Ileokolische Resektion wird häufig bei verschiedenen menschlichen Krankheiten durchgeführt; es ist jedoch wenig über den Einfluss der Darmresektion auf chirurgische Erkrankungen bekannt. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens bei Mäusen mit hohem Erfolg und bietet ein Mittel, um die Auswirkungen der ileokolischen Resektion in Krankheitsmodellen zu untersuchen.
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Methodenartikel
Murine Ileocolische Darmresektion mit primärer Anastomose
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Darmresektionen sind häufig zur Behandlung von Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts erforderlich, wobei Morbus Crohn und Darmkrebs zwei häufige Beispiele sind. Trotz der Häufigkeit dieser Verfahren besteht nach wie vor eine erhebliche Wissenslücke bei der Beschreibung der inhärenten Auswirkungen der Darmresektion auf die Physiologie des Wirts und die Pathophysiologie der Krankheit. Dieser Artikel enthält detaillierte Anweisungen für eine ileokolische Resektion mit primärer End-to-End-Anastomose bei Mäusen sowie wesentliche Aspekte der perioperativen Versorgung zur Maximierung des postoperativen Erfolgs. Bei genauer Befolgung führt dieses Verfahren zu einer Langzeitüberlebensrate von 95 %, ohne Gedeihstörungen und minimiert postoperative Komplikationen wie Darmverschluss und Anastomosenleck. Die technischen Herausforderungen bei der Durchführung des Verfahrens an Mäusen sind ein Hindernis für seine breite Anwendung in der Forschung. Die in diesem Artikel beschriebenen Fähigkeiten können ohne chirurgische Vorkenntnisse erworben werden. Sobald das murine ileokolische Resektionsverfahren beherrscht wird, wird es ein reproduzierbares Werkzeug zur Untersuchung der Auswirkungen der Darmresektion in Modellen menschlicher Krankheiten bieten.
Einleitung
Ileokolische Resektion (ICR) ist ein gängiges Verfahren, das sowohl in Notsituationen als auch in elektiven Situationen für eine Vielzahl von Krankheiten durchgeführt wird. Morbus Crohn und Dickdarmkrebs sind die beiden häufigsten Indikationen für ICR. Bei beiden Erkrankungen stellt das Wiederauftreten im Darm an der Operationsstelle ein großes klinisches Problem dar. Die Lokalrezidivraten bei Dickdarmkrebs bleiben selbst bei den aggressivsten Resektionen ein Problem1. Nach ICR bei Morbus Crohn tritt die Erkrankung am häufigsten (in bis zu 80%) im neoterminalen Ileum 1 Jahr nach der Operation wieder auf2. Angesichts der Auswirkungen dieser beiden Erkrankungen und ihres Wiederauftretens nach der Operation ist es wichtig, die lokalen Darmfaktoren nach ICR zu verstehen, die einen intrinsischen Einfluss auf den natürlichen Verlauf dieser Krankheiten haben können. Darüber hinaus ist es auch wichtig, die Anastomosenheilung nach ICR in Betracht zu ziehen. In der frühen postoperativen Phase können Anastomosenlecks verheerende Folgen für die Patienten haben, was zu wiederholten Operationen, Stomabildung, erheblicher Morbidität und sogar Mortalität führenkann 3. Trotz der Bedeutung dieses Themas steckt unser heutiges Verständnis der Anastomosenheilung als Forschungsgegenstand noch in den Kinderschuhen. Tiermodelle der ICR, insbesondere von Mäusen, sind eine hervorragende Plattform für die Untersuchung der Darm- und Anastomosenheilung nach Operationen.
Ein Mausmodell der ICR wurde ursprünglich von Helmrath et al. entwickelt, um als Modell des Kurzdarmsyndroms verwendet zu werden4. Die Autoren experimentierten mit verschiedenen Diätregimentern und Nahtgrößen, um das Überleben der Tiere nach ICR zu optimieren. Sie kamen zu dem Schluss, dass die Fütterung mit flüssiger Nahrung in der perioperativen Phase und die Verwendung von 9-0 monofilen Nähten zu einem optimalen postoperativen Überleben von 88% führte. Seit dieser ersten Veröffentlichung wurde ICR bei Mäusen, die 50% des Dünndarms entfernen, in mehreren Studien eingesetzt, um die Dynamik der massiven Dünndarmresektion und die adaptive Wachstumsreaktion zu untersuchen, um neue Therapien für das Kurzdarmsyndrom zu entwickeln5,6.
Die erste Anwendung des ICR-Mausmodells bei Morbus Crohn verwendete das IL-10-/- Mausmodell, das spontan Colitisentwickelt 7. Die Autoren fanden heraus, dass diese Tiere nach ICR eine Entzündung im neoterminalen Ileum entwickelten, die der bei postoperativen Morbus Crohn-Patienten beobachtet wurde, und dass diese Entzündung von der Anwesenheit von Bakterien abhängig war7. In jüngerer Zeit wurde dieses Modell verwendet, um bakterielle Veränderungen zu untersuchen, die durch ICR induziert werden. Bei Morbus Crohn geht eine Dysbiose mit einer relativen Abnahme von Bakterien einher, von denen bekannt ist, dass sie entzündungshemmende Eigenschaften haben, und einer Zunahme invasiver Bakterienarten8,9. Der Zusammenhang gilt für Fälle von postoperativen Rezidiven10. In zwei Studien wurde versucht, mikrobielle Veränderungen zu identifizieren, die sich aus ICR ergeben. Die erste Studie verwendete IL-10-Null-Mäuse und führte eine denaturierende Gelelektrophorese durch, um die bakterielle Ähnlichkeit zwischen Dünndarm und Dickdarm nach ICR11 zu vergleichen. Diese Studie zeigte, dass sich die Bakterienpopulationen im Dünndarm und Dickdarm nach der ICR ähnlich entwickelten. In einer nachfolgenden Studie wurden Wildtyp-Mäuse und 16s-Pyrosequenzierung zur phylogenetischen Klassifizierung von Bakterienarten nach der Operation verwendet. Diese Studie zeigte eine deutliche Verschiebung der Bakterienarten, die allein durch die Operation verursacht wurde, wobei Clostridium-Arten dominant wurden, sowie eine Zunahme von Υ-Proteobakterien. Die Ergebnisse bestätigten auch die Ergebnisse der vorangegangenen Studie mit ähnlichen Populationen, die nach ICR12 im Dünndarm und Dickdarm gefunden wurden.
ICR ist ein häufiges Verfahren für Patienten mit Dickdarmkrebs, der den Blinddarm und den aufsteigenden Dickdarm betrifft, und es wird zunehmend erkannt, dass die Wirtsreaktion auf eine Operation wahrscheinlich sowohl zum lokalen als auch zum fernen Tumorrezidiv beiträgt13. Trotz dieser Beobachtung wurden ICR-Modelle nicht für die Untersuchung von Darmkrebs und postoperativem Rezidiv verwendet. Das Verständnis sowohl der systemischen als auch der lokalen immunologischen Veränderungen, die sich aus der ICR ergeben, wird für die Erforschung zukünftiger Therapien wichtig sein. Zu den möglichen Signalwegen, die am Wiederauftreten von Krebs nach ICR beteiligt sind, gehören die Hochregulierung von Wachstumsfaktoren, die Zellen vor der Apoptose retten und die Proliferation stimulieren können, die mechanische Tumorzerstörung durch Zellablösung und der Verlust der Immunüberwachung durch postoperative Immunsuppression13,14.
Mausmodelle der ICR haben das Potenzial, ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung des Kurzdarmsyndroms, Morbus Crohn und Dickdarmkrebs zu sein. Sie können auch Lehren darüber liefern, wie frühe postoperative Anastomosenkomplikationen verhindert werden können, indem sie die zellulären und biochemischen Signalwege, die an der Heilung der neu konstruierten Anastomose beteiligt sind, weiter definieren. Ein großes Hindernis bei der Verwendung des murinen ICR-Modells ist die technische Schwierigkeit. Die intestinale Anastomose erfordert die Verwendung von 8-0 oder 9-0-Naht, ein Operationsmikroskop und eine Schulung in mikrochirurgischen Techniken. Das Ziel dieses Artikels ist es, klare Anweisungen zur Durchführung von ICR bei Mäusen zu geben, mit dem Ziel, dieses Verfahren in Krankheitsmodellen einzusetzen.
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Protokoll
Tiernutzung Protokolle wurden von der Health Science Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität von Alberta genehmigt.
1. Herstellung der Instrumente, Tiere und Operative-Setup
- Übertragen Tieren zu einem neuen, sauberen Käfig abwesend aller feste Nahrung 24 Stunden vor dem Eingriff. Sie können den freien Zugang zu Wasser und flüssige Diät ad lib bis zum Zeitpunkt des Verfahrens.
- Autoklav alle für das Verfahren erforderlichen Instrumente. Saubere Arbeitsfläche und Narkosenasenkegel mit 70% Ethanol.
- Richten Sie die Arbeitsfläche mit Operationsmikroskop, Narkosegerät und Zubehör in einer Weise, die angenehm für den Operateur ist. Die Ellenbogen des Chirurgen sollte erlaubt werden, um bequem auf dem OP-Tisch liegen, mit Händen und Armen unbehindert durch Ausrüstung. Instrumente, Nahtmaterial, Wattestäbchen und eine 10-ml-Spritze sollte an einem Ort, die einen einfachen Zugang während des Verfahrens ermöglicht platziert werden.
- EinrichtenOverhead-Wärmelampen, sowohl Wärme für das Tier während des Verfahrens und Licht für die Arbeitsfläche bereitzustellen.
- Füllen Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit 0,9% Kochsalzlösung und eine 1,5-ml-Röhrchen mit Vaseline und Ort in der Nähe der Arbeitsfläche.
HINWEIS: Sterilisieren alle Instrumente und OP-Bedarf. Da der Darm durchtrennt, ist das Verfahren selbst nicht steril. Es wird als Rein verunreinigt. Ergreifen Sie Maßnahmen, um die Einführung von exogenen Quellen von Infektionen zu vermeiden.
2. Ileocolische Resektion mit Anastomose
- Anästhesie zu induzieren durch Verabreichen von 4% Isofluran mit einer Sauerstofffließgeschwindigkeit von 2 L / min über Nasenkegel von der Isofluran-Verdampfer, bis die Tiere Atmungsrate verlangsamt etwa 30-40 Atemzüge / min. Mit mäßigem Druck auf den Hinterfuß der Maus, um sicherzustellen, gibt es keine Schmerzreaktion vor der Einleitung des Verfahrens. An dieser Stelle, drehen Sie Isofluran bis 2% und Sauerstofffluss auf 0,5 l / min. IntermittierendCheck Schmerzreaktion während des Verfahrens und stellen Isofluran Flussrate entsprechend.
- Vaseline in die Augen, um das Trocknen während der Operation zu verhindern und zu immobilisieren die Maus in die Rückenlage mit Gliedmaßen mit durchsichtigem Klebeband gesichert.
- Reinigen Sie den Bauch mit povodine / Jodlösung, und wechseln Sie in neue sterile Handschuhe.
- Machen Sie eine 1,5 cm Hautschnitt in der oberen Mittellinie des Bauches mit scharfen Punkt Dissektionsscheren die Faszien und Peritoneum aussetzen. Öffnen Sie die Faszien / Bauchfellschicht in ähnlicher Weise durch die Linea alba in die Bauch Inhalten aussetzen.
- Im Gegensatz zum Menschen, wird die Maus Blinddarm typischerweise im linken oberen Quadranten des Abdomens. Einmal identifiziert, sanft erfassen die Blinddarm mit einer Pinzette und bringt sie durch den Schnitt. Verwenden feuchten Wattetupfer auffächern etwa 3 cm von terminalen Ileum, der sich vom Blinddarm über eine sterile Gaze auf der Bauchfläche (1A) drapiert.Sicherzustellen, dass die freiliegenden Darm während der Gesamtheit des Verfahrens feucht mit 0,9% Kochsalzlösung aufbewahrt.
- Identifizieren Sie die ileozökalen Arterie abzweigt A. mesenterica superior entlang des Dickdarms (1A) mit dem Operationsmikroskop. Präparieren Sie sich die avaskuläre Gewebe neben dem ileozökalen Arterie, einzukreisen und zu ligieren die Arterie mit einem 5-0 Seidenkrawatte. Nächstes den regionalen Blutversorgung des terminalen Ileum und wählen Sie eine Durchtrennung Punkt 1,5-2 cm proximal der ileozökalen Kreuzung. Ligieren die Zweige zu diesem Abschnitt des Ileum wie oben. Teilen Sie die Arterien mit Mikro Dissektionsscheren.
- Teilen Sie die ischämische Bereiche des Ileum und Colon gewährleisten eine ausreichende Blutzufuhr zu den durchtrennten Enden (Abbildung 1B). Es ist oft hilfreich, um die Ileum durch Teilung in einem 30 Grad Winkel, um den Durchmesser des Lumens zu erhöhen, damit es den Dickdarm eher entspricht spatelförmig. Sobald der ileozökalen Teil Darm entfernt wurde, ausrichtentrennten Enden des Ileum und Colon auf die Gaze, die Gewährleistung der mesenterialen Grenzen jeweils ausgerichtet sind.
- Konstruieren Sie die Anastomose durch Annähern der durchtrennten Ende Ileum zum durchtrennten Ende Dick Verwendung unterbrochen 8-0 Polypropylen Nähte (Abbildung 1c). Der erste Stich wird an der mesenterialen Rand platziert, mit anschließender Nähte platziert alle 0,5 mm, bis die Ileocolische Anastomose wasserdicht ist. Beim Passieren der Nähnadel durch das Ileum und Kolon, sicherzustellen, dass die Schnittkante nicht gerollt wird, und die Nadelstiche sind 0,5 mm von den Schnittkanten des Darms. Eine typische Anastomose erfordert 14 bis 16 Einzelnähten. Testen Sie die Integrität und die Durchgängigkeit der Anastomose nach Fertigstellung durch Walzen ein Wattestäbchen proximal nach distal über das Ileum, Inhalte durch die Anastomose zu erzwingen. Dünndarminhalt sollte sich frei in den Dickdarm, ohne Anastomoseninsuffizienz geben.
- Spülung des belichteten Darm mit 3-4 ml 0,9% iger Kochsalzlösung aus der 10 ml Spritzevon der Oberfläche des Darms abzuwaschen Stuhl, und liefern Darm wieder in die Bauchhöhle. Mit 2 ml 0,9% Kochsalzlösung spülen Bauchhöhle, und dann abtropfen lassen diese Flüssigkeit durch leichten Druck auf die Bauchwand seitlich.
- Schließen Sie den Schnitt mit einem 3-0 Seidenfortlaufende Naht, und die Strömung von Isofluran einzustellen. Verwalten 0,1 mg / kg des lang wirkenden Opiat -buprenorphine- subkutan zur postoperativen Schmerzkontrolle.
- Beachten Sie die Tiere unter der Wärmelampe, bis sie sind mobil übertragen sie dann auf eine kontinuierlich erwärmt Käfig.
3. Postoperative Pflege und Überwachung
- Überwachung Tiere in einem kontinuierlich erwärmt Käfig für Anzeichen von Leiden für den Rest des Tages. Übertragen Tiere zurück in die Tierstation in einer neuen sterilen Käfig mit Zugang zu flüssigen Nahrung und Wasser ad lib. Die Tiere können in Gruppen von 3-4 untergebracht werden.
- Führen Sie eine Überprüfung der postoperativen Tiere am nächsten Morgen,sicherzustellen, dass die Tiere nicht in der Not erscheinen. Feed-nur flüssige Nahrung. Wenn sie unbequem (dh gekrümmte Haltung oder minimale Aktivität) erscheinen zu verwalten eine zusätzliche Dosis von subkutan Buprenorphin. Überprüfen Sie auf die Tiere noch einmal am Nachmittag am postoperativen Tag 1.
- Am Morgen des postoperativen Tag 2 sollte die Tiere vollständig erholt erscheinen. Der Nachweis der Lebensmittelkonsum und stooling sind positive Anzeichen für eine Erholung. Nun, wieder eine solide Chow-Diät für die Tiere.
HINWEIS: Anzeichen von Leiden sind gekrümmte Haltung, schlechte Pflege und minimale Aktivität. Wenn Anzeichen von Leiden sind prominente sollten die Tiere eingeschläfert werden. - Euthanize die Tiere durch Induktion tiefe Narkose mit 4% Isofluran in einem O 2 Strömungsgeschwindigkeit von 2 L / min, bis Tiere reagieren nicht auf Fußdruck. Führen Genickbruch, und beobachten Sie auf Anzeichen von richtigen Euthanasie.
- Richtlinien variieren, so finden Sie in den Institutionen Empfehlungen für Indikationenfür und geeignete Methoden der Euthanasie bei Mäusen.
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Ergebnisse
Sterblichkeit und Gewichtsveränderung nach der OP.
Die Sterblichkeitsraten folgenden ICR in 129S1 Wildtyp-Mäusen in der Regel ~ 5%. Die häufigste Ursache der Moral ist Darmverschluss an der Anastomose. Andere Todesursachen gehören Anastomoseninsuffizienz und interne Hernie, die zu Verstopfung Darm.
Gewichtsverlust kann bis zu 14 Tage nach der Operation zu sehen ist, ist jedoch im allgemeinen nicht signifikant. Mäuse sind in der Regel präoperativen Gewicht komplett wieder von po...
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Diskussion
Die murine ICR ist ein leistungsfähiges Modell, das verwendet werden kann, um die Auswirkungen der Operation bei Darmerkrankungen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Durchführung ICR bei Mäusen mit einer Erfolgsquote von 95% und keine Probleme mit Gedeihstörungen wie durch stabile Gewichte reflektiert bis zu 28 Tage nach dem Eingriff. Die wichtigsten Herausforderungen für die erfolgreiche ICR gehören die Vermeidung Darm Hindernisse an der Anastomose und Anastomosen Lecks.
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen
Danksagungen
Wir möchten uns bei den finanziellen Beiträgen des Canadian Surgical Research Fund, des Edmonton Civic Employees Research Assistance Fund und des Alberta IBD Consortium durch einen Zuschuss von Alberta Innovates bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| LD101 flüssiges Nagetierfutter | testdiet.com | ||
| 0,9 % NaCl | Baxter | FKE1324 | Injektionsqualität Kochsalzlösung |
| Operationsmikroskop | Ziess | ||
| Isofluran Anästhesieverdampfer | Harvard Apparat | 34-0483 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| Glasplatte | Für Bedienoberfläche | ||
| Wattestäbchen | |||
| Micro Castroviejo Nadelhalter, gebogen | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo gerade Schere | World Precision Instruments | 555530S | |
| Präparierschere | World Precision Instruments | 15922 | |
| Verbandszange x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 Seide vorgeschnittene Nähte | Ethicon | A182H | Für die Gefäßligatur |
| 8-0 Prolene auf BV130-5 Nadel | Ethicon | 8732H | Für Anastomose |
| 3-0 Seide auf FS-2 Nadeln | Ethicon | 8665G | Für den Bauchwandverschluss |
| Vaseline | Vaseline | ||
| 10 ml Spritze | BD biosciences | ||
| Povidon-Jod 7,5 % chirurgisch Scrub | betadine.com | ||
| Wärmelampen | |||
| Buprenorphin 0,3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
Referenzen
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