Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

Zusammenfassung

Die Haut beherbergt ein komplexes Immunzellnetzwerk. Wir beschreiben eine effiziente Methodik für die Verdauung von Maushaut aus verschiedenen Körperteilen des Tieres, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten und die verschiedenen Leukozytenpopulationen, die in der Haut leben, mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.

Zusammenfassung

Die Haut ist ein Barriereorgan, das mit der äußeren Umgebung interagiert. Da die Dermis und Epidermis ständig einer potenziellen mikrobiellen Invasion ausgesetzt sind, beherbergen sie eine Vielzahl von Immunzellen sowohl bei homöostatischen als auch bei entzündlichen Erkrankungen. Werkzeuge zur Erlangung der Freisetzung von Hautzellen für zytofluorimetrische Analysen sind daher sehr nützlich, um das komplexe Netzwerk von Immunzellen in der Haut und ihre Reaktion auf mikrobielle Reize zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine effiziente Methode für die Verdauung von Maushaut, um schnell und effizient Einzelzellsuspensionen zu erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung einer maximalen Zellviabilität, ohne die Expression von Oberflächenantigenen zu beeinträchtigen. Wir beschreiben auch, wie man Hautproben von verschiedenen anatomischen Stellen wie Ohr, Rumpf, Schwanz und Fußballen entnimmt und verdaut. Die erhaltenen Suspensionen werden dann gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert, um zwischen verschiedenen Leukozytenpopulationen zu unterscheiden.

Einleitung

Die Haut ist eines der größten Organe des Körpers und ihre große Oberfläche ist ständig der äußeren Umgebung ausgesetzt. Daher muss die Haut den Organismus vor potenziellen Bedrohungen schützen, um die Homöostase aufrechtzuerhalten, sowohl mit physikalischen Mitteln als auch durch aktiven Schutz vor einem möglichen Eindringen von Krankheitserregern. Ähnlich wie die Darm- und Lungenschleimhaut beherbergt die Haut eine Vielzahl von Immunzellen, die kontinuierlich mit dem Epithel interagieren, um die Immunüberwachung aufrechtzuerhalten. Dieses komplexe System, an dem sowohl Immun- als auch Nicht-Immunzellen der Haut beteiligt sind, ist seit den Anfängen der Immunologie anerkannt, als 1978 erstmals der Begriff "Hautassoziiertes lymphatisches Gewebe" (SALT) ¹ geprägt wurde, um eine solche Komplexität zu beschreiben.

Die große Anzahl von Immunzellen, die sich in der Haut befinden, hilft dem Organismus nicht nur, potenzielle Invasionen zu bekämpfen, sondern auch die Wundheilung zu orchestrieren und die Toleranz gegenüber Selbstantigenen und der Hautmikrobiota aufrechtzuerhalten ^2,3.

Unter den hautresidenten Immunzellen spielen dendritische Zellen (DCs) eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung von Immunantworten und der Aufrechterhaltung der Homöostase ⁴. Dermale DCs und Langerhans-Zellen reagieren bereitwillig auf Invasionen von Krankheitserregern und aktivieren bei der Migration zu den Lymphknoten T-Zellen und induzieren die Expression von Haut-Homing-Rezeptoren auf den neu gebildeten Effektor-T-Zellen ⁵. DCs spielen auch eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der Hauthomöostase. DCs, die unter homöostatischen Bedingungen von der Dermis zu den Lymphknoten wandern, transportieren sequestrierte Antigene der Haut mit dem Ziel, die T-Zell-Toleranz zu induzieren, hauptsächlich durch die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs), die spezifisch für die Hautantigene ^6-8 sind.

T-Zellen stellen die am häufigsten vorkommende Population von Immunzellen in der Haut dar. Sie infiltrieren nicht nur die Haut während einer Infektion, sondern stellen auch eine stabile Population unter den hautresidenten Lymphozyten dar ^9,10. Sowohl CD8⁺- als auch CD4⁺-residente Gedächtniszellen (rm)T-Zellen befinden sich in der Haut und können nach einer Infektion reagieren, lange bevor Effektor-T-Zellen aus dem Blut rekrutiert werden. In der Haut befindet sich auch eine Population von geweberesidenten Tregs, die in der Lage sind, die Toleranz gegenüber Hautantigenen und Gewebehomöostase aufrechtzuerhalten. Diese Zellen werden nach Exposition gegenüber ihrem verwandten Antigen schnell und potent aktiviert und wurden daher als Gedächtnis-Tregs ^{definiert 11,12}.

Zusammen mit DCs und T-Zellen bevölkern viele angeborene Immunzellen, wie NK-Zellen, Gamma-Delta-T-Zellen, ILCs der Gruppe 2 ¹³, Mastzellen und Makrophagen, die Haut und tragen zum Schutz des Wirts bei. Um eine solch komplexe Umgebung zu analysieren, ist es zwingend erforderlich, Einzelzellsuspensionen aus Hautproben mit hoher Effizienz zu erhalten und gleichzeitig die Expression von Oberflächenmarkern für die durchflusszytofluorimetrische Analyse oder Sortierung zu erhalten.

Maushaut weist eine äußere epidermale Schicht auf, die hauptsächlich aus Keratinozyten, Langerhans-Zellen und dendritischen epidermalen T-Zellen besteht; und die dermale Schicht darunter. Die Dermis beherbergt die meisten Immunzellen und besteht aus einer extrazellulären Matrix, in der Kollagenfasern am häufigsten vorkommen, insbesondere Kollagen-I und Kollagen-IV. Im Gegensatz zur menschlichen Haut ist die Haut von Mäusen mit Fell bedeckt und daher stärker mit Haarfollikeln besiedelt. Es ist auch viel dünner als die menschliche Haut und enthält eine Muskelschicht, den Panniculus carnosus, der die Wundheilung unterstützt ¹⁴. Diese Eigenschaften erschweren es, das Kollagennetz der Dermis effizient zu stören, um Immunzellen herauszuholen.

In diesem Artikel stellen wir eine geeignete Methode zur Verdauung der extrazellulären Matrix vor, die auf einem Cocktail aus hochreiner Kollagenase 1 und 2 und Thermolysin beruht. Da die Analyse von Haut aus verschiedenen Regionen unterschiedliche experimentelle Verfahren erfordert, werden wir außerdem verschiedene Methoden aufzeigen, um effizient Hautproben aus dem Fußballen, dem Schwanz, dem Ohr und dem Rumpf zu gewinnen. Anschließend werden wir die Proben markieren, um das Vorhandensein von DCs (MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺), Makrophagen (CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺), CD8⁺ und CD4⁺ T-Zellen zu bewerten.

Protokoll

Studienzulassung: Die experimentellen Protokolle wurden vom italienischen Ministerium für Gesundheit genehmigt (Rom, Italien) nach dem Decreto legislativo 27 novembre 1992, n. 116 "attuazione della Direttiva n. 86/609 / EWG in materia di Protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici."

1. Gewinnung Hautproben

1. Euthanize die Maus durch Genickbruch.
2. Ohr:
   1. Schneiden Sie den unbehaarten Teil der Ohren der Maus aus.
   2. Separate dorsalen und ventralen Seite durch sie auseinander mit einer Pinzette herausziehen. Entfernen Sie alle verbleibenden Knorpeln durch sanft den inneren Teil der Ohren mit einer Pinzette Schaben.
3. Trunk Haut:
   1. Rasieren Sie die ganze Haut des Tieres sowohl mit einem elektrischen Rasierer und mit zarten Enthaarungslotion.
   2. Schneiden Sie die gewünschte Hautprobe (von 2 cm ² bis zur gesamten Tierhaut) aus.
      1. Wenn die gesamte Rücken abschneidet und ventrale Mäusehaut, einen vertikalen Schnitt in der Mitte der Maus entlang der Grenzen der rasierten Bereichen rund um die Maus Körper zurück geschnitten und dann machen.
      2. Vorsichtig trennen die Haut aus dem Peritoneum und Rückenmuskulatur, immer noch mit der Pinzette die Hautprobe zu halten, während die Hautprobe mit geschlossenen runden kantigen Spitzen einer chirurgischen Schere oder einem Skalpell trennt.
   3. Bereiten Sie eine 100 mm Zellkulturplatte mit 10 ml eiskaltem PBS enthält.
   4. Beseitigen von subkutanem Fett durch Eintauchen der Hautprobe in PBS in der Platte, hergestellt in Schritt 1.3.3 und Abkratzen der Hautprobe mit einer Pinzette.
4. Schwanz:
   1. Schneiden Sie den Schwanz der Maus ab.
   2. Machen Sie einen vertikalen Schnitt auf den Schwanz mit einer chirurgischen Schere oder chirurgische Skalpell aus der Schwanzbasis beginnt und an der Spitze des Schwanzes zu erreichen.
   3. Verwenden einer Pinzette, um die Haut vom Schwanz zu lösen. Besorgen Sie sich die Kante des Schnitts an der Basis des Schwanzes und ziehen Sie vorsichtig die Spitze zu, während die HalteKörper des Schwanzes mit einer Pinzette.
   4. Entfernen Sie überschüssiges Fett durch die Hautprobe sanft kratzen.
5. Wegelagerer
   1. Schneiden Sie die gesamte Maus Fuß mit chirurgischen Schere. Vermeiden jede behaarter Haut zu schneiden.
   2. Schneiden Sie die Haut des Fußes in Längsrichtung vom Knöchel bis zum Beginn der Ziffern.
   3. Halten Sie die Knöchel mit einer Pinzette oder mit der Hand, während die Haut mit einer Pinzette greifen und ziehen Sie die Haut in Richtung auf die Ziffern, als ob, die ein Handschuh aus.

2. Verdauung

1. Bereiten Sie die Verdauung Cocktail aus der Stammlösung (hergestellt wie in der Materialliste) mit folgendem Rezept: Enzymmischung (siehe Materialliste für Spezifikationen) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Man verdünnt in RPMI 5% FBS.
2. Hacken Hautproben mit einer Schere in kleine Stücke in eine 35 mm Petrischale mit 2 ml Digestion Cocktail (Für Stamm Haut: 2 ml Verdauung Cocktail alle 2 cm ² der Haut, bis zu 3 ml insgesamt).
3. für 90 min bei 37 ° C inkubieren. Schütteln Sie die Petrischale 1-2 mal während der Inkubation.
4. Gießen verdaute Hautproben auf einem 70 & mgr; m Zellsieb in 66 mm Petrischale mit 1 ml RPMI1640 5% FBS.
5. Waschen Sie das Sieb mit 5 ml RPMI 1640 5% FBS.
6. Drücken Sie die Probe durch die Zelle Sieb mit einem Spritzenkolben.
7. Flush Kolben, Petrischale und Sieb mit 20 ml RPMI1640 5% FBS, Transfer in 50-ml-Tube.

3. Antikörper und Labeling

1. Waschen der erhaltenen Suspension zweimal mit 5 ml PBS, das 1% FBS (oder BSA).
2. Beschriften Sie die erhaltene Zellsuspension mit den gewünschten Antikörper.
   1. Resuspendieren der Proben in 100 ul / Probe einer Mischung enthaltend 2 & mgr; g / ml aCD16 / CD32 (Klon 2.4G2), verdünnt in PBS 1% FBS.
   2. 15 min Inkubieren bei 4 ° C, um nicht-spezifische Bindung der gewünschten Antikörper via Fc-Rezeptoren zu blockieren.
   3. Fügen Sie die angegebenen Antikörper in der Tabelle1.
      1. Bereiten einer Mischung die gewünschten Antikörper in 100 & mgr; l / Probe von PBS 1% FBS in einer Konzentration von 4 ug / ml verdünnt.
      2. Füge 100 & mgr; l des in Schritt hergestellten Mischung 3.2.3.1 zu jeder Probe, so dass in dem Rohr, wird es in einer Endkonzentration von 2 & mgr; g / ml mit einem Volumen von 200 & mgr; l der Antikörpermischung sein.
   4. Inkubieren für 30 min bei 4 ° C und die Abdeckung von Licht.
3. Waschen mit 1 ml PBS, das 1% FBS, Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 · g, den Überstand verwerfen und resuspendieren in 300 ul PBS, das 1% FBS.
4. Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 2 & mgr; g / ml und Inkubation bei 4 ° C, geschützt vor Licht für 10 min.
5. Analysieren Sie die Proben durch FACS erhalten.
   1. Um Leukozyten zu isolieren, verwenden Sie die folgende Gating-Strategie:
      1. Zuerst beseitigen alle toten Zellen durch auf der DAPI- Bevölkerung Gating.
      2. Wählen Sie Singuletts im FSC-A gegen FSC W Plot , wie in Abbildung 1 angegeben .
      3. Tor die darauf basierenden Zellen nach Größe und Granularität typisch für die Leukozyten von Interesse.
      4. Wählen Sie CD45 + Zellen in der FSC-A CD45 Plot wie in Abbildung 1 dargestellt.
   2. Unterscheiden die verschiedenen Populationen von Leukozyten durch die Expression von Oberflächenmarkern, wie folgt:
      1. Identifizieren DCs als CD11c ⁺ MHC II ⁺ Zellen. Diese können später für die Expression von CD207 analysiert werden, um zu unterscheiden, Langerhans'schen Zellen und CD207 + Dermal DCs von CD207- Dermal DCs.
      2. Identifizieren Makrophagen als CD64 + F4 / 80 + Zellen.
      3. Identifizieren B-Zellen als CD19 + MHCII + Zellen.
      4. Identifizieren T-Zellen als CD8 + oder CD4 + Zellen.

Ergebnisse

Haut von anderen Bereich des Körpers wurde gemäß dem Protokoll, verdaut mit den angegebenen Antikörpern beschrieben und fleckig. Die Gating - Strategie ist in Abbildung 1. Wählen Sie zuerst lebende Zellen (DAPI- Zellen), dann Tor auf Singuletts (FSC-A gegen FSC-W) und auf Zellen mit Lymphozytenmorphologie (FSC-A vs. SSC-A) dargestellt. Wenn angegeben, werden CD45 ⁺ Zellen aus hämatopoetischen Ursprungs ausgewählt.

Diskussion

Wir haben ein Verfahren zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus verschiedenen Maushautregionen beschrieben. Verfahren nach Verdauung wir angenommen haben, verursacht nicht nur hohe Ausbeuten, sondern bewahrt auch die Expression von Oberflächenmarkern, die für die nachfolgende FACS-Analyse von grundlegender Bedeutung ist.

Die Verwendung eines Cocktails von Kollagenase I und II und Thermolysin, garantiert minimale Charge zu Charge unterschiedliche Enzymaktivität macht dieses Verfahren s...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Ergänzt RPMI 1640 mittel			RPMI1640 supplementiert mit L-Glu, Pen-Strepto-Strepto-Präparat ohne Beta-Mercapto-Ethanol
PBS
FBS
Liberase TM (Enzym-Mix)	Roche	5401119001	resuspendiert [2,5  mg/ml] in dH2O; Lagern Sie Aliquots bei -20  ° C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	resuspendiert in RPMI 1640 ohne Serum [1.000  U/ml]
Materials
Chirurgische Schere
Chirurgische Pinzette
Chirurgisches Skalpell
35 mm Petrischalen
66 mm Petrischalen
100 mm Petrischalen
70 & Mikro; m Zellsiebe	BD	352350
Verdauungscocktail			Verdünnt in RPMI 5% FBS
LIberase TM			300 & Mikro; g/ml
DNAse1			50 U/ml
Antikörper
Name	Company	Clone	>
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC