Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen einfachen, quantitativen kolorimetrischen Assay, der speziell die proteolytische Aktivität von Granzym B (GzmB) bei Mensch, Maus oder Ratte misst. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Proteaseaktivität anderer granulierter Serinproteasen durch die Hydrolyse anderer synthetischer Peptidsubstrate mit einer geeigneten Erkennungssequenz zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Serinprotease Granzyme B (GzmB) vermittelt die Apoptose der Zielzelle, wenn sie von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) oder natürlichen Killerzellen (NK) freigesetzt wird. GzmB ist das am besten untersuchte Granzym bei Menschen und Mäusen, und daher benötigen Forscher spezifische und zuverlässige Werkzeuge, um seine Funktion und Rolle in der Pathophysiologie zu untersuchen. Dies erfordert insbesondere Assays, die Proteasen wie Caspasen oder andere Granzyme, die strukturell oder funktionell verwandt sind, nicht erkennen. Hier wenden wir die GzmB-Präferenz für die Spaltung nach Asparaginsäureresten in einem kolorimetrischen Assay mit dem Peptidthioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl an. GzmB ist die einzige Serinprotease aus Säugetieren, die in der Lage ist, dieses Substrat zu spalten. Das Substrat wird mit ähnlicher Effizienz von Mensch, Maus und Ratte GzmB gespalten, eine Eigenschaft, die von anderen kommerziell erhältlichen Peptidsubstraten nicht geteilt wird, selbst wenn einige als für diesen Zweck geeignet beworben werden. Dieses Protokoll wird unter Verwendung von unfraktionierten Lysaten aus aktivierten NK-Zellen oder CTL demonstriert und eignet sich auch für rekombinante Proteasen, die in einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Systemen erzeugt werden, vorausgesetzt, die richtigen Kontrollen werden verwendet. Dieser Assay ist eine hochspezifische Methode zur Bestimmung der potentiellen pro-apoptotischen Aktivität zytotoxischer Moleküle in Säugetier-Lymphozyten und ihrer rekombinanten Gegenstücke, die durch eine Vielzahl von Methoden exprimiert werden.

Einleitung

Granzyme sind eine Familie von Serin-Proteasen, die in den sekretorischen Lysosomen von natürlichen Killerzellen (NK) und zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) ¹ gefunden. Fünf verschiedene Granzyme im Menschen vorhanden (A, B, H, K und M), und zehn Mäuse (A - G, K, M und N) ^2,3. Granzyme A und Granzyme B (GZMA, GzmB) sind die häufigsten und wurden umfangreich im menschlichen und Nagetier-Einstellung untersucht.

Die klassische Funktion GzmB ist die Induktion von Apoptose in Zielzellen in Verbindung mit der porenbildende Protein von Perforin, Granzym, die die an die Zielzelle Cytosol ⁴ Zugriff ermöglicht ausgeführt. Obwohl GzmB Expression unzweideutig in zytotoxischen Lymphozyten haben neuere Studien wurden zu einer Vielzahl anderer GzmB exprimierenden Zelltypen, einschließlich, aber nicht beschränkt Keratinozyten ^{5, 6} Basophilen, Mastzellen ^7, plasmacytoid dendritischen Zellen ^{8, 9} und ^{B-Zellen, 10.}In diesem Zusammenhang wurden nicht-apoptotischen GzmB Funktionen ergeben, die von der Teilnahme an entzündlichen Prozessen, Gewebeumbau und anderen immunregulatorischen Eigenschaften ^14.11.

Da eine breitere biologische Rolle für GzmB als bisher vermutet vorgeschlagen, Forschern erfordern zuverlässige und spezifische Werkzeuge für die Erkennung. Von Vorteil ist, GzmB die ausdrückliche Verpflichtung, in der Carboxylseite von Asparaginsäurereste, eine Eigenschaft, einzigartig unter den eukaryotischen Serinproteasen ¹⁵ zu spalten. Maus, Ratte und Mensch sind GzmB strukturell sehr ähnlich, aber die erweiterten Substratspezifität der Maus GzmB unterscheidet dezent von der Ratte und Mensch ^16, was bedeutet, dass bestimmte allgemeine Substraten mit Asp an der Klemme (P1) effizient durch GzmB gespalten von allen drei Spezies, während andere Substrate mit komplizierteren Sequenzen stromaufwärts von P1 kann stark unterschiedliche Ergebnisse ergeben. In der Vergangenheit und neuere literature hat diese Tatsache erhebliche Verwirrung und Fehlinterpretation der biologische Bedeutung einiger experimenteller Befunde verursacht, obwohl sorgfältig kontrolliert wurden kinetische Untersuchungen versucht, die Lage ¹⁷ zu korrigieren.

In dieser Arbeit haben wir versucht, diese Punkte unter Verwendung von zwei im Handel erhältliche Substrate, nämlich Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl und N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-Nitroanilid zu illustrieren. Die beiden Reagenzien zu tun erzeugen unterschiedliche reaktive Gruppen nach der Spaltung (eine freie Sulfhydryl gegenüber einer Leuchtstoff kostenlos Paranitroanilid), aber dies berührt in keiner Weise auf die proteolytische Spaltung. Das beschriebene Protokoll ist eine moderne Adaption eines sehr alten Protokoll ^18, sollte aber helfen Forschern, die verschiedenen GzmB Substrate angemessen zu nutzen, sondern schafft auch einen methodischen Rahmen zur Erfassung der Aktivität von anderen Granzyme wie GZMA und GzmH.

Protokoll

HINWEIS: Die Milz wurde aus Mäusen (6-10 Wochen alt) und alle Tierversuche wurden nach den Tierethik Richtlinien der Peter MacCallum Cancer Center (E486) durchgeführt.

1. Vorbereitung der Proben.

1. Herstellung von aktivierten Maus-NK-Zellen.
   1. Isolieren Primär naive NK-Zellen von Einzelzellsuspensionen von den Milzen von C57BL / 6 oder B6.GrzmB - / - (GzmB Gen null) Mäusen durch negative Selektion unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits.
   2. Folgen Protokoll der Hersteller. Kurz gesagt, magnetisch zu markieren "nicht-NK" Zellen, wie T- und B-Zellen, dendritischen Zellen, Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten unter Verwendung von Biotin-konjugiertem Antikörper gegen ihre spezifischen Oberflächenmarkern. Verwenden magnetischer Trennung mit Anti-Biotin-Perlen zu "nicht-NK" Zellen abzureichern.
   3. Kultur isoliert NK-Zellen für 5-7 Tage in Medium, das IL-2 (1.000 U / ml) bei 700000 Zellen / ml in 24-Well-Plattenbei 37   ° C.
   4. Alternativ aktiviert Verwendung T-Zellen ^19, primäre Antigen-restringierte CTL aus OT1 T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen ²⁰ erzeugte CTL in gemischten Lymphozyten-Kulturen ²¹ oder Überständen von aktivierten NK-Zellen, um die Aktivität der sekretierten GzmB ¹⁹ bestimmen.
2. Wartung der menschlichen NK-Zelllinie und Isolierung von primären NK-Zellen.
   1. Pflege der menschlichen NK Leukämie (YT-Zellen) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt. Alternativ reinigen primären NK-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden und für 2-3 Tage in einem Medium anzuregen, das IL-2 bei 100 U / ml, wie zuvor beschrieben ^22.
3. Erzeugung von Zelllysaten.
   1. Wash-Zellen dreimal in PBS (pH 7,4), dann in Nonidet P-40 Lysepuffer auszusetzen (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealerweise Lyse von mindestens 5 x 10 ⁶ NK-Zellen oder 1 · 10 ⁷ T-Zellen in 100 ul Puffer. Nicht hinzufügen Proteaseinhibitoren, wie viele sind irreversible Inhibitoren von Serinproteasen, insbesondere Tryptasen wie GZMA. Inkubieren auf Eis für 20 min, und dann die Kerne zu pelletieren in einer Mikrozentrifuge bei 15.000 × g für 10 min. Entsorgen Sie die Kernpellet und den Überstand in ein frisches Röhrchen.
4. Bestimmung der Proteinkonzentration der Lysate.
   1. Verwenden Sie ein handelsübliches Protokoll der Wahl, wie Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA) und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Sicherzustellen, dass die Konzentration von ~ 2 mg / ml Minimum. Speicher Lysate bei -20 ° C bis zur Verwendung (Granzym-Aktivität ist für viele Monate bei -20 ° C stabil).

2. Granzyme B-Aktivitätstest

1. Herstellung der Reagenzien
   1. Bereiten Sie eine 10 mM Stamm der Substrate (Boc-AAD-S-Bzl oder Ac-IEPD-pNA) in DMSO (~ 5 mg / ml) und lagern bei -20 & #176; C. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung frisch und entsorgen Sie nach jedem Tag, als Boc-AAD-S-Bzl teilweise bei der Lagerung in DMSO hydrolysiert.
   2. Bereiten Sie eine 250 mM Stamm der farbmetrischen Reagenz (5,5'-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) und bei -20 ° C. Bereiten Sie jeden Tag eine neue Arbeitsverdünnung. Dieses Reagenz ist nur für Substrate mit SBzl Indikatorgruppen nicht pNA erforderlich.
   3. Make-up frischen Puffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl _2, pH 7,3), alle 2-3 Wochen.
2. Bringen DTNB und synthetische Substrate auf Raumtemperatur. Verdünnen Substrate (01.16, zB 100 ul in 1,6 ml Puffer) und DTNB (1: 250, beispielsweise 10 & mgr; l in 2,5 ml Puffer) und gut mischen.
3. Verdünne ein Minimum von 100 & mgr; g Protein-Lysat von jeder Probe in einem Puffer, um ein Endvolumen von 160 ul. Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 50 ul pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung (~ 33,3 ug / Vertiefung) in einer '' U '' bottom Vinyl Platte mit 96 Vertiefungen.Fügen Sie eine "Puffer-only" Kontrolle (auch in dreifacher Ausfertigung).
4. 100 l verdünnt DTNB zu der Proben / Pufferkontrolle (bei der Arbeit mit Ac-IEPD-pNA lassen Sie diesen Schritt.
   HINWEIS: Die Spaltung von Ac-IEPD-pNA durch GzmB direkt frei fluorogenen pNA (4B).
5. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette um 50 ul verdünnt Substrate auf jeden Satz von dreifach schnell hinzufügen, beginnend mit dem Puffer dann negative Kontrollen und endend mit erwarteten positiven Proben.
6. Die Platte wird in der Plattenlesegerät. Messen Asp-ase-Aktivität durch Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in einem Mikroplatten-Lesegerät bei OD 405 nm. Verwenden Sie eine kinetische Assay-Protokoll, nehmen 25 Lesungen, alle 15 Sekunden (ca. 6 min Gesamtlesezeit).
7. Verwenden Sie die Absorptionswerte zu jedem Zeitpunkt erzeugt werden, um manuell berechnen die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, wenn die Software des Plattenlesegerät kann kein Wert für Vmax zu generieren.

3. Analyse Data

Hinweis: die erzeugt wird, wenn die maximale Geschwindigkeit präsentierten Daten, definiert als Veränderung der OD über die Zeit (mOD / min).

1. Um die Daten zu analysieren, zu bestimmen, die maximale Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, die von der Änderungsrate der Extinktion berechnet wird. Tun Sie dies automatisch mit dem Plattenlesegerät-Software, die in der Regel hat diese Option.
2. Alternativ nach der Anzeige der kinetischen Grundabsorptionsänderung, die während der kinetischen Assay auf dem Plattenlesegerät erzeugt werden, manuell auswählen, die Datenpunkte, die den steilsten gerade Linie zu geben. Für die meisten Tests wird innerhalb der ersten 2 min des Tests die maximale Rate erreicht.
3. Subtrahieren Sie die Anfangs-OD Lesung aus dem höchsten OD-Wert auf dieser geraden Linie und Gefälle durch das Zeitintervall. Übertragen Sie Rohdaten an Microsoft Excel / Graph-Pad für die statistische Analyse und grafische Darstellung.

Ergebnisse

Die Boc-AAD-S-Bzl Substrat spezifisch für GzmB

Die Serinprotease GzmB ist ein Hauptbestandteil von zytotoxischen Lymphozyten (CTL und NK-Zellen) und vorwiegend zur Induzierung schnelle apoptotischen Tod in Zielzellen, wie virusinfizierte oder transformierten Zellen verantwortlich. Dies ist vor allem aufgrund der Substratpräferenz für die Spaltung nach bestimmten Aspartatreste in ausgewählten Proteinen geteilt ein Attribut mit den Caspasen, die auch nach der Aspartatreste spa...

Diskussion

Historisch die Granzyme wurden als Schlüssel Effektormoleküle zytotoxischer Lymphozyten (CTL und NK-Zellen), die zur Induktion einer schnellen apoptotischen Tod in Zielzellen identifiziert. Dies war vor allem auf die Wirkung von GzmB, das Zielsubstrat Moleküle an Aspartat (D) Reste gespalten und somit konnte die Caspase-Kaskade von beiden spalten pro-Caspasen zu aktivieren, sowie mehrere ihrer nachgelagerten Ziele. Es ist jedoch nun ersichtlich, dass GzmB Expression ist nicht auf lymphoide zytotoxischen Zellen beschränk...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl	SM Biochemicals LLC, CA	SMSB05	Granzyme B-Substrat (Maus und Mensch)
Ac-IEPD-pNA	SM Biochemicals LLC, CA	SMPNA009	Granzyme B Substrat (nur human)
N-α-CBZ-L-Lysin-S-Bzl	Sigma-Aldrich	C3647	Granzyme A Substrat
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl	SM Biochemicals LLC, CA	SB025	Granzyme H Substrat
5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)	Sigma-Aldrich	D8130	DTNB, Ellman' s Reagenz
NK Zellisolationskit II Maus	Miltenyi Biotec GmbH	130-096-892	Negativ-Selektionskit
NK-Zellisolationskit human	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-657	Negativ-Selektionskit
Plattenleser	Biorad iMark		Biorad Microplate Manager Softwareversion MPM6.3
Serocluster U-Boden Vinyl 96-Well-Platte	Corning, MA, USA	2797