Abstract
뇌졸중의 실험 동물 모델은 스트로크의 병리를 이해하고보다 효과적인 치료 전략을 개발하기위한 매우 중요한 도구입니다. 반복적 저산소 전처리 (RHP) 대 이주 프로토콜 국소 허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 중추 신경계 (CNS) 상해에 대하여 장기간 보호를 유도한다. 우완 두 기간 (2 ~ 4 시간)와 강도 (8 %와 11 % O 2)에 따라 다릅니다 저산소증 9 확률 적 노출로 구성되어 있습니다. 우완는 내인성 중추 신경계 보호 표현형의 장기 유도를 제안, 경색 볼륨, 혈액 - 뇌 장벽 (BBB) 중단 및 저산소증에 마지막 노출 다음 주 이후 행정 염증 반응을 감소시킨다. 경색 볼륨 및 BBB 중단의 이중 정량 방법은 우완 또는 다른 추정 neuroprotectants와 생쥐의 신경 혈관 보호 기능을 평가하는데 효과적이다. 성인 남성 스위스 웹스터 마우스는 21 % O로 우완 또는 기간 - 상응하는 노출에 의해 미리 조정했다
Introduction
성인 장애와 사망의 네 번째 주요 원인의 주요 원인으로, 뇌졸중은 미국의 성인 인구가 직면 한 가장 쇠약 질병 상태 중 하나입니다. 뇌졸중의 1 동물 모델은 허혈 손상을 감소시키는 새로운 방법과 실험 조사 허용 졸중 회복을 개선시킨다. 등의 중개 연구에 대한 하나의 새로운 길을 사전 조정된다. 전처리는 후속하는, 더 심한 부상으로부터 손상을 줄이기 위해 비 손상 자극의 의도적 인 사용이다.이 저산소 전처리는 생체 내 및 시험 관내 연구에서 모두 스트로크에 대한 보호를 제공하는 뇌의다면 발현 변화를 생성하는 것으로 나타났다 . (3) 그러나, 저산소증에 하나의 노출은 성인 쥐에서 허혈에 대한 허용 오차 미만의 72 시간을 유도, 단기 신경을 제공합니다., 린 등 기압 성 저산소증에 14 시간 매일 노출의 4도 네 후 주. FO싶게 그 신경은 일주. 5 반복 저산소 전처리 (RHP) 지속 하였다는 주파수, 기간, 저산소 노출의 강도의 확률 적 변화에 의해 특징입니다. 단일 전처리 도전 달리 RHP 쥐 여덟 주까지 지속 cerebroprotective 표현형을 유도한다. 6 RHP 최종 저산소 노출 후 주 경색 부피, 혈액 - 뇌 장벽 (BBB) 장애, 혈관 염증 및 백혈구 diapedesis 감소 . RHP 구체적 허혈성 반구에서 B 세포 개체군을 유지하면서, T 세포, 단핵 세포 및 대식 세포 개체군을 감소시켜 허혈성 뇌의 염증을 감소시켰다.도 7은 실제로 RHP 뇌졸중을 포함한 모든 CNS 부상 전에 마우스의 면역 표현형을 유도. RHP 처리 건강한 쥐로부터 분리 RHP 처리 B 세포는 항원 제시 및 항체 생산의 하향 조절 모두에, 고유 항 염증 표현형을 나타내었다.염증성 적응성 면역 기전에 전체적인 감소뿐만 아니라 특정 CNS 염증성 질환에 대한 내인성 면역 억제를 유도하기 위하여 RHP에게 우수한 방법론하게 할뿐만 아니라 염증성 병태를 포함 전신성 상해 또는 질병 모델.
우완는 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 (결과 tMCAO) 다음 경색 볼륨 및 BBB 중단을 모두 줄일 수 있습니다. 이러한 일반적으로 사용되는 결과 tMCAO 같이 뇌졸중 동물 모델은 극적 뇌졸중 병태 생리에 대한 이해뿐만 아니라, 더욱 효과적인 neurotherapeutics의 디자인을 향상시킬 수있다. 우선 고이즈미 총리 등의 알에 의해 개발., 1986 년, 8 결과 tMCAO 절차는 설치류에서 뇌졸중 및 재관류 다음과 같은 염증을 조사하기위한 바람직한 방법 중 하나를 유도하는 널리 사용되는 방법이다. 결과 tMCAO위한 방법들이 발전함에 따라, 실리콘 코팅 된 섬유의 최근 이용은 또 다른 모델 9,10 <비교 지주막 하 출혈의 위험을 줄일/ SUP> 불행하게도 결과 tMCAO 자주 경색 볼륨에 다양한 변화를 생산 불구하고, 신뢰성을 향상시킬 수있다. 11-13 이러한 연구의 대부분은 2,3,5- 트리 페닐 클로라이드 (TTC)로 염색하여 관상 뇌 부분에서 경색 영역을 서술 고려 경색 정량 금 표준은 선명한, 복제 가능한 결과를 생성하기위한 간단하고 저렴한 방법이기 때문이다. TTC는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소의 기판 역할을합니다. 뇌 조각은 TTC 용액에 노출되면 포르 마잔의 비 수용성 감소 제품, 가능한 미토콘드리아에 깊은 붉은 색 침전 경우, TTC는 선택적으로 살아있는 세포로 촬영됩니다. 때문에 허혈성 조직에서 미토콘드리아 기능 장애의,이 조직 손상과 건강한 조직의 분화를 허용, 흰색 남아있다. (14)
우완 또한 허혈성 반구에서 BBB 중단을 줄일 수 있습니다. (6) 따라서, BBB 무결성의 이중 정량화 같은 B 내에서TTC 기반 경색 볼륨과 비는 내인성 보호의 전체 효과에 대한 유용한 정보, 치료 및 치료 동물에서 BBB 중단 및 경색 사이의 잠재적 인 인과 관계를 제공 할 것 15 결정. 뇌졸중 이차 중단 BBB,,를 통해 말초 혈액의 유입은 궁극적으로 허혈성 뇌졸중 환자에서 감염과 사망률의 비율을 증가, 허혈성 반구에 백혈구 인구, 염증성 사이토 카인, 산화 스트레스, vasogenic 부종, 출혈성 변환을 증가 . 16,17 동물 모델에서 BBB 중단을 측정하는 일반적인 방법은 뇌에 에반스 청 (EB) 염색 누설 정량화 통해서이다. 15,18-21 EB 선택적 알부민, 구형 단백질 혈청에 결합 (MW = 65 kDa의) 즉 손상되지 않은 동물에 BBB를 통과하지 않습니다. (22) 허혈성 뇌졸중에 이어, EB는 뇌를 침투, 광학 밀도 withi의 측정을 허용, 620 nm에서 형광을N 관류 부상 실질. (22) 광학 밀도는 EB는 (rongeur)로하여 사후 대뇌 피질의 혈관에서 세척 된 BBB의 투과성에 직접적으로 비례한다. EB 관리와 동물 TTC 염색 뇌의 즉각적인 처리와 함께, 경색 볼륨과 BBB 중단을 모두 효과적으로 정량화 할 수있다. 이것은 신경 상해 및 BBB 붕괴가 뇌졸중 후 뇌의 프로세스가 수반되지임을 인식하여야한다, 그래서 23,24 희생의 시간의 선택은 중요한 고려 사항이다.
다음 프로토콜 RHP 방법, 임시 동맥 폐색을 유발 결과 tMCAO 방법 자세히 모델링 인간 환자에서 중간 대뇌 동맥 폐색, 신경 및 혈관 뇌졸중 손상 엔드 포인트를 결정하는 이중 조직 학적 방법. TTC는 전체 경색 부피의 정량화를 허용 세포사 누적 조직 손상을 측정매화, EB는 BBB 손상의 반구 정량을 제공한다.
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Protocol
참고 :이 프로토콜은 실험 동물 사용에 대한 건강 (NIH) 정책에 대한 국립 연구소 준수 UT 사우스 웨스턴 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 반복 저산소 전처리
- 사용자 정의 디자인 사 가스 규제에 유량계와 (O 2) 탱크 입구 포트를 통해 챔버로 유입 산소로부터 압축 가스를 할 수 있도록 PVC 튜브 표준 15 패 유도 챔버에 연결합니다. 사용자 정의 디자인에 대한 자세한 내용은 장비 및 재료를 참조하십시오.
- 8 %와 11 % O 2에 노출을받을 반복 저산소 전처리 (RHP) 그룹, 및 제어 그룹, 동시에 21 % O 2 (실내 공기)에 노출을받을 : 2 그룹으로 마우스를 나눈다. 주파수의 변화는 표 1을 참조 강도 (8, 11 % O 2, 21 % O 2) RHP 노광의 지속 시간 (2 또는 4 시간). </ 리>
- 각각의 O 2 탱크에 연결된 실에 그대로 음식과 물 병, 각 케이지의 상단 필터 덮개를 제거하고 케이지를 놓습니다. 닫고 실의 덮개를 고정.
- 탱크의 메인 가스 밸브를 열고 노출의 처음 5 분 동안 분 (LPM) 당 2 L로 각각 유도 챔버의 초기 흐름을 설정합니다. 노출의 나머지 하나 LPM로 유량을 감소시킨다.
- 노출의 끝에서 0으로 LPM 흐름을 감소하기 위해 탱크 및 가스 밸브를 닫는다.
- 챔버 뚜껑을 열고 각 케이지의 필터 상단 덮개를 교체합니다. 다음 저산소 노출 될 때까지 표준 주택의 새장을 배치합니다.
- NPD (스테리스) 또는 사용 후 동등한 소독 / 탈취 각 유도 챔버를 스프레이.
- 표 1에 기재된 바와 같이 2 주간에 걸쳐 매일 같은 시간에 21 % 및 RHP 마우스 모두 노출.
2. 과도중뇌 동맥 폐쇄 (결과 tMCAO)
- 최종 우완 노출 다음 스트로크의 타이밍에 대한 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
- 무균 수술 직장을 준비합니다. 70 % 에탄올 또는 동등한 살균제 및 모든 수술 도구를 압력솥과 깨끗한 주변 직장입니다.
- 뇌 혈류 (CBF)에 상대의 변화를 측정 할 수있는 레이저 도플러 Flowmetry (LDF) 악기를 설정합니다. 37 ° C까지 가열 패드의 전원을 켭니다. 34 ° C에서 인큐베이터를 켭니다.
- 작은 유도 실에서 4 % 이소 플루 란 / 70 % NO 30분의 2 %의 O 2의 혼합에 대한 간략한 노출 쥐를 마취. 가볍게 발을 곤란하게하여 적절한 마취를 확인합니다. 마우스가 발을 인출하는 경우, 유도 챔버에 마우스를 이소 플루 란 노출 돌아가서 계속.
- 마취 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 신속하게 코 콘에서 마우스의 코를 삽입합니다. anes에 흐름을 개폐 노즈콘에 가스 유동을 열고thesia 유도 챔버.
- 70 %의 NO 2 / 30 % O 2 가스 혼합물을 변경하지 않고, 과정의 나머지 유지 용량으로 1.8 %의 이소 플루 란을 고정한다. 호흡은 느리고 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 남아 있지만, 호흡이 빠르고 얕은 될 경우, 이소 플루 란 용량을 늘려야합니다. 유지 용량은 실험에 사용 된 장비의 제조 및 동물 사이에 차이가있을 수 있습니다.
- microshaver을 사용하여, 눈 및 귀 모서리뿐만 아니라 목 복부 정중선와의 시간적 영역에서 모발을 면도. 과잉 모피를 제거하고 절차를 수행하는 동안 건조에서 각막을 유지하기 위해 멸균 면봉으로 안구 윤활제를 적용합니다. 무균 상태를 유지하기 위해 멸균 면봉으로 알코올 패드와 면봉 프로 비돈 - 요오드와 절개 영역을 닦습니다.
- 설치류 수술 지침에 따라 진통제를 관리.
- 눈과 귀 사이의 시간 피부를 통해 절개를합니다.측두근 근육을 노출. 수술 마이크로 가위를 사용하여, 흰색 근육 줄무늬의 영역 내에서 시간적 능선에서 시간적 근육 인대를 잘라.
- 부드럽게 두개골을 통해 중간 대뇌 동맥 (MCA)를 시각화하는 집게와 함께 옆으로 근육의 대부분을 누릅니다. 시간적 근육의 절개를 한 후,이 지역은 혈액으로 채워질 수 있습니다. 부드럽게 잠재적 인 출혈이 새지하기 위해 면봉을 사용합니다.
- MCA 영역 LDF 프로브 팁 타겟팅. 이 지역은 쥐 사이에서 변화로 선정 용기를 기록합니다.
- 안정된 적혈구 플럭스가 판독 될 때까지 두개골 장소 플러시 LDF를 잡고 기준선 CBF이 값을 기록한다. 레이저 도플러 Flowmetry에 이상적인베이스 라인 CBF는> 600 플럭스하지만이 제조업체에 따라 달라질 수 있습니다. CBF 기준선이 <400 플럭스는, 플로우가 기록 인근 정맥 또는 타겟 용기 위에 프로브의 불완전한 위치로부터 가장 가능성이있다.
- 기준 CBF이 설정되면, repositi마우스 있도록 목에 노출된다. 머리를 지원하고 노즈콘에서 정상 마취하에 마우스를 유지.
- 바로 쇄골에 하악 아래에서 복부 정중선 절개를합니다.
- 집게를 사용하여, 왼쪽 경동맥 (CCA)를 노출하는 모든 피상적 인 근막을 해부 무딘. 결합 조직 및 미주 신경에서 CCA를 분리합니다.
- 영구적으로 6.0 실크 봉합사와 CCA를 결찰. 필라멘트 배치를 폐색하기위한 충분한 공간을 허용 가능한 인접으로 결찰 봉합사를 놓습니다.
- 루프 느슨하게은 폐색 봉합에 CCA의 말단 주위에 두 번째 실크 6.0 봉합 넥타이. 흡장 필라멘트 이후 경동맥에 통과되는 바와 같이 동맥을 폐색하지 않도록주의하십시오.
- 느슨하게 묶어 실크 봉합사로 CCA의 말초 클램프 8 × 2mm 빛 마이크로 serrafine areterial 클램프를 사용합니다. 부드럽게 집게와 CCA를 들어 올려 결찰 봉합사로에 인접 같이 작은 종 절개를3mm의 vannas와 수.
- 동맥 루멘을 입력 절개 12mm 실리콘 코팅 6.0 게이지 나일론 필라멘트를 흡장 스레드 후 몇 mm 전진. 느슨하게 CCA에서 필라멘트를 밀어 동맥 클램프를 제거하지 않습니다 혈액의 흐름을 보장하기 위해 흡장 필라멘트의 끝 주위에 두 번째 느슨한 실크 봉합사를 조입니다.
- 내 경동맥에 CCA (ICA)와 외부 경동맥 (ECA)의 첫 번째 분기에 9 10.5 밀리미터 과거 ICA.Advance에게 폐색 필라멘트를 입력 할 첫 번째 분기의 오른쪽 지점에 흡장 필라멘트 스레드 왼쪽 경동맥 (ICA)에 두 번째 실크 봉합사.
- 곧 ICA를 입력 한 후, ICA와 pterogopalantine 동맥 (PPA)의 두 번째 분기점에서 왼쪽 지점에 흡장 필라멘트를 진행합니다. PPA의 시각화는 흡장 필라멘트의 전체 배치와 가벼운 저항을 느낄 때까지 그렇게 계속 않을 수 있습니다.집게와 ICA를 들어 올리면 필라멘트가 두 번째 birfurcation의 왼쪽 지점에 더 쉽게 스레드하는 데 도움이 될 수 있습니다. 두 번째 실크 봉합사를 조입니다.
- MCA를 통해 절개가 표시되도록 마우스를 켭니다. LDF 장비, CBF는 LDF 판독을 통해 차단되어 있는지 확인합니다. 성공적인 폐색 기준 CBF에서> 80 % 감소이다.
- 적절한 위치가 달성 될 때 완전히 두 번 매듭을 흡장 필라멘트 주위에 두 번째 실크 봉합사를 강화합니다. 필요한 경우, 약간의 밀거나 성공적인 폐색 (기준 CBF에서 예> 80 % 감소)에 대한 CBF 기준을 달성하기 위해 폐색 필라멘트를 잡아 당깁니다.
- 6.0 나일론 봉합사와 목과 머리 개방을 닫습니다.
- 폐쇄 기간 동안 34 ° C 배양기에 넣어 마우스. 폐색의 권장 길이는 60 분이지만,이 나이, 변형에 의존하는 뇌 혈관 해부학, 25의 차이 injur의 정도에 따라 다릅니다Y는 (경증, 중등도, 중증) 원하는. 동물 마취를 오는 분 이내에 의식을 회복해야합니다.
- 단계 2.3에 기재된 바와 같이, 이소 플루 란 동물을 다시 마취, 5 분간 미리 정의 폐색 기간의 종료 전에, 두피 절개를 열고 MCA 관류 여전히 두개 LDF 판독을 이용하여 감소되는 것을 확인한다. CBF가 충분히 (예, <20 %의 기준선 CBF)이 감소되지 않은 경우는 MCA 폐색 동안 어떤 시점에서 재관류하고 마우스는 상기 실험에서 제외한다.
- 정중선 목 절개를 열고 느슨하게 CCA 주위에 세 번째 실크 봉합사 넥타이, CCA의 분기점에 두 번째 실크 봉합사하지만 근위 원위부는 필라멘트가 제거 된 후 외부 경동맥 (ECA)이 가능한 남아 있는지 확인합니다.
- 잘라 내기 또는 폐색 필라멘트 (즉, 두 번째 실크 봉합사)를 보유하고 매듭을 풀어 천천히 폐색 필라멘트를 철회. 제거 후에 재빨리를 닫고CCA 주위에 세 번째 실크 봉합사는 ICA에서 혈액의 역류를 최소화합니다. 두 번 매듭이 봉합과 6.0 나일론 봉합사와 절개를 닫습니다.
- 재관류의 5 분 후 CBF의 수준을 정량화 마우스 위치를 조정합니다. 성공적인 재관류 일반적 폐색 흐름으로 연구자들이 자신의 기준을 설정할 수 있고, 기준 CBF의> 50 %의 CBF로 정의되지만. 동물이 그들의 기준선의 50 % 미만을 나타낼 CBF 경우 MCA는 '영구적'가려진 것으로, 따라서 다른 연구 배제 기준을 나타낸다.
- 6.0 나일론 봉합사와 모두 절개를 닫습니다. 설치류의 지침에 따라 식염수, 마취제 (리도카인), 항생제을 제공합니다. 그러나 항생제 (미노사이클린의 3 mg을 / ㎏)의 일부 소량은 신경 다음 스트로크 것으로 밝혀졌다. (26)
- 깨끗하고 무균 케이지 수술, 장소 마우스 다음 가열 된 인큐베이터에서 의식을 회복 한 후. 젖은 foo에 제공d 또는 영양 수화 젤식이 보충제 및 동물로 물 페트리 접시 뇌졸중 다음 이동성을 제한 할 것이다. 과도한 수술 후 통증과 죽음에 대한 복구 중에 밀접하게 동물을 모니터링합니다.
3. 에반스 블루 (EB) 주입
- 재관류 후 EB 22 시간을 주입하고 희생과 TTC 염색하기 전에 2 시간 동안 혈액에서 순환한다.
- (염수 중 2 % EB) 주입 EB 용액을 만들고 부드럽게 실온에서 혼합한다. 필터 여과지 또는 용액을 실온에서 작은 불용 EB 제거 주사기 및 저장소에 부착 0.2 ㎛의 필터를 통해 밀어.
- 주입에 필요한 EB 량 (4 ㎖ / 체중 kg)을 29 게이지 바늘로 0.3 CC 인슐린 주사기에 염료의 원하는 양을 그리고 용액이 상온에있을 것을 보장 할 준비
- 평평한 바닥 제한 수단을 사용하여 마우스를 억제. 횡 정맥 UPP이되도록 꼬리를 잡고ermost. 측면은 꼬리 정맥의 중심선의 양측에 위치한다. 주입을위한 꾸준한 마우스를 유지하기 위해 꼬리의 끝을 잡고.
- 정맥을 관통하지 않도록주의, 정맥에 약 3.5 mm의 바늘을 삽입합니다. 바늘이 주사기에 다시 그리기 및 혈액의 흔적을 찾고에 의해 정맥에 있는지 확인합니다.
- 1 분에 걸쳐 색소 모든 주사. 용액을 정맥에가는 경우 압력이 주사기에인가 될 때의 저항이 최소화되어야한다. 마우스의 꼬리, 사지, 눈에 즉각적인 색상 변화로 EB를 성공적으로 전신 정맥 투여를 확인합니다.
- 꼬리에서 바늘을 제거하고 가볍게 출혈을 멈추게하기 위해 깨끗한 거즈를 사용하여 압력을 적용합니다.
- 마우스의 피부가 파란색으로 변합니다 때 타이밍을 시작합니다. 2 시간이 약화 BBB를 통과하는 EB 순환시키고 있습니다.
4. 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색
- 분말이 완전히 용해되면, 즉시 4 ℃에서 병, 커버 호일, 그리고 상점에 전송할 수 있습니다. TTC 및 TTC 염색 조직은 민감한 빛입니다.
- 27 게이지 날개 주입 바늘에 감기 0.01 M PBS로 채워진 얼음과 연결된 60 공통 주사기 5 ㎖ / 분의 유속으로 관류 펌프를 시작한다. 약 0.5 cm 심장의 좌심실에 바늘의 끝 부분을 놓고 우심방를 잘라. 정맥 피가 무색 나타날 때까지 점진적으로 희석하여 정맥 혈액 관류시 아트리움의 유출한다. 로 transcardially 마음을 통해 30 mL의 0.01 M 인산 완충 식염수 (PBS)를 관류.
- 행렬의 입쪽 측으로부터 제 2 슬롯으로 스테인리스 0.21 mm 두께의 블레이드를 삽입함으로써 후각 전구를 제거한다.
- 행렬의 꼬리 쪽부터 네번째 슬롯에 블레이드를 삽입하여 소뇌를 제거한다.
- 매트릭스의 나머지 슬롯의 중간 슬롯에 블레이드를 삽입합니다. 균등하게 자르는 동안 조직의 가장 고른 분포를 보장하기 위해 남아있는 조직을 양분, 나머지 블레이드를 삽입합니다.
- 모든 블레이드가 삽입되고 나면, 그것을 습하게하는 뇌의 PBS 1 ~ 2 방울을 추가합니다.
- 블레이드를 분리합니다주동이의 영역으로 시작하는 매트릭스에서 한 번에의 하나. 결과 tMCAO 후 TTC 분석을위한 최초의 7 조각을 유지합니다. 조심스럽게 TTC 채워진 유리 병에 블레이드에서 슬라이스를 전송하는 작은 주걱을 사용합니다.
- 섹션은 슬라이드 상에 배치되는 경우, 표준 스캐너를 이용하여 슬라이드를 검색. 이미지 분석을위한 600 dpi의 최소 해상도를 설정합니다. 동물의 이름과 스캔 한 이미지에 메트릭 통치자를 포함해야합니다.
- 슬라이드를 통해 플립및 수집 된 모든 데이터를 보장하기 위해 뒷면을 스캔.
5. 경색 볼륨 정량화
- 표준 이미지 분석 소프트웨어 (예 ImageJ에)를 사용하여 경색 량 정량화.
- 적절한 분석을 위해 고해상도 (예를 들어, 600 dpi)로에서 스캔 이미지. 이미지 자르기. 스캔 한 이미지에 포함 된 메트릭 통치자를 사용하여 모든 이미지의 크기를 표준화.
- 다음 식을 사용하여 반대쪽 반구의 전체 부피를 계산. 동측 반구의 총 부피를 계산하기 위해이 공식을 반복합니다.
각 슬라이스 X 슬라이스 두께의 총 반대측 반구의 합 - 간접 경색 볼륨을 계산합니다. . 대조군으로 건강한, 반대측 반구를 사용하여 스트로크에서 동측 부종에 대한 제어 (27)는 간접 경색 볼륨을 계산하려면 다음 수식을 사용하십시오
반대쪽 반구의 총 부피 -
(총 있습니다 volum경색의 3 측정 동측 반구의 전자 - 평균 볼륨)
6. 혈액 - 뇌 장벽 (BBB) 무결성 정량화
- , EB 정량을 준비 최초의 2.5 인치 보트의 무게를 계량합니다. 무게를 기록하고 각 동물에 대한 두 개의 무게 보트 레이블 : 동측 반구 다른 하나는 반대쪽 반구에 대한 하나.
- TTC 염색 부분을 스캔 한 후, 동측 및 반대측 반구에 일회용 면도날 각 섹션을 이등분. 무게 보트에서 7 절에서 동측 반구를 놓고 무게를 기록한다. 반대쪽 반구에 대해 반복합니다.
- 즉시 48 시간 동안 56 ° C에 대한 오븐 세트에 무게 보트를 전송합니다.
- 건조 된 부분의 무게를. 별도의 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 두 반구를 전송합니다.
- 각 반구에 필요한 양의 포름 아미드 (건조 티슈 8 ㎖ / g)을 계산하고, 각각의 추가 microcentrifug전자 튜브. 포름 아미드는 빛에 민감하고 이후이 시점에서 박의 모든 포름 아미드 처리 된 샘플을 커버한다.
- 또 다른 48 시간 동안 56 ° C로 설정 인큐베이터의 microcentrifuge 튜브를 전송합니다.
- 48 시간 후, 라벨의 microcentrifuge 튜브의 또 다른 세트로 푸른 상층 액을 피펫. 추출 된 상등액의 체적을 최대화하기 위해 관의 하단에 조직을 밀어. 상층 액의 튜브를 유지하고 모든 조직을 폐기하십시오.
- 표준 곡선에 대한 포름 아미드에 EB의 지수 연속 희석을 준비합니다. 포름 아미드의 EB 64 UG / ㎖를 통해 0.125에서 1 빈 (포름 아미드 전용) 다음 10 지수 솔루션 UG / ㎖를 포함합니다.
- 96 웰 플레이트에 대한 표준 곡선을 만들어 희석액 300 ㎕를 피펫. 해당 우물에 상층 액 300 μl를 피펫.
- 620 nm에서 분광 광도계의 흡광도를 측정한다.
- 흡광도 오와 EB 희석의 표준 곡선을 비교상층 액 샘플 F. 광학 밀도는 BBB의 무결성에 정비례한다.
- 배경으로 반대쪽 반구의 광학 밀도를 가정하고 배의 변화를 확인하기 위해 식 (동측-반대측) / 반대측을 사용합니다. 통계 분석에 대한 자세한 내용은 마틴 등의 알을 참조하십시오. 2010 년 18
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Representative Results
이 연구는 연령 10 주 우완으로 무작위 배정의 시작에 있었다 (N = 10) (25) 남성 스위스 웹스터 마우스 또는 21 % O 2 (N = 15) 그룹을 포함. 2 주 최종 우완 노출 후, 수술은 눈을 멀게 그룹으로 수행하고 일 사이에 카운터. 결과 tMCAO 다음, 1 마우스는 수술 후 회복 중 사망하고 재관류 CBF 기준을 충족하지 않았기 때문에 1 마우스는 연구에서 제외되었다. 모두 제외 마우스는 21 % O 2 군에서 있었다. 에 따라 지침 도착, 28 표 2는 수술 매개 변수를 보여줍니다. 간접 경색 볼륨, 반구 부종 (즉, 부종), 그리고 에반스 블루 (EB) extravasations는 모든 데이터가 짝 T-테스트 (평균, 표준 편차가 표시)로 분석 하였다. 그림 2에 표시되며, 아웃 라이어는 거짓 검색 속도 검출 4 이상 값을 제거 1 % (을 Graphpad 프리즘), 이하 (2 21 %, RHP 2)에서 EB 데이터 세트.
2 처리 된 마우스 (62.6 ± 42.6 mm 3)에 비해 거의 절반 (33.9 ± 23.0 mm 3)에 의해 경색 볼륨을 감소하지만,이 차이는 비 유의 하였다 = 0.10). 그러나, 선험적 전력 분석은 아웃 라이어가 제거 된 후 우리는 우완 처리 된 마우스와 달성하지 않았다 필요 N = 10 당 그룹을 예측했다. 이것은 미래의 사용을 RHP 실험 설계에서 고려되어야한다. 반구 부종에 RHP의 효과가 없었다, 부종. 6 우완 처리 된 마우스와 동일시 될 수있는 TTC 볼륨 분석에서 파생 메트릭을 정규화 허혈성 반구 내에서 BBB 중단의 감소 추세 (P = 0.05) 전시 반대측 반구. 그림 2D는 모두 치료 그룹에 대한 EB 누출에 대한 값의 범위를 보여줍니다.
그림 1 :. 맞춤 설계 우완 챔버 상단 패널에는 최대 4 개의 챔버 공기 흐름의 개별 모니터링을위한 맞춤형 유량계를 나타낸다. 공기 차단 성 튜브 유량계를 떠나고 하부 패널 (15)에 L 유도 챔버의 입구 포트에 연결되어 도시된다. RHP는 공기 순환을 허용하는 동안 출구 포트는 열려 있습니다.
그림 2.. RHP가 경색 볼륨 및 BBB 중단 RHP (A)는 대조군 마우스와 비교하여 46 % 경색 부피 감소를 줄일 수 있지만 TTC 데이터로부터 유도 반구 부종에 미치는 영향 (B)가 (C)와 동일한 동물에서, RHP는 BBB 중단을 감소 (p = 0.05) 반대쪽 반구 정규화 누출. (D) 주제 TTC 얼룩을 모두 RHP 처리 및 21 % O 2에서 에반스 블루에 의해 정의 된 바와 같은
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Discussion
전신 저산소증 마우스 (즉, 2 시간 11 % O 2)에 하나의 노출은 "일시적으로"짧은 지속되는 저산소 전처리 도전에 후생 유전 학적 반응을 의미하는 결과 tMCAO, 29 일부터 뇌를 보호하고, 기준 표현형 내에서 복원 일. 저산소 전처리 자극의 반복 프리젠 테이션은 크게 신경 표현형의 기간을 연장. 6 많은 연구는 반복적 인 자극 열차의 빈도, 규모 및 기간이 응답의 중요한 결정 요인이라는 것을 보여 주었다. 예를 들어, 단순히 동일한 강도 및 저산소증의 지속 시간 (2 시간 11 % 산소) 주당 3 회 (MWF)이 2 이상의 결과 tMCAO 6에서 신경 혈관 보호를위한 치료 창을 확장하지 않은 주 그러나이 장기 유도하기에 충분 하였다 반복 망막 용어 허혈성 허용. (30) 흥미롭게도, 비록 전신 저산소증 (5 노출 5 시간 8 % O 2 </ 서브>) 5 저산소 노출를 3 일 간격 배치 된 경우 신경이 끊어졌습니다 6 일 간격 삼일 마지막 저산소 노출 후 유도 된 결과 tMCAO 보호 간격. (31)이 차이에 대한 이유는 불분명하지만,로 인해되었을 수도 있습니다 이 프로토콜 및 / 또는 중증도의 저산소 도전 간의 불충분 한 복구 시간에 심한 저산소증의 상대 지속 기간.
부상을 유발하지 않으면 서 주파수, 크기 및 기간의 도메인에서 반복적 저산소 도전의 부족, 적정에서, 관용의 개발에 중요한 것, 조직 특이 아마도 종 특이 효과를 언급 할 필요가 없을 것입니다. 8 %의 6 시간은 O (2)는 해마 신경 세포 사멸을 유도하지만, 예를 들어, RHP 노광들의 3/9은 4 시간 동안 8 % O 2에 노출을 포함한다. (32) 따라서, 관련하여 RHP 프로토콜에 대한 엄격한 준수가 있어야 기간과 내생을 유도하는 저산소 노출의 정도보호. 전처리에 의한 보호에 일주기 리듬의 잠재적 인 효과가 더 탐사를 필요로하지만, 특정 집단에 대한 하루 중 같은 시간에 33 수행 우완 노출은 잠재적 교란 효과의 위험을 줄일 수 있습니다. 용량 - 반응 및 유효성의 측면에서, 초점 선 중 가장 강력한 RHP 매개 보호 건강한 쥐 면역 표현형을 나타낼 RHP가 처리 될 때 결과 tMCAO은을 (한번에 최종 저산소 노출 3 다음의 이주를 유도했을 때 발생한 허혈 손상의 유무). (7)이 2 주 시점이 최대 다른 급성 중추 신경계 손상에 대한 보호, 또는 다른 기관 시스템에서의 기간과 일치하지 않을 수 있습니다. 모두 우완 프로토콜 및 후생 유전 학적 반응의 시간적 특징은, 의심 할 여지없이 각각의 새로운 번역 사용하기에 최적화가 필요합니다.
결과 tMCAO 절차의 큰 한계 중 하나는 경색 VO의 불균일 분포lumes이 대표 데이터 세트에 의해 도시 된 바와 같이. 윌리스, leptomeningeal 문합,과 등의 담보 접합의 원에 의해 제공되는 측부 순환이 일관 경색 볼륨으로 이어질 수 있습니다. (34) 변화를 쥐의 다른 균주에 윌리스의 원뿐만 아니라 후방 통신 동맥의 존재 및 개통, 25 사이 35은 상기 그룹 내 경색 볼륨의 일관성을 감소시킬 수있다. 견고한 샘플 크기 및 복제는 종종 결정적 결과를 생성하는 데 필요한 전력을 공급하고 이에 따라 이후의 실험 디자인에 포함되어야한다. 뇌졸중 유도하는 다른 방법은, 예컨대 버 횡 두개골에 구멍 또는 MCA의 원위 지점 photothrombosis 통해 주 MCA 분기 폐색로서 특히 원위 국소 허혈성 방법들은 종종 행정 용적 변화가 적은 생산. 그들은 동시 세포 외 및 세포 내 부종을 생산으로 Photothrombotic 스트로크는, 그러나, 제한적 phenomenoN 사람에서 허혈성 뇌졸중에 보이지 않는. 36 반대로, tMCAos 인해 중간 대뇌 동맥의 폐색으로 발생하는 인간의 모든 스트로크의 60 % 이상으로 임상에 더 직접적으로 적용 할 수있다. (37) 마지막으로, 결과 tMCAO 동안 사용 된 마취, 이소 플루 란 , 이소 플루 란 레벨 사이 수술 및 치료 및 치료 실험군 간의 일치해야이 신경을 고려하는 것이 가능하게 될 수있다. 신경을 유도하는 38에 도시 한 잠재 신경 보호 효과를 줄이기 위해 <3 %로 유지되었다. 39
시간은 또한 TTC 염색 공정에서 중요하다. 4 시간 내지 7 일마다 변동 TTC 염색 허혈 후에 수행 될 수있는 시간에 대한 스트로크 문헌에서 큰 변동이있을지라도 졸중은 18,40 TTC 염색 대부분 뇌졸중 후 24 ~ 48 시간에 발생해야 일관되고 명확하게 묘사 경색 볼륨. TTC의 경색 볼륨은 꿀벌이N 뇌졸중 후 24 시간을 안정하지만 48 시간 후, 허혈성 뇌에 대 식세포의 유입이, TTC와 뇌 조직의 염색이 바로 희생을 따라야 또한 경색 볼륨 어렵다. 14,40을 정의합니다 발견. 염색을 지연 이유로 인해 동물의 죽음이 아닌 뇌경색으로 인한 증가 된 미토콘드리아 죽음의 얼룩의 품질을 감소합니다. 뇌 블레이드 삽입 중에 습하게 유지되지 않는 경우 사망 미토콘드리아에서 유사한 증가가 발생한다. 이 프로토콜은 명확 TTC 염색법으로 경색 분석의 장점을 도시 한 반면, 다른 면역 조직 얼룩은 다음 결과 tMCAO 경색 용적을 정량하기 위해 사용될 수있다. 크레 실 바이올렛 또는 플루오로 옥 염색이 희생 후 얼룩 덜 엄격한 시간 요구 사항을 가지고 있지만,이 고전 얼룩 저온 유지 장치 또는 마이크로톰에 의해 얻어진 매우 얇은 부분을 필요로하며, 따라서 통합 요약 및 분석을위한 더 많은 시간을 필요로한다. (14) 또한, 세인트주어진 뇌 경색 량 및 BBB 무결성 간의 직접 비교의 가능성을 제거한다 (15) 등이 개발로 AINS는 BBB 중단의 EB 정량과 함께 사용될 수 없다. 그것은 순수한 흰색 볼륨 반대로 통상적 핑크색을 나타내 동물 RHP 처리 주목해야한다. 6 RHP - 처리 된 마우스에서 경색의 유실을 방지하기 위해, 우리는 반대로 더 핑크 건강한 조직 초래 TTC 대한 짧은 염색 기간을 사용 어두운 빨강. 에반스 블루 처리는 또한 순수한 흰색 경색이 프로토콜에 제시된 이중 정량 염색 어렵다 경색 영역을 어둡게 할 수 있습니다.
내 및 그룹 사이 EB 정량과 비교하기 위해서, 모든 동물은 EB 상당 순환 시간을 거쳐야. 기타 EB 바로 다음 재관류를 주입 EB 최대 72 시간, 41 또는 4 시간 후 결과 tMCAO가 alternativ로, 4 시간 동안 (15)를 순환하는 순환 할 수있다전자의 방법. 파쇄 BBB 교차 및 뇌 조직에 진입 EB의 양은 주입 시간에서 희생 시간 알부민 - 결합 된 염료의 적분 누적을 나타낸다. 따라서, 본 문서에 기재된 방법은 22 및 24 시간의 재관류 간의 정확한 시간에 BBB의 상태를 알 수 및 이전 또는 이후 개구 또는 배리어의 폐쇄를 놓칠 수있다. 반대로, 왕 동부 등에 의해 이용 방법. 72 시간 그 삼일 후 스트로크 시간 동안 BBB 상태의 모든 변경 사항을 포함, 뇌졸중을 다음과 같은 사항에 대해 BBB의 상태를 보여 (42) 어느 프로토콜이 좋든 나쁘입니다.; 짧은 순환 시간을 사용하여 BBB의 일시적 개방을 "실종"의 위험이 남아 있지만, 그것은 연구자가 BBB의 병태 생리의 특정 시간 기능을 확인하고 다음과 같이, 다른 방법으로 페어링 할 수 있습니다. 기타 intracardially 1 분 transcardial 관류 후 EB 주입함으로써 TTC 및 EB를 결합했다. (18) 그러나,이 충족HOD 일관성 결과를 생성하고 상기 프로토콜보다 훨씬 더 복잡한 과정이다.
우완의 가장 유망한 미래 방향 중 하나는 다른 질병 상태에이 전처리 프로토콜의 번역 응용 프로그램입니다. 간헐적 노출 저산소 허혈 이외 염증성 CNS 조건에서 보호 것으로 밝혀졌다. 알츠하이머 병의 쥐 모델에서, 기압 성 저산소증에 4 시간 매일 노출 2 주 메모리 유지 및 베타 - 아밀로이드의 뇌내 주사 후 대뇌 피질의 신경 세포의 손실의 손상을 감소시켰다. 43 간헐적 저산소증 (기압 성 저산소증에 15 시간 매일 노출 2 주 )도 L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) 주입, 선조체 도파민 전송을 손상 파킨슨의 모델 다음 쥐의 보호 것으로 밝혀졌다. (44) 그러나, 알츠하이머와 파킨슨의이 모델은 조사 단기 효과우완에 의해 유도 된 장기 신경을 조사 저산소 전처리. 43, 44은 연구를위한 유익한 향후 방향 일 수있다. 또한, RHP에 의해 유도 된 신경은 EB 분석 할 수있는 알츠하이머 병의 마우스 모델에서 개선 BBB 무결성을 연장 할 수있다. (45) 듀얼 (TTC) 및 EB 분석이 더 유용 파킨슨 모델이 될 것이다는 선조체 병변 (46)과 BBB를 유도로 각각 TTC 48, EB, 49 정량화 될 수 붕괴, 47. 전반적 RHP는 고유 장기 소염 및 신경 보호 효과를 유도로 큰 병진 전위 전처리의 간단 강력한 형태이다. TTC 및 EB의 이중 정량화 쉽게 미토콘드리아 장애, 세포 사멸 및 BBB 누설 관련된 다른 질환 상태에 적용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
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