Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt. Mit einer eigens konstruierten automatisierten Aufwickelvorrichtung können präzise und reproduzierbare Wunden unter Beibehaltung der Sterilität erzeugt werden.

Zusammenfassung

In-vitro-Modelle sind eine kostengünstige und ethische Alternative, um kutane Wundheilungsprozesse zu untersuchen. Darüber hinaus spiegeln diese Modelle durch die Verwendung menschlicher Zellen die menschliche Wundsituation besser wider als Tiermodelle. Obwohl zweidimensionale Modelle weit verbreitet sind, um Prozesse wie zelluläre Migration und Proliferation zu untersuchen, sind komplexere Modelle erforderlich, um ein tieferes Wissen über die Wundheilung zu erlangen. Neben einem geeigneten Modellsystem ist die Erzeugung präziser und reproduzierbarer Wunden entscheidend, um vergleichbare Ergebnisse zwischen verschiedenen Testläufen zu gewährleisten. In dieser Studie wird die Erzeugung einer dreidimensionalen Haut in voller Dicke gezeigt, die der Untersuchung der Wundheilung entspricht. Der dermale Teil der Modelle besteht aus humanen dermalen Fibroblasten, die in ein Rattenschwanz-Kollagen-Typ-I-Hydrogel eingebettet sind. Nach der Inokulation mit humanen epidermalen Keratinozyten und der anschließenden Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche bildet sich auf den Modellen eine mehrschichtige Epidermis. Um den Wundheilungsprozess zu untersuchen, haben wir zusätzlich ein automatisiertes Wundgerät entwickelt, das standardisierte Wunden in einer sterilen Atmosphäre erzeugt.

Einleitung

Die Haut ist das größte Organ des Körpers. Es schafft eine Barriere zwischen der äußeren Umgebung und der inneren Organe. Darüber hinaus schützt die Haut den Körper von Flüssigkeitsverlust, Umwelteinflüsse, Verletzungen und Infektionen und hilft bei der Körpertemperatur ¹ regulieren. Aufgrund seiner exponierten Lage ist die Haut oft durch mechanische, thermische oder chemische Trauma betroffen. Obwohl die Haut in der Regel in der Lage, Selbstreparatur ist, können mehrere lokale Faktoren wie Infektionen, Sauerstoffzufuhr und venösen Versorgung zu Wundheilungsstörungen führen. Die Wundheilung kann auch durch systemische Faktoren, wie Fettsucht, Alkoholismus, Rauchen, Medikamente, Lebensmittel und Krankheiten wie Diabetes griffen werden. ²

(I) die Entzündungsphase, (ii) die proliferative und die (iii) Remodellierungsphase: Der Prozess der Wundheilung kann in 3 Phasen eingeteilt werden. Bei Verletzung der Haut beginnt eine komplexe Signalkaskaden, die zum Verschließen der Wunde. ³Nach einer Verletzung wird die Wunde Blutungen und ein Blutgerinnsel gebildet wird. Fibroblasten in die Blutgerinnsel zu bewegen und ersetzen sie durch neue Gewebe, die anschließend über Jahre umgebaut wird.

Das aktuelle Verständnis der biologischen Prozesse zugrunde liegenden Hautreparatur ist begrenzt. Kleintier und Schweinemodellen verwendet worden, um die Wundheilung zu untersuchen. Jedoch können diese Ergebnisse nicht direkt auf den Menschen durch speziesspezifische Unterschiede übertragen werden. Zusätzlich zu diesen in vivo-Modellen können einige Aspekte der Wundheilung durch Simulieren eines Wundsituation via Zerkratzen in vitro Schichtkulturen anhand von immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen untersucht werden kann. ⁴ Diese Kratzer Modelle sind weitgehend standardisiert, aber nicht ausreichend reflektieren das komplexen in vivo Physiologie ⁵ Neben zweidimensionalen Modellen. haben dreidimensionale menschliche Haut-Äquivalente für dermatologische Forschung entwickelt. Die dermale Teil dieser Modelle sind generated Verwendung verschiedener Gerüste einschließlich dezellularisierte Dermis ⁶ Kollagen Hydrogelen ^7,8 Glycosaminoglycane ⁹ oder synthetischen Materialien. ^{10, der} diese Hautäquivalente, die Rolle von epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen ^11, die Reepithelialisierung der zellulären Sprechen zwischen Fibroblasten und Keratinozyten und Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren untersucht werden können. Darüber hinaus sind diese Modelle nützlich, um neue Erkenntnisse darüber, wie Fibroblasten wandern in die verwundeten Bereich und wie chemotaktische Faktoren beeinflussen die Geweberegeneration zu erhalten. ¹²

Nicht nur die Erzeugung des Wundheilungsmodell selbst ist schwierig, aber auch die Einrichtung einer hochstandardisierten Wunde in einem Modell ist problematisch. Gemeinsame Techniken zu schaffen Wunden sind Kratztests, ¹³ Verbrennungen, ¹⁴ Bandabrieb, ¹⁵ thermische Schädigung, ¹⁶ Saugblasen, ¹⁷ mit flüssigem Stickstoff, ¹⁸ Laser, ¹⁹ Skalpelle, ¹⁸ Vernetzer ⁶ und Biopsieausstanzungen. ²⁰ Die meisten dieser Methoden haben die gleichen Fallstricke. Verletzungen manuell implementiert sind schwer zu standardisieren und zwischen Mehrfachtests zu reproduzieren. Größe, Form und Tiefe der Wunde liegen zwischen Studien und damit die Qualität der Forschungsdaten beeinträchtigen. Die Verwendung eines Lasers zur definierten Haut Verwundung relativ leicht standardisiert werden, sondern führt zu einer Situation nachahmt Verbrennungswunden. Wärme, die durch Laser angewendet kann dazu führen, Proteindenaturierung, Thrombozyten-Aggregation oder Gefäße Verengung, die nekrotischen Gewebes führen kann.

In einem alternativen Ansatz, ein automatisiertes Gerät Verwundung (AWD), die uns definiert und präzise Hautwunden unter sterilen Bedingungen zu generieren entwickelt. Verwundung Parameter wie Tiefe und Geschwindigkeit der Penetration sowie Umdrehungen des Bohrkopfes geregelt werden kann. In dieser Studie, kombinierten wir die AWD mit selbst entwickelten Vollhautäquivalenten (ftSE), die zu einer durch Gangatirkar et al veröffentlichten Protokoll vergleichbar sind. ^8. Die dermale Schicht des Hautäquivalent aus humanen dermalen Fibroblasten (HDF), die in einer Kollagen I Hydrogel eingebettet sind. Auf der Hautschicht, sind menschliche epidermale Keratinozyten (HEK) ausgesät. Innerhalb von zwei Wochen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche der HEK Aufbau einer Epidermis von mehreren lebenswichtigen Zellschichten und einer Hornschicht besteht. Neben der Generation dieses Modells zeigt diese Studie die Verwendung von AWD auf, genau definierten Wunden im FTSE erstellen.

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll wird für die Produktion von 24 Vollhautäquivalenten entwickelt. Humane dermale Fibroblasten und Keratinozyten wurden aus Hautbiopsien nach einem vorher veröffentlichten Protokoll isoliert. ^21,22 Einverständniserklärung wurde zuvor erhalten und die Studie wurde von der Ethikausschuss für Menschenforschung der Julius-Maximilians-Universität Würzburg genehmigt (182 stimmen / 10).

1. Herstellung von Dermal Component

1. Löse Kollagen mit 0,1% Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von 6 mg / ml. Für die Gel-Neutralisationslösung, Mischung 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml fötalem Kälberserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml Chondroitinsulfat (5 mg / ml). Halten Gel Neutralisationslösung und Kollagenlösung auf Eis. Berechnen Sie 500 ul Gel pro Einsatz / Hautäquivalent.
   Hinweis: Da die Gel-Neutralisationslösung wird mit zwei Teilen Kollagenlösung prepa gemischt werdenWieder doppelte Menge an Kollagen.
2. Zeigen 24 Einsätze in eine Platte mit 24 Vertiefungen.
3. Resuspendieren menschlichen dermalen Fibroblasten (HDF) in 10 ml DMEM, Zentrifuge für 5 Minuten bei 270 xg und zählen Sie die Zellen. Ermitteln der benötigten Menge aus HDF (5 x 10 ⁴ Zellen pro 500 ul Kollagen-Gel) und die Zentrifuge die Zellen 5 min bei 270 x g.
4. Entfernen Sie den Überstand und sorgfältig resuspendieren HDF in 4 ml gekühlte Gel-Neutralisationslösung, ohne Luftblasen. Von diesem Schritt stellen Sie sicher, so schnell wie möglich zu arbeiten, um ein vorzeitiges Erstarren der Kollagengele vermeiden.
5. Resuspendieren Sie die Lösung mit 8 ml Kollagenlösung.
6. Nehmen Sie die Kollagen-Zell-Mischung mit einem mehrstufigen-Pipette und füllen schnell 500 ul der Mischung in jedem Einsatz. Die Gele für 20 Minuten in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2), um die Gele gelieren.
7. Versenken der Gele in 2 ml nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Kälberserum (FCS) pro Wellund Inkubation er 24 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2).

2. Zugabe von humanen epidermalen Keratinozyten (HEK)

1. Entfernen Medium nach 24 Stunden. Löse Fibronektin Humanprotein mit hochreinem Wasser in einer Endkonzentration von 50 ug / ml. Cover jede Hautäquivalent mit 25 ul von Fibronektin-Lösung. Die Gele für 30 Minuten in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2).
2. In der Zwischenzeit resuspendieren HEK in 10 ml KGM-2 und setzen Zellkonzentration bis 1 x 10 ⁶ Zellen / ml mit KGM-2 bereit, + 5% FCS. Seed 1 x 10 ⁵ Hek auf jedem Gel. Gele Inkubieren für 45 min im Brutschrank (37 ° C, 5% CO _2), um Zellen zu haften.
3. Submerse die Gele mit KGM-2 bereit + 5% FCS und Kultur sie im Inkubator (37 ° C, 5% CO _2).

3. Kultur des Vollhautäquivalente (FTSE)

1. Kultur FTSE 6-7 Tagein absteigender FCS-Konzentration (5%, 2% bzw. 0% FCS). Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage mit der nächst niedrigeren FCS Konzentration. Dazu das Medium vollständig zu entfernen, und fügen Sie 1,6 ml frisches Medium.
2. Am Tag 7 Medium vollständig zu entfernen.
   HINWEIS: Der FTSE Oberfläche berühren nicht mit der Spitze der Pipette während dies zu tun.
3. Zeigen alle stecken in ein Well einer 6-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette. 1,5 ml Luftbrücke Medium pro Well, sorgen nicht in den FTSE Oberfläche benetzen. Ändern Medium alle 2-3 Tage für weitere 14 Tage.
   HINWEIS: Der Füllstand des Mediums ist Sache des Meniskus des FTSE.

4. Die histologische Analyse

1. Fixierung und Paraffin-Einbettung des FTSE
   1. Entfernen Kulturmedium, übertragen Einsätze in frische Platten mit 24 Vertiefungen und fixieren Gewebe durch Zugabe von 1,6 ml 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Gewebe für 2 h bei RT. Achtung! Paraformaldehyd ist giftig, manipulieren unter Abzug vornehmen. TransferDer FTSE auf eine gewebeEinbettungsKassette. Entfernen Sie verbleibende Fixiermittel durch Waschen mit Wasser und entwässern das Gewebe mit aufsteigenden Ethanolkonzentrationen.
   2. Teilen Sie die Hautäquivalent durch einen vertikalen Schnitt in der Mitte. Legen Sie die beiden Stücke in einem Paraffin gefüllten Metallgrundform mit Schnittflächen nach unten. Fügen Sie die Gewebekassette auf der Form als Unterlage.
   3. Schneiden Sie 3-5 um Scheiben und schweben sie auf einem 40 ° C Wasserbad für Begradigungen montieren Folien auf geeignete Objektträger. Trockene Scheiben gründlich.
2. Hämatoxylin und Eosin (H & E) und immunhistochemische (IHC) Färbung
   1. Platz rutscht in Rack und Inkubation für 1 h bei 60 ° C. Stellen Sie sicher, dass Paraffin geschmolzen ist. Stain rehydriert Scheiben mit H & E als standardisierte Übersichtsfärbung.
   2. Für H & E Färbung vorzubereiten 4x Glasfärbung Küvetten mit Xylol, 3x mit Ethanol 96%, 2x mit Ethanol 70%, 1x mit Ethanol 50%, 4x VE-Wasser, 1x Hämatoxylin, 1x HCl-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% Ethanol), 1x Leitungswasser, 1x Eosin (1 g Eosin in 100 ml VE-Wasser) und 2 x 2-Propanol.
   3. Die Objektträger 10 min in Xylol I und 10 min in Xylol II entparaffinieren und rehydrieren Rutschen. Dip Slides 3x in Ethanol 96% I, 3x in Ethanol 96% II, 3x in Ethanol 70% und 3x in Ethanol 50%. Drehen Sie Folien in VE-Wasser. Um Hämatoxylin Farbstoff, Tauch 2x in HCl-Ethanol unterscheiden. Spülen in deionisiertem Wasser. Zum Bläuen, Platz gleitet 5 min in Leitungswasser. Für Eosin-Färbung, Ort Folien 1 min in Eosin und anschließend waschen in VE-Wasser. Zur Dehydratisierung, 2x dip Folien in Ethanol 70%, 2x in Ethanol 96% und legt sie 5 min in 2-Propanol I, für 5 min in 2-Propanol II, 5 min in Xylol I und 5 min in Xylol II. Nach H & E Färbung, sind die Zellkerne in blau, Zytoplasma und der extrazellulären Matrix gefärbt sind rot gefärbt.
   4. Für Antigen-Retrieval, entfernen Paraffin mit Xylol und rehydrieren Scheiben für die Färbung. Die Scheibenin Dampfgarer und kochen entparaffinierten und rehydratisierten Schnitte für 20 Minuten im vorgeheizten 10 mM Citratpuffer (pH 6).
   5. Die Objektträger in Waschpuffer (PBS-Puffer + 0,5% Polysorbat 20) und Kreisscheiben mit einem flüssigkeitsabweisenden Schiebe Filzstift oder Diamantspitze.
   6. Die Objektträger in eine feuchte Kammer. Block endogene Peroxidase durch Zugabe von 100 ul 3% Wasserstoffperoxid-Lösung auf jede Scheibe. Achtung! Sehr gefährlich im Falle von Haut- und Augenkontakt. Handgriff mit persönlicher Schutzausrüstung. Wasch gleitet in Waschpuffer.
   7. Den primären Antikörper und Inkubation für 1 h bei RT. Wasch gleitet dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Von nun an sollten die Proben im Dunkeln gehalten werden.
   8. Verwenden Biotin-Streptavidin-Detektionssystem zum Nachweis von spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung.
   9. Gegenfärbung Kerne mit Hämatoxylin für 1 min. Entwässern und montieren Folien.
   10. Bild Proben unter Verwendung eines inversen Mikroskop.

5. Verletzungen, die durch Nutzung der automatisierten Verwundung Geräte (AWD)

1. Bereiten Sie die AWD durch Desinfektion der Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und UV-Licht. Achten Sie darauf, den Bohrkopf der gewünschten Größe (zB 1 mm) angebracht ist.
2. Zeigen Hautäquivalente in ausgewiesenen Bereichen des Autoklaven Probenträgerplatte mit einer sterilen Pinzette. Setzen Sie den Probenträgerplatte in die Buchse unter dem Bohrkopf.
3. Verwenden Sie die Steuersoftware, um verwundete Parameter wie folgt: Drehgeschwindigkeit: 15.000 min; Penetration: 1,5 mm; Antrieb: 100 Hz. Diese Parameter müssen für jeden Probentyp individuell festgelegt werden. Über Verwundung Parameter an die AWD.
4. Starten Verwundung Verfahren. Entfernen Probenträgerplatte aus der Steckdose. Über verwundet FTSE wieder in Einsätze für Kultur mit einer sterilen Pinzette eingesetzt.
5. Fahren Sie mit der Kultur der Verwundeten FTSE im Brutschrank (37 ° C, 5% CO ₂₎ zur Untersuchung der Regeneration. Alnativ, verwenden Sie die Modelle für die histologische Analyse zu jeder Zeit.

Ergebnisse

Die isolierte HDF- und HEK unterscheiden sich sowohl in der Morphologie und der Expression von typischen Markierungen. HDF zeigten typische spindel Form Morphologie, während die Morphologie der HEK kann durch eine Kopfsteinpflastermorphologie beschrieben werden. Die Zellen wurden durch immunhistochemische Färbung (Figur 1) vor ihrer Verwendung für ftse gekennzeichnet. HDF positiv für Vimentin (1A), einem Marker für Fibroblasten. Primäre HEK hoch auszudrücken frühe Differenzierung Protei...

Diskussion

In vitro-Zellen werden üblicherweise in zweidimensionalen Zellkulturen, in denen die Zellen auf Kunststoffoberflächen haften erweitert. Allerdings sind diese Kulturbedingungen nicht die physiologischen dreidimensionalen Bedingungen, bei denen Zellen in vivo wachsen zu reflektieren. Unter dreidimensionaler Bedingungen können Zellen, natürlichen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Bindungen einzugehen und wandern in drei Dimensionen. Besonders in der kutanen Wundheilung die Ähnlichkeit der in vivo Situat...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trypsin EDTA (1:250) 0,5 % in DPBS	PAA	L11-003	0,05 %
Dulbecco" s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	D8537
Kollagen (6 mg/ml in 0,1 % Essigsäure)	Hergestellt im eigenen
Haus Fibronektin Menschliches Protein, Plasma (50  &Mikro; g/ml)	Life Technologies	33016-015
Einsätze	Nunc	140627
6-Well-Platte	Nunc	140685
24-Well-Platte	Nunc	142485
Objektträger	R. Langenbrinck	03-0070<
DMEM, hoher Glukosegehalt	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fötales Rinderserum	Bio & FCS verkaufen	. ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten-Kulturmedium (500 ml):
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel-Neutralisationslösung (250 ml):
Dulbecco" s Modifiziertes Eagle Pulver mit mittlerem, hohem Glukosegehalt mit L-Glutamin	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitinsulfat-Natriumsalz aus Haifischknorpel	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fötales Rinderserum	Bio & FCS verkaufen	. ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Hautmodell submers medium (500  ml):
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2	Promocell	C-20111
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fötales Kälberserum	Bio & FCS verkaufen	. ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Hautmodell Luft-Flüssig-Grenzfläche Medium (500 ml):
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2
Keratinozyten-Wachstumsmedium 2 Ergänzungspaket	Promocell	C-39011	mit nur Supplementen: Insulin, Hydrocortison, Adrenalin, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin Antikörper	Abcam	ab92547
CK14 Antikörper	Sigma	HPA023040-100 & Mikro; l
CK10 Antikörper	Dako	M7002
Filaggrin Antikörper	Abcam	ab81468<
Mayer&akut; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Eindeckmedium	Sigma Aldrich	M1289-10ML