Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Zusammenfassung

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden. Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Aus dem Knochenmark stammende mesenchymale Stromazellen (BM-MSCs) gelten als Goldstandard für stammzellbasierte Tissue Engineering-Anwendungen. Der Prozess, mit dem sie entnommen werden müssen, kann jedoch mit einer signifikanten Morbidität an der Spenderstelle verbunden sein. Im Gegensatz dazu sind aus Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASCs) häufiger vorhanden und leichter zu ernten, was sie zu einer attraktiven Alternative zu BM-MSCs macht. Wie BM-MSCs können sich ASCs in osteogene Zellen differenzieren und in Tissue-Engineering-Anwendungen verwendet werden, z. B. bei der Aussaat auf Gerüsten für den Einsatz bei kraniofazialen Skelettdefekten. ASCs werden aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von verdautem Fettgewebe gewonnen, das eine heterogene Mischung aus ASCs, vaskulären Endothel- und Muralzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, Fibroblasten und zirkulierenden Zellen ist. Die durchflusszytometrische Analyse hat gezeigt, dass das Oberflächenmarkerprofil für ASCs ähnlich ist wie für BM-MSCs. Trotz mehrerer veröffentlichter Berichte, die Marker für den ASC-Phänotyp etabliert haben, besteht immer noch kein Konsens über Profile zur Identifizierung von Osteoprogenitorzellen in dieser heterogenen Population. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Subpopulation von ASCs mit erhöhter osteogener Kapazität isoliert und verwendet wird, um Schädelbaddefekte kritischer Größe zu reparieren.

Einleitung

Die heterogene Natur von Stammzellpopulationen ist noch nicht vollständig verstanden und bleibt ein großes Hindernis für die Entwicklung klinisch wirksamer stammzellbasierter therapeutischer Anwendungen. Eine der gebräuchlichsten Methoden zur Charakterisierung einer heterogenen Stammzellpopulation ist die Verwendung einer Zellsortiermethode, wie z. B. der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), um Zellen basierend auf ihren Oberflächenmarker-Expressionsprofilen zu trennen. Mit zunehmender Komplexität der Sortiermethoden wird es möglich, spezifischere funktionelle Subpopulationen von Zellen zu identifizieren. Mikrofluidik-basierte Technologien werden immer häufig....

Protokoll

HINWEIS: Alle Patientenproben wurden mit Einwilligung erhalten, und experimentelle Protokolle wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 und # 9999) zugelassen.

1. Zell Isolierung und Kultur:

1. Erhalten menschlichen Hautfettgewebe von gesunden weiblichen Patienten nach elektiven lipoaspiration des Bauches, Flanke, und / oder Oberschenkelbereich unter örtlicher / Vollnarkose. Stellen Sie sicher, dass Institutional Review Board (IRB) Approbation ist für die Protokoll zur Isolierung von ASC aus menschlichen Geweben gewonnen wurden, und folgen institutionelle Schutzmaßnahmen beim Umg....

Ergebnisse

Verwendung CD90 als ein Marker für Zellen mit erhöhter Osteogenese ergibt Isolierung eines hochangereicherten Populationen menschlicher ASCs (1A, 1B). ASC wurden mit Pacific Blue-konjugierten Anti-Human-CD45 FITC-konjugiertem Anti-Human CD105 und APC-konjugiertem Anti-Human-CD90 gefärbt. Nach dem Sortieren der Reinheitsgrad betrug mehr als 98%, wie durch die Post-Sortieranalyse quantifiziert.

Definieren von Gruppen von Zellen auf Basis von Transkriptionsprofilen für angehend.......

Diskussion

Derzeit bleibt die Isolierung homogene Subpopulationen von ASC vom SVF menschlichen Fettgewebe eine anspruchsvolle aber wünschenswertes Ziel. Isolation von Pro-osteogenen ASC Subpopulationen ist besonders wünschenswert, da solche Zellen verwendet werden, um die Bildung und die Homöostase von Skelettgewebe zu untersuchen. Die SVF von Fettgewebe birgt jedoch erhebliche Heterogenität bezüglich Stammzellenkapazität und Differenzierungspotential. ¹¹ wird die molekulare Grundlage dieser Heterogenität nicht aus gepo.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Konische Einwegröhrchen 250 ml	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7,4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptisches Povidon/Jod-Lösung	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fötales Rinderserum, zertifiziert, US-Herkunft	Gibco	16000-044
Kollagenase aus  Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Zellablösungslösung	Stammzelltechnologien	7920
APC Maus Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Maus Anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue Ersatz)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human-CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human-CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II Instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences