Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt. Mit einer eigens konstruierten automatisierten Aufwickelvorrichtung können präzise und reproduzierbare Wunden unter Beibehaltung der Sterilität erzeugt werden.

Zusammenfassung

In-vitro-Modelle sind eine kostengünstige und ethische Alternative, um kutane Wundheilungsprozesse zu untersuchen. Darüber hinaus spiegeln diese Modelle durch die Verwendung menschlicher Zellen die menschliche Wundsituation besser wider als Tiermodelle. Obwohl zweidimensionale Modelle weit verbreitet sind, um Prozesse wie zelluläre Migration und Proliferation zu untersuchen, sind komplexere Modelle erforderlich, um ein tieferes Wissen über die Wundheilung zu erlangen. Neben einem geeigneten Modellsystem ist die Erzeugung präziser und reproduzierbarer Wunden entscheidend, um vergleichbare Ergebnisse zwischen verschiedenen Testläufen zu gewährleisten. In dieser Studie wird die Erzeugung einer dreidimensionalen Haut in voller Dicke gezeigt, die der Untersuchung der Wundheilung entspricht. Der dermale Teil der Modelle besteht aus humanen dermalen Fibroblasten, die in ein Rattenschwanz-Kollagen-Typ-I-Hydrogel eingebettet sind. Nach der Inokulation mit humanen epidermalen Keratinozyten und der anschließenden Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche bildet sich auf den Modellen eine mehrschichtige Epidermis. Um den Wundheilungsprozess zu untersuchen, haben wir zusätzlich ein automatisiertes Wundgerät entwickelt, das standardisierte Wunden in einer sterilen Atmosphäre erzeugt.

Einleitung

Die Haut ist das größte Organ des Körpers. Es schafft eine Barriere zwischen der äußeren Umgebung und der inneren Organe. Darüber hinaus schützt die Haut den Körper von Flüssigkeitsverlust, Umwelteinflüsse, Verletzungen und Infektionen und hilft bei der Körpertemperatur ¹ regulieren. Aufgrund seiner exponierten Lage ist die Haut oft durch mechanische, thermische oder chemische Trauma betroffen. Obwohl die Haut in der Regel in der Lage, Selbstreparatur ist, können mehrere lokale Faktoren wie Infektionen, Sauerstoffzufuhr und venösen Versorgung zu Wundheilungsstörungen führen. Die Wundheilung kann auch durch systemische Faktoren, wie Fettsucht, Alkoholismus,....

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll wird für die Produktion von 24 Vollhautäquivalenten entwickelt. Humane dermale Fibroblasten und Keratinozyten wurden aus Hautbiopsien nach einem vorher veröffentlichten Protokoll isoliert. ^21,22 Einverständniserklärung wurde zuvor erhalten und die Studie wurde von der Ethikausschuss für Menschenforschung der Julius-Maximilians-Universität Würzburg genehmigt (182 stimmen / 10).

1. Herstellung von Dermal Component

1. Löse Kollagen mit 0,1% Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von 6 mg / ml. Für die Gel-Neutralisationslösung, Mischung 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml fötalem Kälberserum, 7,5 ml 3 M HEPES....

Ergebnisse

Die isolierte HDF- und HEK unterscheiden sich sowohl in der Morphologie und der Expression von typischen Markierungen. HDF zeigten typische spindel Form Morphologie, während die Morphologie der HEK kann durch eine Kopfsteinpflastermorphologie beschrieben werden. Die Zellen wurden durch immunhistochemische Färbung (Figur 1) vor ihrer Verwendung für ftse gekennzeichnet. HDF positiv für Vimentin (1A), einem Marker für Fibroblasten. Primäre HEK hoch auszudrücken frühe Differenzierung Protei.......

Diskussion

In vitro-Zellen werden üblicherweise in zweidimensionalen Zellkulturen, in denen die Zellen auf Kunststoffoberflächen haften erweitert. Allerdings sind diese Kulturbedingungen nicht die physiologischen dreidimensionalen Bedingungen, bei denen Zellen in vivo wachsen zu reflektieren. Unter dreidimensionaler Bedingungen können Zellen, natürlichen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Bindungen einzugehen und wandern in drei Dimensionen. Besonders in der kutanen Wundheilung die Ähnlichkeit der in vivo Situat.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trypsin EDTA (1:250) 0,5 % in DPBS	PAA	L11-003	0,05 %
Dulbecco" s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	D8537
Kollagen (6 mg/ml in 0,1 % Essigsäure)	Hergestellt im eigenen
Haus Fibronektin Menschliches Protein, Plasma (50  &Mikro; g/ml)	Life Technologies	33016-015
Einsätze	Nunc	140627
6-Well-Platte	Nunc	140685
24-Well-Platte	Nunc	142485
Objektträger	R. Langenbrinck	03-0070<
DMEM, hoher Glukosegehalt	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fötales Rinderserum	Bio & FCS verkaufen	. ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten-Kulturmedium (500 ml):
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel-Neutralisationslösung (250 ml):
Dulbecco" s Modifiziertes Eagle Pulver mit mittlerem, hohem Glukosegehalt mit L-Glutamin	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitinsulfat-Natriumsalz aus Haifischknorpel	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fötales Rinderserum	Bio & FCS verkaufen	. ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Hautmodell submers medium (500  ml):
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2	Promocell	C-20111
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fötales Kälberserum	Bio & FCS verkaufen	. ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Hautmodell Luft-Flüssig-Grenzfläche Medium (500 ml):
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2 Ergänzungspaket	Promocell	C-39011	mit nur Supplementen: Insulin, Hydrocortison, Adrenalin, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin Antikörper	Abcam	ab92547
CK14 Antikörper	Sigma	HPA023040-100 & Mikro; l
CK10 Antikörper	Dako	M7002
Filaggrin Antikörper	Abcam	ab81468<
Mayer&akut; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Eindeckmedium	Sigma Aldrich	M1289-10ML