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Methodenartikel

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur In-vivo- Optical Imaging

15.6K Aufrufe

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DOI:

10.3791/52136

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5. Januar 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Verwendung von Fluorophoren für die In-vivo-Bildgebung kann durch Opsonisierung, schnelle Clearance, geringe Nachweisempfindlichkeit und zytotoxische Effekte auf den Wirt stark eingeschränkt werden. Die Verkapselung von Fluorophoren in Liposomen durch Filmhydratation und Extrusion führt zu einer Fluoreszenzlöschung und einem Schutz, der eine in vivo-Bildgebung mit hoher Nachweisempfindlichkeit ermöglicht.

Zusammenfassung

Optische Bildgebung bietet eine breite Palette von diagnostischen Modalitäten und hat als Werkzeug für die biomedizinische Bildgebung großes Interesse geweckt. Trotz der enormen Anzahl derzeit verfügbarer bildgebender Verfahren und der Fortschritte in der Instrumentierung besteht nach wie vor ein Bedarf an hochempfindlichen Sonden, die für die In-vivo-Bildgebung geeignet sind. Ein typisches Problem der verfügbaren präklinischen Fluoreszenzsonden ist ihre schnelle Clearance in vivo, was ihre Bildgebungsempfindlichkeit verringert. Um eine schnelle Clearance zu umgehen, die Anzahl der Farbstoffmoleküle an der Zielstelle zu erhöhen und dadurch die Hintergrundautofluoreszenz zu reduzieren, wurde die Verkapselung des Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoffs DY-676-COOH in Liposomen und die Überprüfung seines Potenzials für die In-vivo-Bildgebung von Entzündungen durchgeführt. DY-676 ist bekannt für seine Fähigkeit, sich bei hohen Konzentrationen selbst zu löschen. Wir bestimmten zunächst die für die Selbstabschreckung geeignete Konzentration und verkapselten diese Abschreckkonzentration dann in das wässrige Innere von PEGylierten Liposomen. Um das Quenching- und Aktivierungspotenzial der Liposomen zu untermauern, verwenden wir eine harte Gefriermethode, die zu einer Schädigung der liposomalen Membranen führt, ohne den verkapselten Farbstoff zu beeinflussen. Die Liposomen, die sich durch eine hohe Fluoreszenzlöschung auszeichneten, wurden als Lip-Q bezeichnet. Wir zeigen durch Experimente mit verschiedenen Zelllinien, dass die Aufnahme von Lip-Q überwiegend durch Phagozytose erfolgt, was wiederum die Charakterisierung seines Potenzials als Werkzeug für die in vivo Bildgebung von Entzündungen in Mausmodellen ermöglichte. Darüber hinaus verwenden wir ein Zymosan-induziertes Ödemmodell in Mäusen, um das Potenzial von Lip-Q in der optischen Bildgebung von Entzündungen in vivo zu untermauern. Unter Berücksichtigung einer möglichen Aufnahme aufgrund eines entzündungsinduzierten Effekts mit erhöhter Permeabilität und Retention (EPR) wurde eine Always-on-Liposomenformulierung mit niedriger, nicht abgeschreckter Konzentration von DY-676-COOH (als Lip-dQ bezeichnet) und dem freien DY-676-COOH in Tierversuchen mit Lip-Q verglichen.

Einleitung

Liposomen wurden intensiv untersucht und als eine der biokompatiblen biomedizinischen Arzneimittelabgabesysteme für klinische Anwendungen 1,2. Sie werden hauptsächlich aus Phospholipiden und Cholesterin, die beide biokompatible Verbindungen nachahmen Teile Natur Zellmembranen besteht. Erwägung, hydrophilen Substanzen können in dem wässrigen Innenraum eingeschlossen werden können lipophile Wirkstoffe in der Liposomen-Phospholipid-Doppelschicht 3 eingebracht werden. Einkapselung von Stoffen in wässrigen Inneren von Liposomen gewährt Schutz gegen Abbau in vivo und verhindert auch das Host-System von toxischen Wirkungen von Zytostatika für die Therapie von Krankheiten verwendet werden, zum Beispiel Chemotherapeutika auf die Zerstörung von Tumorzellen gerichtet. Die Modifikation der liposomalen Oberfläche mit Polymeren, wie Polyethylenglycol (PEGylierung) erweitert die liposomale Blutzirkulationszeit in vivo aufgrund sterischer Stabilisierung 4. MoreovER, Liposomen können hohe Konzentrationen von mehreren Substanzen, wie Proteine ​​5,6, hydrophilen Substanzen 7,8 und Enzyme 9 sequestrieren. Sie dienen somit als zuverlässige klinische therapeutische und diagnostische Instrumente, die ihre Zustimmung für die Lieferung von Zytostatika verdienen wie Doxorubicin für die Krebstherapie 4. Aufgrund ihrer Flexibilität können Liposomen auch mit Fluorochromen für diagnostische und bildgeführte chirurgische Zwecke geladen werden.

Fluoreszenz-Bildgebung liefert eine kostengünstige und nicht-invasive in vivo-Diagnosewerkzeug, erfordert jedoch einige grundlegende Anforderungen. Es konnte gezeigt werden, dass Fluoreszenzfarbstoffe, die am besten für die in-vivo-Bildgebung angepasst haben charakteristische Absorptions- und Emissionsmaxima im Bereich, wo Lichtverteilung und Streuung sowie Gewebeautofluoreszenz aus dem Wasser stamm und Hämoglobin ist gering. So haben solche Sonden ihre abs / em Maxima zwischen 650 und 900 nm 10. Außerdem ist die Stabilität von Farbstoffen in vitro und in vivo kritisch, Opsonisierung und schnellen Clearance kann stark ihre Anwendung für die in vivo-Bildgebung 11 begrenzen. Andere Effekte, wie geringe Stabilität und eine geringe Empfindlichkeit oder zytotoxische Wirkung auf Zielorgane wie Indocyaningrün (ICG) 12-16 zu sehen ist, sind unerwünscht und müssen berücksichtigt werden, wenn Sonden für die in-vivo-Bildgebung genommen werden. Diese Beobachtungen haben zur Entwicklung von aktiven verschiedenen präklinischen NIR Fluorochrome, Nanopartikel sowie neue Techniken für die in vivo-Abbildung von Entzündungsprozessen, Krebs und für die bildgeführte Chirurgie 17-20 geführt. Trotz der Stabilität der meisten präklinischen NIRF (Nah-Infrarot-Fluoreszenz) Farbstoffe in vitro, deren rasche Perfusion und Clearance durch die Leber und Nieren, behindern den Einsatz in der in-vivo-optischen Bildgebungs von Erkrankungen und entzündlichen Prozessen.

ntent "> Wir haben daher für die Einkapselung von Farbstoffen stellen ein Protokoll wie das gut charakterisiert Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff DY-676-COOH, das für seine Tendenz bei relativ hohen Konzentrationen 21 in Liposomen bekanntlich Selbst Quench. Bei hohen Konzentrationen H- Dimerbildung und / oder pi-Stapelwechselwirkungen zwischen Fluorophor-Moleküle innerhalb Förster-Radius Ergebnis des jeweils anderen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen den Fluorochrommoleküle entfernt. Bei niedrigen Konzentration in den Raum zwischen den Fluorophor-Moleküle zu, wodurch pi-Stacking-Interaktion zu verhindern, und H-Dimerbildung und dadurch hohe Fluoreszenzemission. Der Wechsel zwischen hoher und niedriger Konzentration und dem begleitenden Fluoreszenzlöschung und die Aktivierung ist eine vielversprechende Strategie, die zur optischen Abbildung 22 ausgenutzt werden kann. In dieser Hinsicht, Verkapselung von hohen Konzentrationen an NIRF-Farbstoff DY-676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen ist fastigen für die in vivo-Bildgebung ist als der freie Farbstoff. Die Aufgabe des Verfahrens liegt vor allem in der richtigen Verkapselung und zweitens bei der Validierung der Vorteile aus Einkapseln hohen Konzentrationen des Farbstoffs resultiert. Vergleich der Abbildungseigenschaften des abgeschreckten Liposomen mit der des freien Farbstoffes und auch mit einem nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit geringer Konzentration des Farbstoffs ist unverzichtbar. Wir zeigen durch eine einfache, aber sehr effektive Filmflüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll in Verbindung mit alternativen Frost-Tau-Zyklen, die Verkapselung von Abschrecken Konzentrationen von DY-676-COOH in Liposomen möglich ist. Andere Methoden, um Liposomen herzustellen, wie die Umkehrphasenverdampfungsverfahren 23 sowie der Ethanol-Injektionsmethode 24 ermöglichen Liposomzubereitung mit hoher Einschlusseffizienz für viele hydrophile Substanzen. Allerdings ist die Art der zu verkapselnden Substanz können die Einkapselungseffizienz beeinflussen. TatsächlichDas hier vorgestellte Film Flüssigkeitszufuhr und Extrusions Protokoll ergeben, die höchste Effizienz für die Verkapselung von DY-676-COOH. Um die Vorteile der liposomalen Verkapselung von DY-676-COOH, einem Zymosan-induzierte Ödem-Modell, das die Untersuchung von Entzündungsprozessen innerhalb von einigen Stunden erlaubt illustrieren, wurde verwendet. Hier wird gezeigt, daß Liposomen mit einer hohen Konzentration des eingekapselten DY-676-COOH in vivo optische Bildgebung von Entzündungsprozessen als der freie Farbstoff oder das nicht-abgeschreckt Liposomenformulierung mit niedriger Farbstoffkonzentrationen besser geeignet für den ganzen Körper. So ist die zugrunde liegende Protokoll bietet eine einfache und schnelle Methode, um abgeschreckt fluoreszierende Liposomen und die Validierung ihrer Aktivierung und Bildgebung Potenzial sowohl in vitro als auch in vivo zu produzieren.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Vorgänge werden von der regionalen Tierausschuss und im Einklang mit internationalen Leitlinien für die ethische Nutzung von Tieren zugelassen.

1. Herstellung der Materialien und Instrumente

  1. Vorbereitung der spontan gebildeten Vesikeldispersion (SFV)
    1. Auflösen und die Stammlösungen der folgenden Phospholipide: 214 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (EPC), 134 mg / ml Cholesterin, 122 mg / ml 1,2-Distearoyl--sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [Methoxy (Polyethylen Glykol) -2000] (Ammoniumsalz) (mPEG 2000 -DSPE) und 2 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 yl) (Ammoniumsalz) (NBD-DOPE) in Chloroform und lagern in Glasfläschchen.
    2. Einrichten ca. 3 ml Chloroform in einem Rundkolben, und übertragen Sie die entsprechende Volumen von Phospholipid-Stammlösung in den Rundkolben zu Liposomen EP, Haft-C: Chol: mPEG 2000 -DSPE in einem Molverhältnis von 6,5: 3: 0,5. Für Doppelfluoreszenzmarkierung von Liposomen hinzufügen 0,3 mol% NBD-DOPE in die Lipid-Lösung.
    3. Nach Abdampfen des Chloroforms aus der organischen Phospholipid-Lösung unter vermindertem Druck (300 mbar) bei 55 ° C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers.
    4. Nachdem eine homogene Phospholipid-Film gebildet wird, verringern den Druck auf 10 mbar für 1-2 Stunden, um restliche Chloroform Anzahlung zu entfernen.
    5. Während das Chloroform verdampft, aufzulösen DY-676-COOH (6,181 uM) in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 und füllen ein Dewar-Gefäß mit flüssigem Stickstoff. Schalten Sie ein Ultraschallbad und bei 50 ° C eingestellt.
    6. Bringen Sie ein geeignetes Volumen (0,5-1 ml) der DY-676-COOH (6,181 uM) Lösung für das Rundkolben, um das trockene Phospholipidfilm und kräftig vortexen, bis ein spontan gebildeten Vesikel (SFV) Dispersion Formen hydratisieren. Sicherstellen, dass alle Phospholipide dispergiert werden, um Lipidverlust zu vermeiden.
    7. Sorgfältig transfer den Rundkolben mit dem SFV Dispersion in flüssigem Stickstoff einfrieren und die Dispersion für 3-5 min. Setzen Sie den Rundkolben in einem Ultraschallbad bei 50 ° C, um die Dispersion auftauen vortexen die Dispersion kräftig 1-2 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal, also insgesamt sieben Frost-Tau-Zyklen.
  2. Extrusion von SFV homogene Liposomvesikel bilden
    1. Übertragen der SFV Dispersion in eine 1 ml Spritze (Spritze-a) und Extrudieren der Dispersion durch ein 100 nm Polycarbonat-Membran mit einem LiposoFast Basis-Extruder in spritzen b.
    2. Extrudieren der Dispersion von der Spritze-b, zurück in die Spritze-a, dann zehnmal wiederholen Sie den Zyklus. Aufgrund der Extrusion der Lösung in der Spritze sich von einem trübes Aussehen auf eine klare Dispersion mit der Zeit. Nach zehn Zyklen (zwanzig Einzelextrusionsschritten) zu entfernen Spritze-b aus dem Gerät und extrudieren die Dispersion für das letzte Mal von der Spritze-a direkt in eine sterile1,5 ml Reaktionsgefäß.
  3. Die Reinigung des liposomal verkapselten DY-676-COOH aus freien Farbstoff
    1. Vorbereiten einer Gelchromatographiesäule mit G25 Kügelchen in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 (Säulenlänge 28 cm, Durchmesser 0,8 cm) eingeweicht.
    2. Übertragen Sie 0,5 ml extrudierte Vesikel-Dispersion auf das Gelbett und lassen Sie die Beispielablauf in die Gelmatrix.
    3. Eluieren die Liposomen mit 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 (Figur 1A) und wäscht die Säule bis die freien Farbstoff restlos aus der Säule. Wenn es sein muss, sammeln und verwerten die freie Farbstoff durch Entsalzung und Austrocknung nach den Anweisungen des Herstellers.
    4. Konzentrieren der eluierten Liposomen durch Ultrazentrifugation (200.000 x g, 2 Stunden bei 8 ° C) und dann zu dispergieren sie in ausreichenden Volumen an sterilem 10 mM Tris-Puffer pH 7,4.
  4. Die Quantifizierung der gekapselten DY-676-COOH-Konzentration
    1. Eine Eichkurve, die durch Auflösen von DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,1% Triton X100.
    2. Löse 2 ul (100 nmol Lipidendkonzentration einer 50 mmol / L stock) der Liposomen für 5 min bei Raumtemperatur in 100 ul Tris-Puffer, der 1% Triton X100, um die Bläschen zu zerstören und Freigabe des eingekapselten Farbstoffes. Dann verdünnte Proben mit 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4 auf eine endgültige Triton-X100-Konzentration von 0,1% (v / v) was ein Gesamtvolumen von 1 ml. Bereiten Sie alle Proben in Doppelbestimmung.
    3. Messung der Absorption und Emission von allen Proben (freie DY-676-COOH und Triton-X100 behandelten Liposomen) bei einer Anregung λ = 645 nm und einer Emissions λ = 700 nm. Herzustellen und verwenden eine Eichkurve des freien Farbstoffs, um die Konzentration des eingekapselten Farbstoffes zu bestimmen.
  5. Liposomen-Charakterisierung
    1. Bestimmen Sie die Größe und Zetapotential der Liposomen durch dynamische Lichtstreuung. Verdünne die liposomalen Proben sterilfiltriert (0,2 um) 10 mM Tris-Puffer pH 7,4 bis aconzentration von 100-300 & mgr; M (Lipid). Übertragen Sie die verdünnten Proben in geringer Lautstärke Einwegküvette und messen Sie die Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Charakterisierung der Liposomen durch Elektronenmikroskopie, um die Größe, die Integrität und Homogenität der liposomalen Vesikel nach Standardprotokollen zu untermauern.

2. Validierung des Fluoreszenz-Abschrecken und Aktivierung der hergestellten Liposomen

  1. Physikalisch-chemische Analyse der Fluoreszenzlöschung und Aktivierung
    1. Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen für die Lip-Q und 2 Röhren für den freien DY-676-COOH. Über 100 nmol Gesamtlipide (2,38 ul einer 42 mmol / l Lip-Q-Stammlösung, enthält 138 ug / ml des verkapselten DY-676-COOH) in die entsprechenden Röhrchen. Ablösefrei DY-676-COOH entspricht der Farbstoffgehalt von Lip-Q (0,38 & mgr; g, die zum Beispiel von 138 g / 1.000 ul x 2,38 ul Lip-Q verwendet, ergibt). Inkubieren einer Wannee jeder Sonde bei 4 ° C und gefrier das zweite Rohr bei -80 ° C über Nacht (16 h).
    2. Heizen Sie einen Heizblock auf 30 ° C. Füllen Sie eine Kühlbox mit Crushed Ice und Gleichgewicht ein Aliquot von 10 mM Tris-Puffer pH 7,4, auf Raumtemperatur.
    3. Sonden entfernen von 4 ° C und bei Raumtemperatur äquilibrieren von -80 ° C auf 30 ° C für 5 min (in Aluminiumfolie eingewickelt, um vor Licht zu schützen), und schnell auftauen Sonden. Kühlen Sie die aufgetauten Proben auf Eis für 1 Minute vor der Übertragung auf Raumtemperatur (auch in Aluminiumfolie eingewickelt, um den Inhalt vor Licht zu schützen).
    4. Zugabe von 10 mM Tris-Puffer (pH 7,4) zu jeder der Sonden auf 100 ul Endvolumen und äquilibrieren alle Sonden bei RT für 10 min.
    5. Pipette 80 ul jeder Sonde in geringer Lautstärke Glasküvette und Messung der Absorption von jeder Sonde 400 bis 900 nm mit einem Spektrometer. Bringen Sie die Sonde in die entsprechenden Röhrchen.
    6. Übertragen wurden 80 ul jeder Probe in einen geeigneten Glasküvetteund Messung der Fluoreszenzemission auf einem Spektrofluorometer von spannenden Sonden bei 674 nm und Messung der Fluoreszenz von 694 bis 800 nm.
  2. Die zelluläre Aufnahme und Fluoreszenz-Aktivierung
    1. Holen Sie sich und Kultur die folgenden Zelllinien in den entsprechenden Nährmedien nach Standardbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 und 95% befeuchteten Atmosphäre). Hier verwenden Sie die Maus-Makrophagen-Zelllinie J774A.1 (Dulbecco mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt), dem menschlichen Glioblastom-Zelllinie U-118 mg (MEM mit essentiellen Vitaminen und 10% (v / v) fötales Kälberserum) und dem menschlichen Fibrosarkom-Zelllinie, HT-1080 (RPMI mit 5% FCS).
    2. Mantel 8-Well-Kammerobjektträger mit Poly-L-Lysin (Add 100 ul 0,001% Poly-L-Lysin in jede Vertiefung und bei 37 ° C für 10 min. Aspirieren Lösung und ließ die Kammer-Objektträgern zu trocknen für mindestens 4 h bei RT auf einem sterilen Werkbank. die Kammer-Objektträgern Spülen 3mal mit 200 ul Hanks Salzlösung versiegeln sie mit Paraffin und Aluminiumfolie und bei 4 ° C bis benötigt.
    3. Während die Kammer-Objektträgern versiegen, Filter-Sterilisation der Liposomen und Farbstofflösung und bei 4 ° C bis benötigt.
    4. Zur Sondenaufnahme Analyse mit dem ganzen Körper in vivo NIR Fluoreszenz-Bildgebungssystem, herzustellen 5 kleine Kulturflaschen für jede der 3-Test-Zellinien (15 Kolben insgesamt). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg und HT-1080-Zellen pro Kulturflasche mit 5 ml des jeweiligen Kulturmediums (in verfünffacht) und wachsen 16-24 Std. Parallel zu den Kulturflaschen, Samen 30.000 Zellen jeder Zelllinie (J774A.1 und HT-1080-) oder 20.000 Zellen (U-118 mg) und 2 Vertiefungen der Schieberkammer jeweils und wachsen in 500 ul Kulturmedium für 16-24 Std .
    5. Am nächsten Tag wird mit 100 nmol (endgültige Lipidmenge) Lip-Q zu 2 Flaschen pro Zelllinie und einer gut jeder Zelllinie an der Kammerobjektträger.Sofortüberweisung 1 Flasche pro Zelllinie bis 4 ° C, und der zweite Kolben zurück in den Inkubator.
      ANMERKUNG: Das Volumen der Sonden in die Kolben gegeben, und die Kammer-Objektträgern die gleichen sind, wodurch die Konzentration auf Kammer-Objektträgern 10-fach höher (5 ml ist, um 500 & mgr; l Kulturmedium). Dies ist notwendig, weil mikroskopischen Nachweis ist weniger empfindlich als die NIR Fluoreszenz-Bildgebungssystem, in dem die Zellpellets aus den Kolben abgebildet werden.
    6. Fügen Sie den kostenlosen DY-676-COOH in einer Konzentration entspricht dem Farbstoffgehalt von Lip-Q an die Zellen in 2 Flaschen pro Zelllinie und einer gut jeder Zelllinie an der Kammer Rutsche, dann sofort übertragen 1 Flasche pro Zelllinie auf 4 ° C (Energieverlust) und der andere Kolben zusammen mit der Kammerobjekt zurück zum Inkubator. Alle Zellen einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei den entsprechenden Bedingungen. Die Zellen in der Flasche ohne Fühler dienen als unbehandelten Kontrolle.
  3. NIRF Bildgebung und semi-quantitative Analyse
    1. Nach 24 Stunden Inkubationsdauer, Ernte der Zellen in Kolben durch Waschen der Zellen 2 mal mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) schaben Zellen in 500 & mgr; l HBSS und Pellet durch Zentrifugation (5 min bei 200 · g) in 500 & mgr; l Röhrchen.
    2. Die Röhrchen mit den Zellpellets (und HBSS) in einer NIRF-Imager und Bild mit Hilfe von Filtern für die Anregung (615-665 nm) und Emissions (Schnitt in> 700 nm).
    3. Abzüglich Autofluoreszenz und bewerten die Intensität der Ziel gegen Autofluoreszenz nach Herstelleranweisungen. Dadurch werden die semi-quantitative Niveaus der Fluoreszenzintensität als Durchschnittssignal (skaliert Zählimpulse / s), der Zählerwerte nach Skalierung für Belichtungszeit Kameraverstärkung, Klassifizierung und Farbtiefe darstellt, so dass die Messwerte untereinander vergleichbar zu ergeben.
  4. Die konfokale mikroskopische Analyse
    1. Nach 24 Stunden Inkubation Ernte der Zellen auf Kammer-Objektträgern durch Auswaschen 2 mal mit 500 ul HBSS.
    2. Befestigen Sie die cells mit 200 ul HBSS, enthaltend 3,7% (v / v) Formaldehyd 30 min bei RT.
    3. Während Fixierung los ist, verdünnen Sie die DNA-Färbung, Hoechst-33258 1:50 mit Montagelösung.
    4. Nach der Fixierung, Waschen Sie die Zellen 2 mal mit HBSS dann trennen die Kammern von den Glasobjektträger. Dann werden 50 ul Befestigungslösung, enthaltend die DNA-Fleck auf jedem Fleck entsprechend den Vertiefungen der Kammer gleitet. Decken Sie die Zellen mit Deckgläsern, versiegeln Kanten mit transparentem Nagellack und der Luft trocknen für 10 min bei RT (dunkel).
    5. Bildzellen auf einem geeigneten Fluoreszenzmikroskop oder konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie die folgenden Anregungs- und Emissions Einstellungen für die Visualisierung der entsprechenden Komponenten: Kerne (Hoechst-33258: Anregung 405 nm, Emission 420 bis 480 nm). NBD-DOPE (liposomale Lipid: Anregung 488 nm, Emission 530 nm). DY-676-COOH (NIR Fluoreszenzfarbstoff: Anregung 633-645 nm, Emission 650 bis 700 nm).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzmikroskop einvailable mit geeigneten Filtern, die Anregungs- und Emissionswellenlängen von mehr als 630 nm zu ermöglichen ausgestattet.

3. Liposomen-basierte In-vivo-Fluoreszenz-Imaging von Entzündungen

  1. Vorbereitung der Tiere und Materialien
    1. Haus 8-12 Wochen alte männliche NMRI-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 36 g unter Standardbedingungen mit Futter und Wasser ad libitum.
    2. Sieben Tage vor dem Start der Experimente geben allen Mäusen eine geringe Pheophorbid Diät, um Gewebeautofluoreszenz zu verringern.
    3. Vierundzwanzig Stunden vor dem Beginn eines jeden Versuchs, rasieren Mäusen in den gewünschten Bereich (zB gesamte Rückenbereich, wenn der Bildhinterbeinödeme gewünscht).
    4. Wiegen Sie die Tiere und die Berechnung der Höhe der Sonde pro Maus (Lip-Q und Lip-dQ bei 10 & mgr; Mol (Lipidkonzentration pro kg Gewicht und frei DY-676-COOH (entspricht injiziert werden) zum Inhalt des Lip-Q verwendet Farbstoff) .
    5. Bild die Tiere ineine Ganzkörper-NIR Fluoreszenz-Imager mit den gleichen Einstellungen für den Zellpellets verwendet. Diese Messung liefert die Autofluoreszenz der Tiere.
    6. Man löst 10 mg Zymosan-A in 1 ml isotonischer Kochsalzlösung und über Nacht lagern bei 4 ° C.
  2. Induktion der Entzündung und in vivo Bildgebung NIRF
    1. Bereiten Sie drei Spritzen pro Maus die folgenden Lösungen mit. Füllen Sie eine Spritze mit 50 ul Zymosan-A-Lösung (10 mg / ml) und die zweite Spritze mit 50 ul isotonische Kochsalzlösung. Füllen Sie die dritte Spritze mit den Sonden, wobei Lip-Q und Lip-dQ (10 mmol / kg Körpergewicht (Lipid)) für Versuchstiere und frei DY-676-COOH (Konzentration wie in Lip-Q) bezeichnet für die Kontrolltiere. Achten Sie darauf, die Sonden mit sterilem HBSS zu 150 ul Endvolumen verdünnt.
    2. Bewerben Augencreme auf die Augen der Tiere bis zur Trockenheit zu vermeiden und zu betäuben Tiere mit 2% Isofluran, bis sie tief eingeschlafen sind und wenn an den Pfoten berührt nicht reagieren (Dies dauert etwa 2 min).
    3. Platzieren Sie die Maus auf eine warme Matte (noch unter Narkose) und injizieren Sie die Zymosan-A-Lösung subkutan am rechten Hinterbein und die Salzlösung auf der linken Hinterbein. Injizieren Sie sich sofort die Sonde intravenös und Bild das Tier danach dann der Rekordzeit von Injektion / Messung (als t = 0 h). Speichern Sie die Bilder als Bildwürfel und wiederholen Sie die Schritte für alle anderen Tiere und jeweiligen Sonden.
    4. Bild die Tiere alle 2 Stunden für 10 Stunden nach der Injektion und dann nach 24 Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Phase der Messkammer ist warm (zum Beispiel, indem Sie eine warme Matte unten), um Unterkühlung zu vermeiden. Nach jeder Messung wird, legen Sie die Tiere in einem Käfig mit Futter und Wasser ad libitum und platzieren Sie den Käfig in einem gemäßigten Tierkammer. Euthanize die Tiere durch erste Betäubung mit 2% Isofluran, bis die Tiere nicht mehr auf Berührung reagieren, dann einschläfern mit Kohlendioxid für 5-10 Minuten, so dasssicher sein, dass die Tiere aufhören zu atmen vollständig und Totenstarre eintritt.
    5. Sezieren die Mäuse nach Standardprotokollen, die Online beurteilt werden kann (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) und Bild Organe.
    6. Auswerten der Messergebnisse nach den Anweisungen des Herstellers durch erste Abzug der Gesamtfluoreszenz der Tiere (Entmischung) dann Zuweisen Regionen von Interesse für die Autofluoreszenz (linke Hinterbein mit Kochsalzlösung) und Ziel Fluoreszenz entzündeten Bereich (rechte Hinterbein mit Zymosan-A).

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Ergebnisse

Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff DY676-COOH in wäßrigen Innenraum von Liposomen verwendet hier führt zu einem hohen Niveau der Fluoreszenzlöschung. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren in hoher Konzentration zu sehen ist, kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, wo eine hohe Empfindlichkeit und eine zuverlässige Detektion des Zielgebiets gefordert werden ausgenutzt werden. Die Verwendung von Liposomen bietet auch...

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Diskussion

Da Liposomen kann auch als Trägersysteme für Fluoreszenzfarbstoffe dienen, Abbildung von Zielkrankheiten ermöglichen sie. Die Verkapselung von hohen Konzentrationen von fluoreszierenden Farbstoffen, wie den NIRF-Farbstoff, DY676-COOH hier verwendet, führt zu einem hohen Maß an Fluoreszenzlöschung des eingeschlossenen Farbstoff. Fluoreszenzlöschung, ein Phänomen mit vielen Fluorophoren zu sehen in einer hohen Konzentration kann in verschiedenen in vivo-Abbildungsanwendungen, bei denen eine hohe Empfindlichkeit u...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft Zuschüsse HALLO-698 / 10-1 und RU-1652 / 1-1 unterstützt. Wir danken Doreen Mai für hervorragende technische Unterstützung und das Unternehmen Dyomics GmbH, Jena für die freundliche Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Materialien und Ausrüstungen zur Herstellung von Liposomen
Ei PhospahtidylcholinAvanti Polar Lipids840051PIn Chloroform auflösen und in Glasfläschchen aufbewahren (214 mg/ml)
CholesterinSigmaC8667Chloroform auflösen und in Glasfläschchen aufbewahren (134 mg/ml)
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz)Avanti Polare Lipide880120PChloroform auflösen und in Glasfläschchen (122 mg/ml)
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(7-nitro-2-1, 3-Benzoxadiazol-4-yl) (Ammoniumsalz)Avanti Polar Lipids810145PChloroform auflösen und in Glasfläschchen (2 mg/ml) lagernSartorius
MC1 (d = 0,01 mg)Sartorius AGResearch RC 210 Pzur Verwiegung der Phospholipide
RotavaporBü chi Labortechnik AGR-114zur Hydratation des Phospholipidfilms
WasserbadBü chi Labortechnik AGR-481zur Hydratation von Phospholipidfilmen
VakuumcontrollerBü chi Labortechnik AGB-720zur Hydratation von Phospholipidfilm
VacoboxBü chi Labortechnik AGB-177zur Hydratation von Phospholipidfilmen Umlaufkühler
LAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230zur Hydratation von Phospholipidfilmen
verwendet DY-676-COOHDyomics GmbH676-00In 10 mM Tris auflösen und Lagerbestand bei -20°; C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanApplichemA1086Puffer 10 mM, pH 7,4
TrichlormethanCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2zur Liposomenaufbereitung
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hzur Liposomenaufbereitung
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, Nr. 146-3011-00)Scientific Industries Inc.SI-0256zur Herstellung von Liposomen
Sephadex G25 mediumGE Healthcare Europe GmbH17-0033-01zur Liposomenaufreinigung
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002zur Destruktion von Liposomen  zur Farbstoffquantifizierung
LiposoFast-BasicAvestin Inc.zur Extrusion von Liposomen
Polycarbonat-Filtermembran, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0,1 U)VWRzur Extrusion von Liposomen über LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechzur Farbstoffquantifizierung
Zetasizer Nano ZSMalvernzur Bestimmung der Liposomengröße und des Zetapotentials
Ultrazentrifuge Beckmann Coulter GmbHXL 80zur Aufkonzentrierung der Proben
RotorBeckmann Coulter GmbHSW 55 TIzur Aufkonzentrierung der Proben
Materialien und Geräte zur Auswertung von Liposomen und optischer Bildgebung
Zymosan-A aus Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGzur Induktion von Entzündungen
Isotonische Kochsalzlösung (0,9%)Fresenius GmbHPZN-2159621zur Verdünnung von Zymosan-A
Isofluran-VerdampferOhmeda Isotec 4zur Betäubung von Tieren
IsofluranActavis GmbHPZN-7253744Anästhesie-Thermomatte
Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20zur Warmhaltung von Tieren während der Anästhesie
Omnican-F (1 ml Injektion)BraunPZN-3115465zur subkutanen und intravenösen Applikation von Sonden
Panthenol AugencremeJenapharmPZN-3524531zur Vorbeugung von Augentrockenheit bei Tieren während der Anästhesie
Hanks gepufferte KochsalzlösungPAA Laboratories /Biochrom AGL2045ohne Mg2+, Ca2+ und Phenolrot. Zur Verdünnung von Sonden und zum Waschen von Zellen
8-Well-Objektträger354108BD Biosciencesfür die Zellkultur und anschließend für die Mikroskopie verwendet.
ZellkulturflaschenGreiner BioOne
ZellkulturmedienGibco (life technologies GmbH)
Fötales Kälberserum Invitrogen
Poly-L-Lysin-Lösung (0,01%, 50  ml)SigmaP4832zur Beschichtung von Objektträgern in Zellkulturkammern
Eindeckmittel PermafluorThermoScientificS21022-3Eindecklösung für die Mikroskopie
Hoechst-33258AppliChemDNA-Farbstoff für die Mikroskopie
Hera-SafeHeraeus Instrumentssterile Werkbank für die Zellkultur
HERA-ZelleHeraeus InstrumentsInkubator für die Zellkultur
LSM510-MetaZeissfür die konfokale Mikroskopie
Maestro-TM in vivo Fluoreszenz-BildgebungssystemCRi, Woburnfür die Ganzkörper-Fluoreszenzbildgebung von Kleintieren
Spektralphotometer (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcarefür die Messung der
Absorption Spektrofluorometer (Jasco FP-6200)Jascofür die Messung der Fluoreszenzemission
Animals
NMRI-Mäuse (8-12 Wochen alt, männlich)Elevage Janvier, Frankreichfür Entzündungsstudien verwendet
In In In

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