabul edilebilir bir düzeyde sağlayacak yöntemler bilimsel literatürde bir boşluk kaynaklanmıştır. Primer nöronal kültürlerin 25,26 transfect herkesin bildiği zor, çünkü bu bölümünde yer almaktadır. Bu amaç için daha önce mevcut olan en yaygın olarak kullanılan tekniklerin bazıları 3-5% sırasına verim neden olur ve ciddi yan etkilere 27-32 uygulayabilir gibi lipofeksiyon veya kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon gibi kimyasal nakil yöntemlerini, dahildir. Enzimatik muhabir sistemi ile Plazmidlerin kullanılması sinyalini yükselterek yoksul transfeksiyon verimlilik sorunu aşmak olsa bile, onlar değilHücre-spesifik etkileri ayırt ve bunların sonuçları bütünün temsilcisi olmayabilir küçük bir hücre popülasyonu dayanmaktadır. Civciv Yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, RCAS virüsü enfeksiyonu, çoğalan hücreler için geçerlidir, bu primer retina kültür sistemine 33 dolayısıyla uygun değildir.
Mevcut protokolde civciv embriyosu gözler evre 27 (ED 5), retinal pigment epitel (RPE) çıkarılır ve retina kap bir plasmid ihtiva eden çözelti ile doldurulmuş bir elektroporasyon odasına yerleştirilen en çıkarılmış ve kullanılarak, elektroporasyon bakımından güçlü ölçüye standart teknikler kullanılarak retina ayrışması 21 ve kültür izledi elektrotlar. Bu prosedürü optimize sonra hayatta kalma ve farklılaşma özelliklerini ödün vermeden sürekli, kültür hücreleri ve yalnız fotoreseptör nüfus içinde% 25 toplam sayısının% 22 mertebesinde transfeksiyon verimliliği elde etmek mümkün olmuşturKültürler 1. Burada bu tekniğin başarı ve yeniden üretilebilirlik sağlamak için, bu prosedür tüm önemli adımları gösteren bir detaylı bir protokol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada tarif edilen tüm prosedürler, Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kurallara göre gerçekleştirilmiştir.
Öncesinde Zaman: 1. Araçlar, Reaktifler ve Yemekleri Hazırlama
- Yumurtalar hazırlanması: Bir yumurta kuluçka makinesi içinde 5 gün 37,5 ° C ve% 60 bağıl nemde döllenmiş Beyaz Legorn tavuk yumurtası inkübe edin.
NOT: standartlaştırılması ve embriyonik gelişim senkronizasyonu için yararlı olabilir kapasitesi sallanan, ama sallanan bir inkübatör bu protokol sonucu için kesinlikle gerekli değildir. - Plazmid hazırlanması:
- Gerektiğinde tasarım plasmid (RNAi teknolojisinde 1,34 kullanımı yoluyla örneğin) geni aşırı ekspresyonu veya aşağı doğru düzenleme için yapılırlar. Mümkün olan her yapı içinde bir raportör gen (örneğin, EGFP, RFP veya LacZ gibi) içerir.
Not: CMV gibi bazı yaygın olarak kullanılan promotörler, bir süre sonra susturulması hale gelebilir. CAG promoter (tavuk beta-aktin promoteri, CMV artırıcı ile) ilgi 35-37 genin etkin, uzun vadeli ifade sağlayan, çok iyi bir alternatiftir. - Şekilde steril PBS içerisinde 1.5 ug / ul bir konsantrasyonda bir plazmid çözeltisi hazırlayın. İSTEĞE BAĞLI: vaktinden plazmid çözüm hazırlayın ve dondurulmuş Kullanıma hazır olana kadar saklayın.
NOT: Yüksek plazmid konsantrasyonları kullanılarak oysa alt plazmid konsantrasyonları transfeksiyon verimliliği 1 düşük, verimlilik önemli bir artışa yol açmaz.
- Gerektiğinde tasarım plasmid (RNAi teknolojisinde 1,34 kullanımı yoluyla örneğin) geni aşırı ekspresyonu veya aşağı doğru düzenleme için yapılırlar. Mümkün olan her yapı içinde bir raportör gen (örneğin, EGFP, RFP veya LacZ gibi) içerir.
- Elektrotlar:
- Anot kullanımı için kalın bir altın (Belirli Malzemeler / Ekipman Tablo) elektrodu uçlu. % 70 etanol ile silin.
Not: altın İzolasyon maruz kalan yaklaşık 0,5 mm bırakarak, elektrot uçlu, elektrik akımının sızmasını en aza indirmek için tavsiye edilir. Yalıtım malzemesi için bilgiler Özgül Materyallerin Tablo bulunabilir. - 2.5 mm kare b dışında bir katot yapın(normalde Mikropipet Elcikler kullanılan) 4.5 mm genişliğinde öküz filament. Forseps yardımı ile, kare kutu geri almak ve uzun bir şerit haline filamanın düzeltin. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu ve bir kılavuz olarak bir cetvel kullanarak altında, tabanda 3 mm uzunluğunda kare "U" şekline filamanın bükülmesi ve diğer tarafta filament kalan uzunluğu (Şekil 1 ile birlikte, bir yandan 2 mm yükseklikte C - D). Forseps kullanarak,% 96 etanol ve alev elektrot sterilize etmek batırın. Sonra elektrot uzun koluna küçük bir timsah klibi ile bir elektrik kurşun takın.
- Anot kullanımı için kalın bir altın (Belirli Malzemeler / Ekipman Tablo) elektrodu uçlu. % 70 etanol ile silin.
- Elektroporasyon Odası Kurulumu:
- 100 mm Petri kabı kullanarak bant (Şekil 1E) için, aşağı, düz tarafı bunu steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı kesme ve yapıştırılması ile elektroporasyon odasını hazırlayın.
Not: işe benzer büyüklükte bir oyuk şeklinde diğer bir kap; Ancak, bir mikrosantrifüj tüp kapağı kolayca erişilebilir ve otoklavlanabilir. Kuyuplazmid çözümün bir atık sonuçlanması bir civciv göz ve katot elektrot evine kadar büyük, ama çok büyük olmamalıdır.
- 100 mm Petri kabı kullanarak bant (Şekil 1E) için, aşağı, düz tarafı bunu steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı kesme ve yapıştırılması ile elektroporasyon odasını hazırlayın.
2. Ex ovo Elektroporasyon Prosedürü
- Araçların Hazırlanması:
- Mikro-diseksiyon araçları sterilize batırarak (yumurta kabukları açılması ve embriyolar, RPE kaldırmak için Dumont cımbız kavisli ince ucu 2 çift dışarı karıştırıyordu için büyük kavisli Moloney forseps 2 çift, Bonn bir çift kaldırma lens ve vitreus için forseps dişli) % 96 etanol ve alevli ipuçları. % 70 etanol batırılmış mendil kullanarak temizleyin diseksiyon kapsamı. Bir 37 ° C su banyosu içinde, steril Kalsiyum-Magnezyum içermeyen Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (CMF-HBSS) bir şişe ısıtın. Sıcak CMF-HBSS ile tam 3/4 100 mm steril Petri kapları doldurun.
- Başka bir temiz diseksiyon mikroskobu altında elektroporasyon odasına yerleştirin ve plazmid çözüm 120 ul ile doldurun. Elektroporasyon aparatı elektrotları geç yapmaEmin ısmarlama elektrot negatif kutbuna bağlı olan ve altın pozitif kutup elektrodu uçlu.
- Embriyo Koleksiyon:
- % 70 etanol içinde ıslatılmış mendillere kabukları ile silerek yumurta temizleyin. Kültürleri kirlenmesini önlemek için taşıma protokolün geri kalanı boyunca steril prosedür koruyun. Büyük kavisli Moloney forseps kullanarak dikkatlice yavaşça (hava bölmesinin üstünde) bir yumurta yuvarlak ucunda dokunarak ve ardından sürükleyici ve kabuk parçaları çekerek yumurta kabuğunda bir delik açın.
- Forseps başka çift membranlar kaldırmak ve yumurta dışarı karıştırıyordu embriyo toplamak ile (dikkatli olmak embriyo zarar vermemek için). CMF-HBSS ile bir tabak koyun.
NOT: 2.4.4 belirtildiği gibi elektroporasyon için retina bardak istenen sayısını elde etmek için gerektiği kadar embriyolar toplayın - KRİTİK ADIM: Hamburger ve Hamilton 38 göre embriyolar Sahne.
NOT: Optimum verimlilik embriyolar elde etmek içinevre 27 (Şekil 2A) olmalıdır. - Moloney forseps kullanarak kafaları kesilmek suretiyle embriyolar Euthanize.
- Retina Kupaları edinme:
- İnce Dumont cımbız kullanarak, dikkatle gözleri enükleasyon ve yeni bir CMF-HBSS çanak aktarın.
- Optik sinir başı yakınında her göz, arka kısmından başlayarak, iki ince Dumont cımbız kullanarak, nöral zarar vermemeye RPE dikkatli olmak teşrih nöral retina ve RPE ve dikkatle arasındaki cımbız her çiftin bir ipucu tanıtmak Retina (Şekil 2B).
NOT: RPE yardımcı olacaktır çözeltide Ca 2 + ve Mg 2+ eksikliği daha kolay nöral retina ayırmak.
- Elektroporasyon:
- 15 Volt, 50 msn süreli ve 950 msn aralığının 5 kare darbeleri teslim Electroporator parametreleri ayarlayın. Yer 'U' elektroporasyon odası (mikrosantrifüj kapak dolgu içinde negatif elektrot şeklindeplazmid içeren çözeltinin 120 ul) ile ed.
- Kullanımı kavisli Dumont cımbız (değil karıştırıyordu basarak) elektroporasyon odasına tek retina fincan aktarmak ve elektrodun alt ve yukarı bakacak objektif yönüne retinanın arka kısmı ile, 'U' şekilli elektrodun içine yerleştirin ( Şekil 2B).
- Bir sonraki lens, gözün ön kısmını dokunur ve Electroporator ayak pedalı elektrik atımları teslim kullanarak böylece anot yerleştirin.
- CMF-HBSS ile yeni bir Petri kabı elektropore retina fincan aktarın ve kalan retina bardak her biri ile elektroporasyon prosedürü tekrarlayın.
Not: 6 retina bardak kadar transfeksiyon verimi önemli bir azalma olmadan aynı plazmid çözeltisi ile elektropore edilebilir. - Bonn dişli forseps ile onları kavrama ve yavaşça t içinden çekerek her electroporated retina fincan lens ve vitreus vücuda kaldırkavisli Dumont cımbız arkası ile yerinde gözü tutarken o açılış öğrenciye.
- Standart prosedürler izlenerek Electroporated retina hücreleri ayrışma ve kültür geçin.
NOT: civciv retina hücreleri ayrışma ve kültürü üzerinde detaylı bir protokol için Vergara ve Canto-Soler, 2012, Ek dosyaya 4 21 bakın Bu protokolde hücreler poliornitin kaplı 6-kuyucuğu veya 35 düşük yoğunlukta numaralı seribaşı. -mm yemekleri (6 x 10 5 hücre / 35 mm çaplı kuyu veya çanak). Kullanılan ortam penisilin / glutamin, 10% fetal buzağı serumu (FCS) ve 100 ug / ml'de, linoleik asit-BSA ile 199 ortamıdır. Kültürler,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde muhafaza edilir. Bu prosedürü kullanarak, 5-6 x 10 6 hücre genellikle her aşama 27 Electroporated göz başına elde edilebilir.
NOT: İdeal olarak, en fazla 3 saat embriyo toplama ve hücre kaplama arasında geçmelidir, iyi hücre hayatta kalmasını sağlamak içinve stresi en aza indirmek. Gözlem ve daha fazla analiz için tipik bir zamanlama bu noktada hücreler, iyi bir morfolojik ve moleküler farklılaşma elde ettik ve hayatta kalma hala yüksek olduğu için, kültür içinde 4 gün sonra olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada daha sonraki ayrışmış hücre kültürü için çıkartılmış civciv retina bardak içine plazmid transfeksiyon için basit bir protokol mevcut. Transfeksiyon özel elektrotlar (- 2 Şekil 1) hazırlanması kolaydır kullanılarak elektroporasyon ile elde edilmektedir. Bu protokol açıklanan parametreler% 20 ila 27 (Şekil 3D) (% 22 ortalama ile) aralığında transfeksiyon verimliliği elde etmek için optimize edilmiştir. Yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı, bu sonuçlar, kültür içinde 4 gün sonra nicelendirilir, dikkat edin. Bu bağlamda, transfeksiyon verimi, toplam hücre popülasyonu içinde transgen eksprese eden hücrelerin yüzdesini ifade eder. Sadece fotoreseptör nüfus olarak kabul edilirse, transfeksiyon verimlilikleri% 25 ortalama (Şekil 3D) artırmak. Kültürlerin bu tür öncelikle fotoreseptörleri incelemek için kullanılır, çünkü bu önemli bir özelliktir.
Electroporat edilmiş hücre kültürleri Bu teknik kullanılarak ed DIC aydınlatma, hücre hayatta kalması özelliklerine ve bu visinin (yaygın olarak kullanılan bir fotoreseptör belirteci) ile Pax6 1 moleküler markerlerin ekspresyonu altında morfolojisi kendi olmayan elektropore muadilleri ayırt edilemez.
Elektrotların 1. Making Şekil. (A - D) katot kare 'U' şeklinde içine forseps ile ilk doğruldu bir kare kutu filamanın (A), (B) ve daha sonra eğildi üzerinden yapılır (C - D). Anot kalın altın elektrot (D) uçlu olduğu; Ucu açık. (E) Elektroporasyon kurulumu sadece 0.5 mm bırakarak, anot elektrot çevresinde yalıtım dikkat edin. Ankastre kutulu alanın daha büyütülmüş olarak göstermektedir.pg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Elektroporasyon için Retina kupalarında Şekil 2. hazırlanması. RPE dikkatle keskin Dumont cımbız kullanarak enüklee gözlerinden kaldırılır Hamburger ve Hamilton embriyonik evre 27. (B) (A) Civciv embriyo. (C) sağdaki retina fincan RPE yoksun ve elektroporasyon için hazırdır. (D ) katot elektrotu plazmid çözeltisi ile doldurulmuş 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü kapağın yapılmış bir elektroporasyon odasının içine yerleştirilir. Retina fincan dikkatle yukarı bakacak katot aktarılır ve anot elektrot lens yanında, üstüne yerleştirilir. Büyük halini görmek için tıklayınızbu rakamın.
Sonra Kültürlenmiş Hücrelerde transgen ekspresyonu Şekil 3. Verim Elektroporasyon (A - C). Retina bardak ayrılmış ve 4 gün süre ile kültüre, bir GFP ifade plazmidi ile elektroporasyona tabi tutulmuştur. Floresans mikrografları DAPI lekeli çekirdekleri (A) ve GFP eksprese eden retina hücrelerini (B) göstermektedir. Anti-Visinin antikor boyama (C) fotoreseptör hücreleri tanımlamak için yapıldı. (D) Grafik toplam hücre popülasyonunun (pozitif DAPI), aralarında veya fotoreseptör arasındaki ifade eden hücreler GFP yüzdesi olarak ifade elektroporasyon ovo ex elde transfeksiyon verimi, gösteren Özellikle nüfus (Visinin pozitif). Sonuçlar 5 bağımsız deneyin ortalama ± SEM temsil eder. Ölçek çubuğu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün başarısı için en kritik adım embriyoların uygun sahne seçmektir. Önceki yayınlarda, embriyonik gelişim evrelerinin bir dizi tipik kuluçka veya embriyonik gün gün (ED) tarafından tanımlanan, bu kültürlerin verilir; Böylece genellikle ED 6 embriyolar ED 5 kullanarak eşdeğer sonuçlar verecektir varsayılmaktadır. Bununla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi sahne 27 (ED 5) üzerine, transfeksiyon verimi, toplam hücre nüfusunun yaklaşık% 22 olacak olduğunu bulmuşlardır; Henüz verim evre evre 29 28 embriyolar (ED 5.5) ve% 12 (ED 6) kullanıyorsanız% 16 azalma 1. edecektir Diğer kritik adımlar süreci boyunca steril koşullar muhafaza içerir; Gerekli el becerisi edinme diseksiyon ve elektroporasyon sırasında retina zarar görmemesi için; ve hücre kaplamanın zaman embriyo toplama zamanında uzun boşluklar kaçınılır.
Bir diğer önemli husus iyi transfeksiyon efficien sağlamak içinleri plazmid içeren çözeltinin konsantrasyonu: önerilen 1.5 ug / ml, etkinlik ile bir azalmaya neden olmadığını test edilen en düşük konsantrasyondur. Retinal bardak bu çözelti içinde yıkanmış olduğunu göz önüne alındığında, bu konsantrasyon plazmid malzemenin yüksek miktarda anlamına gelir. (Böyle bir mikrosantrifüj tüpü kapağının gibi) göz karşılayacak küçük boyut kuyusu kullanarak bu sorunu en aza indirebilir. Buna ek olarak, pek çok gözün aynı çözelti kullanılarak elektroporasyona edilebilir; Aynı plazmid çözüm ardışık 6 retina bardak kadar electroporating biz verimliliğinde bir azalma görmedim, ve daha büyük olasılıkla yapılabilir ama biz bundan sonra verimlilik farkı kanıtı olamaz.
Daha önce yayınlanmış protokoller genellikle kültür bu tür gen transferinin düşük verimlilik sağladık ve böylece genellikle bir hücre l üzerinde enzimatik reaksiyonların ürünü ölçen tekniklerine güvenmek zorundaduyarlılığını artırmak amacıyla ysate. Böyle bir yaklaşım, hücre tipi ayrımı için ve her zaman büyük bir hücre popülasyonunun davranışı yansıtıcı olabilir gözlenen sonucun sorumlu olan hücrelerin düşük sayıda güvenmek izin edilememesi gibi bir dezavantaja sahiptir. Düşük verimlilik sorunu aşmak için başka bir yolu önce göz enükleasyon ve kültür, in vivo gen transfeksiyon yapmaktır. Bu uygulanabilir bir yaklaşımdır ama plazmid elektroporasyon ve RCAS virüsü enfeksiyonu (civciv ortak bir gen iletim vektörü) hem tipik erken gelişim aşamalarında yapılması gerekir çünkü genellikle arasında bir zaman farkı yaratarak, sadece belirli deneysel paradigmalar uygulanabilir transfeksiyon ve kültür. Bu zaman süresince hücreler hücre dışındaki mikro yanı sıra hücre içi faktörlerin her ikisi de etkilerine maruz kalan, bu exp yorumlanmasında önemli etkileri olan, önemli bir hususturerimental sonuçlanır. Bunun aksine, elektroporasyon yaklaşımı ovo ex elde gen transfer etkinliğine önemli bir artış, bir hücre-içsel bir şekilde gen fonksiyonlarının araştırılmasında sağlar. Otomatik yüksek verimli hücre analizi 1 ile bağlantılı olarak kullanıldığında Ayrıca bu yüksek transfeksiyon oranı avantajı daha da arttırılabilir.
Bu tekniğin gelişmenin ilk aşamalarında, biz farklı koşullar 1 ile elde elektroporasyon etkinliğini değerlendirmek için 24 saat kültürde RPE yoksun göz bardak elektropore sürdürdü. Biz kez daha uzun süre kültür onları girişimi yoktu, ancak bizim deneyim burada tarif edilen protokol de uygun uzun vadeli eksplant kültür koşulları kullanıldığında sağlanan retina organotipik eksplant güvenerek çalışmalara uygulanabilir belirtir.
Son olarak, inci uygulanabilirliği genişletmek mümkün olacaktırdiğer hayvan modelleri elektroporasyon yaklaşımı ex ovo olduğunu. Bu protokol kullanılarak doğum sonrası gün 1 ya da 4 ° C'de fare gözlerinin deneyim transfeksiyonu Örneğin eksplant kültürlerinde nitelik ölçüde iyi sonuçlar vermiştir, ancak ayrışmış hücre kültürleri teşebbüs edildiğinde transfeksiyon verimi diğer tekniklerin benzer% 6 düzeyinde olmuştur. Böylece, bu hayvan modelinde diğer protokollere basit bir alternatif olabilir, ancak yüksek verimlilik gerekiyorsa belirli bir sistem için optimize edilmesi gerekir. Unutmayın ki, yukarıda da belirtildiği gibi, elektroporasyon sırasında embriyonik aşama civciv elde edilen yüksek verim sonuca önemli olduğunu, bu yüzden diğer modellere tekniğini uygularken bu parametre dikkate alınmalıdır.
Güçlü araçlar in vivo çalışmalar tamamlayıcı olarak Sonuç olarak, elektroporasyon tekniği ex ovo n sunan in vitro retina sistemlerin uygulanabilirliği genişletebilirsinizRetina araştırma için ew olasılıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco - Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1x2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width |
References
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
- Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
- Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
- Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
- Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T.
- Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
- Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
- Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
- Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
- Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
- Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z.
- Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
- Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
- Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
- Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
- Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
- Adler, R.
- Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
- Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
- Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
- Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
- Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
- Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
- Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
- Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
- Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
- Hughes, S. H.
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
- Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
