Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Zusammenfassung

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden. Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Aus dem Knochenmark stammende mesenchymale Stromazellen (BM-MSCs) gelten als Goldstandard für stammzellbasierte Tissue Engineering-Anwendungen. Der Prozess, mit dem sie entnommen werden müssen, kann jedoch mit einer signifikanten Morbidität an der Spenderstelle verbunden sein. Im Gegensatz dazu sind aus Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASCs) häufiger vorhanden und leichter zu ernten, was sie zu einer attraktiven Alternative zu BM-MSCs macht. Wie BM-MSCs können sich ASCs in osteogene Zellen differenzieren und in Tissue-Engineering-Anwendungen verwendet werden, z. B. bei der Aussaat auf Gerüsten für den Einsatz bei kraniofazialen Skelettdefekten. ASCs werden aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von verdautem Fettgewebe gewonnen, das eine heterogene Mischung aus ASCs, vaskulären Endothel- und Muralzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, Fibroblasten und zirkulierenden Zellen ist. Die durchflusszytometrische Analyse hat gezeigt, dass das Oberflächenmarkerprofil für ASCs ähnlich ist wie für BM-MSCs. Trotz mehrerer veröffentlichter Berichte, die Marker für den ASC-Phänotyp etabliert haben, besteht immer noch kein Konsens über Profile zur Identifizierung von Osteoprogenitorzellen in dieser heterogenen Population. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Subpopulation von ASCs mit erhöhter osteogener Kapazität isoliert und verwendet wird, um Schädelbaddefekte kritischer Größe zu reparieren.

Einleitung

Die heterogene Natur von Stammzellpopulationen ist noch nicht vollständig verstanden und bleibt ein großes Hindernis für die Entwicklung klinisch wirksamer stammzellbasierter therapeutischer Anwendungen. Eine der gebräuchlichsten Methoden zur Charakterisierung einer heterogenen Stammzellpopulation ist die Verwendung einer Zellsortiermethode, wie z. B. der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), um Zellen basierend auf ihren Oberflächenmarker-Expressionsprofilen zu trennen. Mit zunehmender Komplexität der Sortiermethoden wird es möglich, spezifischere funktionelle Subpopulationen von Zellen zu identifizieren. Mikrofluidik-basierte Technologien werden immer häufiger bei der Analyse der Genexpression auf Einzelzellebene eingesetzt. Die geplexte quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) in einem mikrofluidischen Chip ermöglicht eine effektive und zuverlässige hochauflösende Einzelzell-Transkriptionsanalyse. ^1-5

In einer früheren Studie, in der Einzelzell-Transkriptionsprofile von 48 Genen verwendet wurden, wurde eine beträchtliche transkriptionelle Heterogenität zwischen ASCs beobachtet. ⁶ Die Verteilung der Gene MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 zeigte jedoch eine starke Assoziation mit einem Cluster von Zellen mit hochgradig osteogenen Transkriptionsprofilen. Um Zellen entsprechend diesem osteogenen Genexpressionsprofil zu isolieren, wurden Oberflächenantigen-Expressionsmuster mit Transkriptionsmustern korreliert, und anschließend wurde entdeckt, dass die Oberflächenmarkerexpression von Endoglin (CD105) eng mit einem erhöhten osteogenen Differenzierungspotenzial von ASCs korreliert. Unabhängig von der CD105-Expression war die Expression des Oberflächenrezeptors Thy-1 (CD90), eines Glykosyl-Phosphatidylinositol-gebundenen Membranproteins, von dem Chen et al. zuvor gezeigt hatten, dass es mit Osteoprogenitorzellen assoziiert ist, auch mit der osteogenen Genexpression korreliert. ^6,7 Diese Ergebnisse bieten die Möglichkeit, Subpopulationen innerhalb des größeren heterogenen Pools von ASCs mit erhöhter osteogener Kapazität für zellbasierte Bone Tissue Engineering-Anwendungen prospektiv zu isolieren.

Protokoll

HINWEIS: Alle Patientenproben wurden mit Einwilligung erhalten, und experimentelle Protokolle wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 und # 9999) zugelassen.

1. Zell Isolierung und Kultur:

1. Erhalten menschlichen Hautfettgewebe von gesunden weiblichen Patienten nach elektiven lipoaspiration des Bauches, Flanke, und / oder Oberschenkelbereich unter örtlicher / Vollnarkose. Stellen Sie sicher, dass Institutional Review Board (IRB) Approbation ist für die Protokoll zur Isolierung von ASC aus menschlichen Geweben gewonnen wurden, und folgen institutionelle Schutzmaßnahmen beim Umgang mit derartigen Materialien.
2. Um die SVF vom lipoaspirated Fettgewebe zu erhalten, zuerst waschen die lipoaspirate dreimal mit gleichen Volumina 1x sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Vorsichtig absaugen und entsorgen Sie die untere wässrige Schicht.
3. Bereiten Sie die Kollagenase-Verdauungspuffer: 0,075% Typ I Kollagenase in HanksBalanced Salt Solution (HBSS). Bereiten FACS-Puffer: 2% FBS, 1% P188 und 1% Pen-Strep in PBS. Filtern beide Lösungen mit Hilfe eines im Handel erhältlichen 0,22 um Porengrße fast flow Polyethersulfon Filter.
4. Zu den gewaschenen Fettgewebe verdauen, ein gleiches Volumen von Kollagenase-Verdauungspuffer und legen Digerierbehälter sicher in einem Schüttelwasserbad für 60 min bei 37 ° C (etwa 180 Shakes / min).
   HINWEIS: Es empfiehlt sich, ein größeres Volumen Aufschlussgefäß als erforderlich verwenden, da dies ermöglicht eine maximale Verdauung beim Schütteln (dh 250 ml Kollagenaseverdau Puffer, 250 ml gewaschen Fettgewebe in einem 1L sterile Flasche).
5. Neutralisieren enzymatische Aktivität durch Zugabe eines gleichen Volumens von FACS-Puffer und Stehenlassen bei RT für 5 min stehen. Als nächstes Zentrifuge bei 233 × g für 20 min bei 4 ° C.
6. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, kümmert sich nicht um die hochdichte SVF Pellet stören.
7. Das Pellet in 5-10 ml RT rotZelllysepuffer, bezogen auf die Pelletgröße. Verlassen Lösung bei RT für 5 Minuten und Zentrifugation bei 233 × g für 5 min bei RT sitzen.
8. Überstand wird abgesaugt und das Pellet durch Zugabe von 5-10 ml traditionellen Wachstumsmedien, bezogen auf die Pelletgröße (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung [Pen-Strep]).
9. Filtern der Suspension durch ein 100 um Nylon Zellsieb um Zelltrümmer zu entfernen.
10. Zentrifuge bei 233 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, und den Überstand verwerfen, ohne dass der Pellets.
11. Das Pellet in 5-10 ml traditionellen Wachstumsmedien, bezogen auf die Pelletgröße.
12. Je 2 x 10 ⁶ Zellen in einem 15 cm-Standard Kulturschale und stellen Primärkulturen O / N bei 37 ° C / 21% O _2, 5% CO _2. Zu halten, bei sub-konfluenten Ebenen spontane Differenzierung bei 37 ° C / 21% O _2, 5% CO ₂ in Wachstumsmedium zu verhindern.
    HINWEIS: Die Zelldichte in einem vollkonfluenten 15 cm Platte beträgt ca. 4-6 x 10 ⁶ Zellen.

2. Die Färbung

1. Kultur ASC in herkömmlichen Wachstumsmedium bei 37 ° C / 21% O _2, 5% CO _2, für 36 Stunden vor der Färbung / Sortieranlagen.
2. Fahrstuhl ASC von Kulturplatten mit Accutase (nach Herstellerprotokoll).
3. Waschen Sie die Zellen einmal mit FACS-Puffer (PBS mit 2% FBS und 1% Pen-Strep).
4. Zentrifuge bei 233 × g für 5 min bei 4 ° C.
5. Überstand verwerfen, ohne dass der Pellets. Die Zellen in 0,5-1 ml FACS-Puffer (je nach Zellzahl und der Menge des Antikörpers gewünscht).
   ANMERKUNG: Das Volumen der Zellsuspension, in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des FACS Antikörper Herstellers bestimmt Antikörperkonzentration. Jedoch Titration von Antikörper-Konzentration, unter Verwendung einer Ausgangskonzentration von 1: 100 wird in der Regel empfohlen, wenn es das erste Mal ist, einen Antikörper zu verwenden.
6. Zählen der Gesamtzahl derZellen unter Verwendung eines Hämocytometers.
7. Reserve 100 ul Aliquots in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für eine ungefärbte Probe und einfarbige Kontrollen (entsprechend der Anzahl von fluoreszierenden Antikörpern verwendet wird) verwendet werden.
8. Fügen Sie die entsprechenden fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern (in vorgegebenen Konzentrationen, den Anweisungen des Herstellers) und Inkubation für 20 bis 30 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt.
   1. Osteogene Subpopulation beschriften: Verdünnen anti-CD90 (APC-anti-Mensch CD90 (Thy1)) bzw. anti-CD105 (FITC-Anti-Human CD105 (Endoglin)) in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1:50.
   2. Um andere Zellpopulationen (zB hämatopoetische und Endothelzellen) zu kennzeichnen: Verdünnen anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), Anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), und / oder anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1:50.
   3. Wenn nicht mit direkt konjugierten Antikörper, mit einem biotinylierten primären Antikörpers mit einem geeigneten Streptavidin-konjugierten zweitenary-Antikörper, wie beispielsweise Streptavidin PE-Cy7, bei einer Verdünnung von 1: 100.
9. Nach der Inkubation wurden die Zellen werden zweimal: Füllrohre mit FACS-Puffer und Zentrifugieren bei 233 × g für 5 min bei 4 ° C, Absaugen Stand.
10. Die Zellen in 400 bis 500 & mgr; l FACS-Puffer und Filterproben durch einen 70 & mgr; m Nylon Zellsieb um Zellklumpen zu entfernen.
11. Übertragen markierten Zellen in FACS-Röhrchen mit Filter oben und halten Proben auf Eis für die Dauer der Analyse.

3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

Hinweis: Die folgenden Schritte Mandat Vorkenntnisse in fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder die Hilfe von einem Fachmann.

1. Mit der entsprechenden Software FACS, Konstruktionsanalyse Grundstücke zum Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) zu untersuchen, Phycoerythrin (PE) -Texas Red, Pacific Blue, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Allophycocyanin (APC) und andere Fluorophor Verwendungd, um Zellen zu markieren.
2. Vor dem Laden in den Zellsortierer, Vortexen jede Probe, um die Zellen zu resuspendieren.
3. Beginnen Sie mit der Analyse der ungefärbten Probe, um Tore zu der gesamten Zellpopulation gesetzt, um Zelltrümmer ausschließen und die Baseline Autofluoreszenz zu bestimmen.
4. Hinzufügen Propidiumiodid (PI) auf die ungefärbten Probe und zu analysieren, um die Population von lebenden Zellen in der Gesamtzellpopulation zu visualisieren. Konstruieren Sie ein Tor um diese Bevölkerung.
5. Analysieren Sie einen einfarbigen Kontrollprobe für jedes Fluorochrom um Fluoreszenzkompensation eingestellt.
6. Analysieren Sie die gefärbten Probe, um die Position der Tore für die Sortierung festlegen.
7. Fügen PI auf die gefärbte Probe, um abgestorbene Zellen zu färben.
8. Die markierten Zellpopulationen zu sortieren. Sortieren entweder in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen oder konische Röhren (15 ml) enthaltenden Kulturmedium.
9. Manuell einzustellen Sortier, wenn die erforderliche Menge von Zellen erhalten worden ist.
10. Unsing FACS, führen eine Überprüfung der Reinheit durch Analyse eines kleinen Bruchteil (z. B. 500 Zellen) der erfassten Zellpopulation.
    HINWEIS: Dieser Schritt bestätigt die Reinheit der sortierten Zellpopulationen. Idealerweise sollte die Reinheit größer als 90-95% betragen.
11. Zentrifuge Zellen bei 233 g für 5 min bei 4 ° C unmittelbar nach der Beendigung des Sortierens und Resuspension in 1 ml frischem Medium, enthaltend 10% FBS.
    HINWEIS: Die Menge des verwendeten Mediums kann auf der Grundlage der Größe der Zellpellet erhöht werden.
12. Platte auf mit Gelatine beschichtete Platten Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Abhängig von dem jeweiligen Zellausbeute, Platte 300.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen, 100.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 12 Vertiefungen.

Ergebnisse

Verwendung CD90 als ein Marker für Zellen mit erhöhter Osteogenese ergibt Isolierung eines hochangereicherten Populationen menschlicher ASCs (1A, 1B). ASC wurden mit Pacific Blue-konjugierten Anti-Human-CD45 FITC-konjugiertem Anti-Human CD105 und APC-konjugiertem Anti-Human-CD90 gefärbt. Nach dem Sortieren der Reinheitsgrad betrug mehr als 98%, wie durch die Post-Sortieranalyse quantifiziert.

Definieren von Gruppen von Zellen auf Basis von Transkriptionsprofilen für angehend...

Diskussion

Derzeit bleibt die Isolierung homogene Subpopulationen von ASC vom SVF menschlichen Fettgewebe eine anspruchsvolle aber wünschenswertes Ziel. Isolation von Pro-osteogenen ASC Subpopulationen ist besonders wünschenswert, da solche Zellen verwendet werden, um die Bildung und die Homöostase von Skelettgewebe zu untersuchen. Die SVF von Fettgewebe birgt jedoch erhebliche Heterogenität bezüglich Stammzellenkapazität und Differenzierungspotential. ¹¹ wird die molekulare Grundlage dieser Heterogenität nicht aus gepo...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Konische Einwegröhrchen 250 ml	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7,4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptisches Povidon/Jod-Lösung	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fötales Rinderserum, zertifiziert, US-Herkunft	Gibco	16000-044
Kollagenase aus  Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Zellablösungslösung	Stammzelltechnologien	7920
APC Maus Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Maus Anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue Ersatz)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human-CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human-CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II Instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences