Methodenartikel

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung In-vitro- Und In-vivo-

DOI:

10.3791/52388

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6. Februar 2015

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1Microbiology and Immunology, Western University, 2Biochemistry, Western University, 3Surgery, Western University, 4Oncology, Western University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird die Echtzeitüberwachung des Tumorzellstoffwechsels, kombiniert mit einem in vivo Modell der Chorio-Allantoismembran (CAM) der Metastasierung von Hühnerembryonen, verwendet, um neuartige Anti-Krebs-Ziele/Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit hin zu bewerten, Tumorzellen für DNA-schädigende Chemotherapeutika zu sensibilisieren.

Zusammenfassung

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Aufgrund der hohen Heterogenität und Mutationen in der menschlichen Krebsarten, einzelnes Mittel Therapien oder Kombinationstherapien, die den gleichen Weg zielen, sind wahrscheinlich versagen. Der Nachdruck auf die Hemmung der Pfade bei der intrinsischen und / oder adaptive Therapieresistenz verantwortlich sind, platziert werden. Ein aktives Forschungsgebiet ist die Entwicklung und Erprobung von DNA-Reparatur-Inhibitoren, die die Wirkung von zu fördern und zu verhindern, Widerstand gegen, häufig verwendete Chemotherapie und Strahlentherapie. Wir verwendeten eine neue Methode, um die Wirksamkeit der BRCA2 Hemmung als Mittel zur Tumorzellen mit der DNA-schädigenden Medikament Cisplatin sensibilisieren bewerten. Tumorzellstoffwechsel (Versauerung und Atmung) wurde in Echtzeit über einen Zeitraum von 72 Stunden, um die Wirksamkeit der Behandlung auf einem von Minute zu Minute Grundlage abzugrenzen überwacht. In Kombination, eine Bewertung der metastatischen Frequenz führten wir mit einem Hühnerembryo Chorioallantoismembran (CAM) Modell der Extravasation und Invasion. DieseProtokoll behandelt einige Schwächen üblicherweise in vitro und in vivo-Verfahren verwendet werden, um neue Krebstherapieschemata zu bewerten. Es kann neben üblichen Methoden wie Zellproliferationsassays, Zelltod Assays verwendet werden, und in vivo murine Xenograft Studien genauer unter in Frage kommenden Zielen und Mitteln unterscheiden und wählt nur die aussichtsreichsten Kandidaten für eine weitere Entwicklung.

Einleitung

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Erworbener Resistenz gegen gezielte und / oder zytotoxischen Krebsbehandlung ist ein wichtiges klinisches Problem, die zum Therapieversagen, Rückfall führen kann, und eine erhöhte Patientensterblichkeit 1. Angesichts der hohen Heterogenität in den meisten Tumoren, es ist eine mathematische Gewissheit, dass ein Tumor ausreichend hohe Zellzahl wird eine Untergruppe von Zellen resistent gegen einzelne oder kombinierte Therapien, die molekularen Wege, auf denen diese Zellen hängen zum Überleben 2,3 enthalten. Solche Tumorzellen können für den während der Behandlung ausgewählt werden, was zu einem Rezidiv. Entwicklung neuer Therapien, die gleichzeitig unterschiedliche Zielkrebszellüberlebensmechanismen, entweder vor oder nach der Behandlung vermittelte Selektion ist deshalb klinisch wichtig.

Ein hohes Maß an Genominstabilität und Mutation in Tumor Genome ist eine grundlegende Eigenschaft, die Krebszellen aus Nicht-Tumorwirtszellen 4 unterscheidet. Folglich wird ein useful-Strategie, um die Wirksamkeit von DNA-schädigenden Chemotherapie zu erhöhen und die Entwicklung einer Resistenz zu verhindern ist, DNA-Reparatur hemmen aktiv in Tumorzellen 5. Dies ist ein aktives Forschungsgebiet und eine Vielzahl von neuen DNA-Reparatur-Ziele werden in einem präklinischen Einstellung erforscht. Eine Anzahl von kleinen Molekülen oder Antisense-basierte Inhibitoren dieser Ziele entwickelt und werden in der Erprobung 6-8. Das Ziel ist es, die vielversprechendsten präklinischen Kandidaten in klinischen Studien zu erkennen und bewerten ihre Sicherheit und Wirksamkeit.

Die hohen Kosten der klinischen Versuche und die Gefahr einer Störung (für eine Vielzahl von Gründen, einschließlich suboptimaler präklinische Bewertung) sind gewaltige Hindernisse in die Entwicklung von neuen Therapien 9 voran. Die Verwendung geeigneter und strengen präklinischen Modellen angemessen neue therapeutische Targets und Wirkstoffkandidaten beurteilen kann die hohe Ausfallrate von 10 klinischen Studien zu verringern .

A) Messung der Fähigkeit, die Tumorzellproliferation in vitro (Zellproliferationsassays), b) Therapie-induzierte Verringerung der Kapazität von Tumorzellen zu verringern: Einige häufig verwendete vorklinischen Verfahren, die Wirksamkeit von neuen Antikrebs-Therapien sind, beurteilen Form Gewebekulturkolonien (kolonieBildungsTests), c) Therapie-induzierte Verringerung des Tumorzellstoffwechselaktivität in vitro (Redoxfarbstoff Umwandlung), d) Therapie-induzierte Induktion in vitro Tumorzelltodes (Apoptose, Nekrose, phage, zugeordnet mit der Mitose und weitere) 11, und e) in vivo-Therapie-induzierte Reduktion des Wachstums oder der Ablation von menschlichen und Maus-Xenotransplantaten 12-14.

Eine Hauptschwäche der angeführten in vitro Verfahren ist, dass keine von ihnen eine kontinuierliche Echtzeit-Auswertung der Wirkung der Kandidatentherapie. Vielmehr nur an ausgewählten, weit auseinanderZeitPunkten liefern sie Informationenwährend des Verlaufs der Behandlung. Solche Messungen haben Kapazitäten, um die Größe und den Zeitpunkt des Tumorzellantworten genau widerspiegeln vermindert. In vivo-Maus-Xenograft-Modelle werden auch durch hohe Kosten, Zeitdauer in Anspruch, und das Risiko von suboptimalen Dosierungen und Verabreichungszeitpunkt (Scheduling) begrenzt. Darüber hinaus gibt es Hinweise, dass Nager Xenotransplantatmodellen begrenzt Prädiktoren für die klinische Wirksamkeit in Menschen im Vergleich zu in-vitro-Bewertung der Reaktionen von primären humanen Tumorzellen und etablierten menschlichen Tumorzellinien Kandidaten therapeutische Interventionen 15,16.

Wir entwickelten eine neuartige Kombinationsprotokoll neue Arzneimittelkombinationen vorklinisch auszuwerten, in einer Weise, die die Schwächen der oben genannten üblichere Verfahren adressiert. An die Stelle der Proliferation, Koloniebildung oder Redoxfarbstoff Umwandlung Tests verwendeten wir einen Stoffwechsel Maßeinheit Zelladhäsion, Atmung und die Versauerung in Echtzeit zu analysierenwährend des gesamten Behandlungszeitraums 17. Gleichzeitig untersuchten wir die Auswirkungen der Behandlung Kombination in vivo durch die Verwendung eines Hühnerembryo Chorioallantoismembran (CAM) Modell der Invasion und Metastasierung von 18,19. Wir verwendeten diese Methoden, um die Fähigkeit eines Antisense-Oligonukleotid (ASO) Targeting BRCA2, um die Wirksamkeit der üblicherweise verwendeten chemotherapeutischen Arzneimittel Cisplatin potenzieren bewerten.

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Protokoll

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HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde für den Einsatz mit anhaftenden Zellen ausgelegt. Modifikationen sind erforderlich, um das Verfahren zur nicht-adhärenten Zellen in Suspension gezüchtet anzuwenden. Die in dem Protokoll beschrieben CAM Experimente sind zur Verwendung mit Zellen, die einen fluoreszierenden Marker (zB GFP, RFP etc.) zu exprimieren gestaltet. Neun Tage alten Hühnerembryonen werden am Tag 2 des Versuchsprotokoll für die CAM-Experimente erforderlich.

1. Vorbereitung und Transfektion von Tumorzellen mit Antisense-Oligonukleotide (ASOs)

  1. Absaugen Medium aus T75-Flasche (n), die Zellen von Interesse, Wäsche mit 1 × PBS und 2 ml 0,25% Trypsin / EDTA. 10 ml vollständigem Wachstumsmedium zu jedem Kolben und übertragen die Zellen in einer Lösung in ein 50 ml Röhrchen. Zählen Sie die Zellen und die Lautstärke anpassen, so dass die Endkonzentration 1,0x10 5 Zellen pro ml.
  2. Label zwei Gruppen von T25-Kolben: eine Gruppe acht Flaschen, beschriftet 1-8 enthalten und wird u seinsed für die Echtzeit-Stoffwechselmessung Experiment; und die zweite Gruppe enthält auch 8 Kolben und wird für den Hühnerembryo-CAM-Experiment verwendet werden. 2 ml Zellen in Lösung in jeden Kolben und in den Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
  3. Am nächsten Morgen (Tag 0, Zeit 0), Etiketten drei 5-ml-Röhrchen wie folgt: Kontrolle (nicht-Targeting ASO oder siRNA), "Ziel von Interesse" (dh Ziel ASO oder siRNA) und Lipofectamin 2000 (oder eine ähnliche Transfektionsreagenz). Von der Stammlösungen ASO auf die geeignete Konzentration mit serumfreiem Medium in das entsprechende Rohr.
    1. Die erforderliche Menge des Transfektionsreagenz an die entsprechende Röhre und Inkubieren in einem serumfreien Medium für 5 min. Fügen Sie das Transfektionsreagenz Lösung für die ASO Rohre und Inkubation für 20 min.
  4. Fügen Sie 250 ul Steuer ASO Transfektionsreagenz Lösung zu jedem der Kolben 1-4 in jeder Gruppe, und 250ul 'Ziel von Interesse' ASO Transfektionsreagenz Lösung zu jedem der Kolben 5-8 in jeder Gruppe. Inkubieren für 4 h (37 ᵒC, 5% CO 2).
    1. Während der Inkubation, führen Sie die in Abschnitt 2.1 beschriebenen Schritte. Nach der Inkubation werden 3 ml Vollmedium zu jedem Kolben in der CAM Experimentalgruppe und zurück in den Inkubator O / N (37 ᵒC, 5% CO 2). Verarbeiten Sie den Stoffwechsel Experiment Gruppe gemäß der Beschreibung in Abschnitt 2.2. Verarbeiten Sie die CAM Versuchsaufbau gemäß der Beschreibung in Abschnitt 4.

2. Biosensorchip Vorbereitung und Zellaussaat

  1. In einer sterilen Umgebung, sorgfältig zu waschen sechs Biosensor-Chips mit 400 ul PBS. Sterilisation der Späne mit 400 ul 70% Ethanol für 20 min. Dreimal mit 400 ul PBS waschen.
    1. Legen Sie die Chips in sterile Gewebe culture Gerichte, um eine Kontamination zu verhindern. Platzieren Sie drei Chips in einer Schale "Kontrolle" bezeichnet, und drei in einer Schale "Ziel von Interesse" bezeichnet.
  2. Beschriften Sie zwei 50-ml-Röhrchen als "Kontrolle" und "Ziel von Interesse". Waschen Sie die Zellen mit PBS und füge eine entsprechende Volumen von 0,25% Trypsin / EDTA. Warten Sie, bis die Monolage ablöst und sammeln Sie die Zellen aus jedem Kolben. Zahlen Sie die Lösung in die entsprechenden Röhrchen.
    1. Zählen Sie die Zellen und die Lautstärke anpassen, so dass die Endkonzentration 6.0x10 5 Zellen / ml. Zentrifugieren und Resuspendieren der Zellen, wenn der Anfangskonzentration zu niedrig ist.
  3. Nach Eintragen von 250 ul der Zelllösung zu jeder Biosensorchip in der entsprechenden Gruppe (für insgesamt 1.25x10 5 Zellen pro Chip). Erfüllen diese Aufgabe eine Gruppe zu einer Zeit, um die Gefahr der Verwechslung der Chips zu minimieren. Legen Sie die sterile Gerichte, die die Chips in eine feuchte Kammer, um Verdunstung zu vermeiden, und legen Sie die Luftfeuchtigkeit chamber im Inkubator O / N (37 ᵒC, 5% CO 2).
  4. Am nächsten Morgen (Tag 1), sorgfältig absaugen Medium von jedem Chip und ersetzen sie durch 250 ul Wachstumsmedium mit 0,2% fötalem Rinderserum (FBS) und 1x Penicillin und Streptomycin (P / S) ergänzt. Inkubieren für 4 h (37 ᵒC, 5% CO 2).

3. Stoffwechselmesssystem Vorbereitung und Herstellung der Lösung

  1. Während der Inkubation vorbereiten die erforderlichen Medikamentenlösungen und den Stoffwechsel Messsystem für die kommende Test.
    HINWEIS: Der Stoffwechsel-Messsystem besteht aus insgesamt sechs Modulen. Jedes Modul bietet Platz für ein Chip pro Experiment.
    1. Unterteilen Sie den Test in den folgenden Versuchsgruppen: einem Chip von jedem der "Kontrolle" und "Ziel Sehenswürdigkeit Gruppen Fahrzeug für die Dauer des Tests zu empfangen; zwei Chips aus jeder Gruppe auf eine medikamentöse Therapie für eine definierte Zeitdauer, während der ein Empfangsssay, mit einem Fahrzeug folgen während der Auswaschphase.
    2. Für Drogen Sensibilisierung Studien, ändern Sie die Länge, Timing und Konzentration der medikamentösen Behandlung, die bestimmtes Medikament in Frage zu entsprechen.
      HINWEIS: Cisplatin, die folgenden Schritte wurden empirisch mit A549-Zellen bestimmt und können variieren je nach Zelllinie. Führen alle Stufen mit der Standardflussrate von 4 & mgr; l / min.
      6 h Wachstumsmedium + 0,2% FBS und 1 x P / S
      24-Stunden von 6 uM Cisplatin in Medium + 0,2% FBS 1x P / S
      24-Stunden-Wachstumsmedium + 0,2% FBS und 1 x P / S
      18 Stunden des Wachstums-Medium + 0,2% FBS und 1 x P / S
      4 h 0,1% Triton-X
      HINWEIS: Bei Abweichungen von diesen Schritten wird die Berechnung erfordern, um das erforderliche Volumen des Mediums und Arzneimittellösungen auf der Grundlage der Soll-Strömungsrate und der Dauer des Experiments zu bestimmen. Die folgenden Abschnitte sind auf den oben beschriebenen Schritten basieren.
  2. Label und füllen vierzehn 50-ml-Röhrchen mit 50 ml Wachstumsmedium + 0,2% FBS eind 1x P / S. Sie sechs in einem Metabolismus Meßsystem Röhrchengestell, sechs in dem anderen, und die verbleibenden zwei in einer dritten Rohrgestell, das auch Rohre mit Cisplatin. Dichten Sie die ersten zwei Racks mit einem luftdurchlässigen Membran um Verdunstung zu verhindern.
  3. Bereiten Sie eine Lösung von 6 uM Cisplatin (der entsprechende Volume) in Medium + 0,2% FBS mit 1x P / S. Verzichten die gewünschte Lautstärke von Cisplatin-Lösung in vier markierten 50-ml-Röhrchen.
    1. Die Röhrchen in den verbleibenden vier Nuten der dritten Stoffwechsel Meßrohr Rack. Sicherzustellen, dass die Röhren in die entsprechenden Schlitze, die zu den gewünschten biomodules entsprechen platziert. Verschließen Sie die Röhrchen mit einer luftdurchlässigen Membran.
  4. Bereiten Sie und beschriften sechs 50-ml-Röhrchen und füllen sie mit je 20 ml 0,1% Triton-X-Lösung im Medium. Der Triton-X-Lösung wird alle verbleibenden Zellen zu lysieren und eine "Null" Wert für jeden Chip. Die Röhrchen in einem vierten Stoffwechsel Meßeinheit Rohrgestell und abdichten with ein Luft permable Membran übermäßiger Verdunstung zu verhindern.
  5. Legen Sie die Chips in die biomodules und leitet das Experiment.

4. CAM Experiment Drug Treatment und Einspritzung

HINWEIS: Die Schritte und Verfahren zur Herstellung der Hühnerembryonen für ein CAM-Experiment werden an anderer Stelle 19 beschrieben

  1. Beginnen Sie die Bearbeitung des CAM Experiment 48 Stunden nach der Transfektion (Tag 2). Unterteilen die "Kontrolle" und "Ziel von Interesse Gruppen in zwei Flaschen für Fahrzeug und zwei für Cisplatin. Absaugen Medium aus den Kolben und füllt mit entweder 3 ml frisches Medium oder 6 uM Cisplatin. Inkubieren für 6 h (37 ᵒC, 5% CO 2).
  2. Saugen Sie das Medium, dann waschen und trypsinieren der Zellen; sammeln die Zellen mit Trypsin in Lösung in vier entsprechend gekennzeichnete 15-ml-Röhrchen.
    1. Zentrifuge und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Re-suspendieren des Zellpellets in 5 ml PBS einemd die Zellen zu zählen.
    2. Stellen Sie die Lautstärke so dass die endgültige Zellkonzentration ist 1,0x10 6 Zellen / ml. Übertragen Sie die Zell-Lösung in beschriftete 5-ml-Röhrchen zur Injektion, und legen Sie auf dem Eis. Der Injektion invertieren die Röhren vorsichtig vor, um sicherzustellen, dass die Zellen gut vermischt.
  3. Beiseite insgesamt 24 Hühnerembryonen (9 Tage alt) für die Injektion (6 pro Gruppe). Führen die Injektion unter Verwendung einer Glasnadel, um einen Schlauch mit einer 1 ml Spritze verbunden angebracht. Die individuelle Durchführung der Injektion sollte der Behandlungsgruppe blenden lassen.
    1. Mit einem Stereomikroskop zu injizieren 1,0x10 5 Zellen in einem Volumen von 100 ul in die venöse Zirkulation des CAM. Verwenden Sie eine lange, pulsierende Technik, um das volle Volumen von Zellen injizieren. Vorsichtig abtupfen die Injektionsstelle mit einem weichen abzuwischen, um den Blutfluss einzudämmen und zu absorbieren eventuelle Spritzer. Beschriften Sie jedes Embryo Behälter entsprechend nach jeder Injektion.
  4. Bestätigen Sie die Präsenz und Verteiteilung von fluoreszierenden Zellen in das Gefäßsystem des CAM nach der Injektion durch die Visualisierung sie mit einem Fluoreszenzmikroskop. Beachten Sie bitte die Embryonen, bei denen die Zahl der Tumorzellen scheint gering, oder die Verteilung ist schlecht.
  5. Legen Sie die Hühnerembryonen in einer feuchten Kammer und speichern sie in einem Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit 60%). Warten Sie 7-9 Tage vor der Aufzählung Metastasenherde.

5. metastasiertem Fokus Enumeration

  1. Während der 7-9 Tage Inkubationszeit überwachen die Embryonen und entsorgen Sie alle Toten. Sicherzustellen, dass der Feuchtigkeitskammer feucht bleibt zu allen Zeiten während der Inkubationszeit.
  2. Verwendung eines Fluoreszenz-Stereomikroskop bei 20-facher Vergrößerung, scannen die gesamte Oberseite des Embryos CAM in einem regelmäßigen, gitterartiges Muster.
  3. Die Anzahl der Metastasenherde in jedem Blickfeld, dann überein die Anzahl für eine abschließende Gesamt pro Embryo. Dies für die sechs Embryonen in jeder Gruppe eine durchschnittliche Zahl o liefernf metastatischen Foci pro Behandlung.

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Ergebnisse

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Ergebnisse und Zahlen mit Genehmigung aus veröffentlichten Arbeiten 22 angepasst.

BRCA2 Hemmung induziert eine Abnahme der Atmung in Cisplatin behandelten Tumorzellen

Menschen A549 Lungenkrebszellen mit BRCA2-Targeting ASO und Cisplatin zeigte eine frühe und irreversible Abnahme der Atmung, im Vergleich zu Zellen, die Steuer ASO und Cisplatin allein erhielt behandelt; nach 24 h Behandlung mit Cisplatin die Differenz in der Atmung zwischen BRCA...

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Diskussion

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Aufgrund der inhärenten Kosten und Risiken im Zusammenhang mit klinischen Studien, es notwendig ist, bessere und strengere präklinischen Testverfahren, um neue Anti-Krebs-Behandlung nicht ausreichend adäquat bewerten zu entwickeln. Strom häufigsten verwendeten Techniken alle Schwächen aufweisen, die ihre Fähigkeit, zwischen potentiell vielversprechende therapeutische Ziele / Agenten diskriminieren begrenzen kann, und jene, die weniger wirksam sein kann. Wir entwickelten ein Protokoll, um neue anti-Krebs Ansätze, die vie...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit durch Zuschüsse zu JK aus den Ontario Centres of Excellence und dem Ontario Research Fund ermöglicht.

Wir möchten Siddika Pardhan und Dr. Peter Ferguson, um technische Unterstützung während der Dreharbeiten zu danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A549 ZellenATCCCCL-185http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
AeraSeal FilmCarl Roth GmbH
AMEMWisent Bioproducts210-011-QK
Antisense OligodeoxynukleotideAveciaBRCA2 Zielsequenz: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (Basen 7241-7259 )
Axio Zoom V16 MikroskopCarl Zeisshttp://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
Bionas Biosensor ChipsBionas GmbH und Micronas GmbHBIS8001D
Bionas Discovery 2500 System Bionas GmbHhttp://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
CisplatinSigma Aldrich479306
Befruchtete HühnereierLokal bezogenes
fötales Rinderserum Gibco - Life Technologies
Lipofectamine 2000 Invitrogen - Life Technologies 12566014http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html
PBSWisent Bioproducts311-010-CL
Trypsin (0,25%)/EDTAWisent Bioproducts325-043-CL

Referenzen

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BRCA2 InhibitionCisplatin BehandlungAnalyse des ZellstoffwechselsBewertung der Metastasierungsh ufigkeitH hnerembryo CAM ModellAntisense OligonukleotideBiosensor ChipsEchtzeit MonitoringIn Vitro In Vivo

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