Methodenartikel

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

DOI:

10.3791/52423

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19. Februar 2015

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1Centre for Vascular Research, University of New South Wales, 2School of Medical Sciences, University of New South Wales

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um kontinuierlich zu quantifizieren Zelladhäsion und de-Klebeprozesse mit hoher zeitlicher Auflösung in eine nicht-invasive Weise durch Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging analysiert. Diese Ansätze zeigen die Dynamik der Zelladhäsion / de-Klebeverfahren durch Matrixmodifikation und ihre zeitliche Beziehung, um die Haftung abhängige Signalereignisse ausgelöst.

Zusammenfassung

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Zell-Matrix-Adhäsion spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Zellmorphologie und Signalisierung. Reize, Zellmatrixadhäsion (zB Myeloperoxidase und anderen Matrix modifizierende Oxidantien / Enzyme während der Entzündung freigesetzt) ​​stören an der Auslösung pathologischen Veränderungen der zellulären Funktion, Phänotyp und Lebensfähigkeit in einer Reihe von Krankheiten in Verbindung gebracht. Hier beschreiben wir, wie Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging Ansätze kann leicht verwendet werden, um Echtzeit-Änderungen der Zelladhäsion und de-Haftung durch Matrixmodifikation induzierte genau zu quantifizieren (unter Verwendung von Endothelzellen und Myeloperoxidase als pathophysiologische Matrix-modifizierende Stimulus) mit hoher zeitlicher Auflösung und in einer nicht-invasiven Weise. Die xCELLigence Zell-Substrat-Impedanzsystem kontinuierlich quantifiziert den Bereich der Zell-Matrix-Adhäsion durch die Messung der elektrischen Impedanz bei der Zell-Substrat-Grenzfläche in den Zellen auf Goldmikroelektrodenarrays gezüchtet. Bildanalyse von Zeitraffer-differenTiAl-Interferenzkontrastfilme quantifiziert Veränderungen der projizierten Fläche der einzelnen Zellen über die Zeit, die Änderungen im Bereich der Zellenmatrix-Kontakt. Beide Techniken genau zu quantifizieren schnelle Änderungen an der Zelladhäsion und de-Klebeverfahren. Zell-Substrat-Impedanz auf Mikroelektroden-Biosensor-Arrays liefert eine robuste Plattform für Hochdurchsatz-Messungen. Live Cell Imaging Analysen liefern zusätzliche Details über die Art und Dynamik der morphologischen Veränderungen von Zell-Substrat-Impedanzmessungen quantifiziert. Diese komplementäre Ansätze liefern wertvolle neue Einblicke in die Myeloperoxidase oxidative Veränderung der subzellulären extrazelluläre Matrixkomponenten löst schnellen Veränderungen bei der Zelladhäsion, Morphologie und Signalübertragung in Endothelzellen. Diese Ansätze sind auch anwendbar für die Untersuchung der zellulären Adhäsion Dynamik in Abhängigkeit von einer anderen Matrix-modifizierenden Stimuli und den damit verbundenen anhaftenden Zellen (beispielsweise Epithelzellen).

Einleitung

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Für die Wartung der Gewebshomöostase sind stabile Klebe Kontakte zwischen Zellen und ihrer Umgebung extrazellulären Matrix erforderlich. Sie spielt beispielsweise endothelialen Zelladhäsion an der subendothelialen Matrix, in die Blutgefäße eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der endothelialen Schicht und ihre homöostatischen Funktion als Regelungs semipermeable Gefäßschranke 1. Aktinzytoskeletts mechanisch gekoppelt Matrixmoleküle an Stellen von Zell-Matrix-Haftung und eine Kontakten an der Zellmatrix-Grenzflächenkleber spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Position der Zellmembran durch Widerstand zentral gerichteten....

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Protokoll

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1. Allgemeine Endothelial Cell Culture

  1. Kultur Endothelzellen der Rinderaorta (Gänge 4-9) auf Gelatine-beschichteten Gewebekulturflaschen (coat-Zellkulturoberfläche mit 0,1% w / v Gelatine in PBS bei RT für 15 min) in EGM-2-Medien (mit dem EGM-2 kugel Kit, enthaltend 5% fötales Rinderserum, Wachstumsfaktoren und alle Ergänzungen durch den Hersteller zur Verfügung gestellt, mit Ausnahme von Hydrocortison).
  2. Wenn die Zellen nahezu konfluent (ca. 3 Tage nach der Aussaat nach einer 1: 4-split), Ernten der Zellen durch Behandlung mit 0,05% w / v Trypsin / 0,02% w / v EDTA in PBS bei 37 ° C. Nachdem der Großteil der Zellen gelöst, fügen komplette EGM-2-M....

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Ergebnisse

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Echtzeit-Quantifizierung von Endothelzellen de-Adhäsion von Fibronektin als Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin (Experiment 2). Die Aussaat der endothelialen Zellsuspensionen auf nativen (MPO kostenlos) Fibronektin oder MPO-Lager Fibronektin ergibt maximale Zellhaftung und die Verbreitung innerhalb von 2 h, wie durch eine Plateaubildung der Zellindexwerte in dem Zellensubstrat Impedanzmessungen (3A) beurteilt. Diese Anfangsphase der Zellhaftung und Ausbreitung deutlich re.......

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Diskussion

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Zell-Matrix-Adhäsion und de-Klebeprozesse genau und in Echtzeit mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging-Analysen quantifiziert werden. Diese Echtzeit-Ansätze bieten einen großen Vorteil gegenüber Endpunktanalysen der Zelladhäsion, die schlechte zeitliche Auflösung zur Verfügung. Durch die präzise Quantifizierung schnellen de-Haft Reaktionen mit hoher zeitlicher Auflösung kann diese Analysen kritische Einblicke in geben, wie morphologische Reaktionen auf Matrix Änd.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Angaben zu machen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch einen Project Grant 568721 (SRT) des National Health and Medical Research Council (NHMRC) und teilweise durch einen Faculty Research Grant (MDR) der UNSW Faculty of Medicine finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Well-Gold-Zellsubstrat-Impedanz-Mikroelektroden-ArrayACEA Biosciences / RocheE-Plate 96Einwegplatte zur Durchführung zellbasierter Assays auf dem xCELLigence-System
blebbistatinSigmaB0560selektiver Inhibitor von nicht-Muskelmyosin-II-Rinder-Aorten-Endothelzellen
, kryokonserviert LonzaBW-6001
RinderserumalbuminSigma05470
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Endothelzellwachstums-Medienkit
Fibronektin, lyophilisiertesPulver SigmaF-4759aus Rinderplasma
Fluorodish 35 mm Zellkulturschale mit GlasbodenWorld Precision InstrumentsFD35-100Zellkulturschale mit Glasboden in optischer Qualität für die Bildgebung
Gelatine aus RinderhautSigmaG9391Zellkultursubstrat
Hank's Balanced Salt SolutionLife Technologies14025076
WasserstoffperoxidMerck107298
Medium-199Life Technologies11150-059serumfreie Zellmedien
MethioninSigmaM9500löscht chlorierende Oxidantien, die durch Myeloperoxidase erzeugt
, Myeloperoxidase, humane polymorphkernige LeukozytenMillipore475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence Zellsubstrat-ImpedanzsystemACEA Biosciences / RocheBestehend aus RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station und RTCA Control
Unit Trypsin-EDTA (0,5%)Gibco15400-054 
werden

Referenzen

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  1. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  3. Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J.....

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Schlagwörter

EndothelzellenMyeloperoxidaseFibronectin BeschichtungZeitraffer BildgebungDifferenzialinterferenzkontrastZellindex Messungen

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