Abstract
Inme deneysel hayvan modelleri inme patoloji anlamak ve daha etkin tedavi stratejileri geliştirmek için paha biçilmez araçlardır. Tekrarlayan hipoksik önkoşullama (TÜSP) A 2 hafta protokol fokal iskemik inme bir fare modelinde merkezi sinir sistemi (MSS) yaralanmalara karşı uzun süreli koruma uyarır. ÜSP hem süresi (2 ya da 4 saat) ve yoğunluğu (% 8 ve% 11 O2) değişir hipoksiye 9 stokastik maruz oluşur. ÜSP endojen bir merkezi sinir sistemi koruyucu fenotipin uzun süreli indükleme gösteren, infarkt hacmi, kan-beyin bariyeri (BBB) kesintileri ve hipoksi son maruz kaldıktan sonra hafta inme sonrası inflamatuar yanıtı azalır. infarkt hacmi BBB bozulması çift ölçümü için yöntem ÜSP ya da diğer olası nöro-koruyucu olan farelerde nörovasküler koruma değerlendirilmesinde etkindir. Yetişkin erkek Swiss Webster fareleri% 21 O kadar ÜSP veya süresi eşdeğer maruz kalma tarafından öngörülmekte edildi
Introduction
Yetişkin sakatlık ve ölüm dördüncü önde gelen nedeni önde gelen nedeni olarak, inme ABD yetişkin nüfusun karşı karşıya olduğu en zayıflatıcı hastalık devletlerinden biridir. Inme 1 hayvan modelleri iskemik yaralanma azaltarak yeni yöntemler ve deneysel araştırma için izin İnme sonrası kurtarma iyileştirilmesi. Böyle translasyonel araştırma için bir yeni cadde ön hazırlık olduğunu. Önkoşullanma takip eden ve daha ciddi yaralanma zararı azaltmak için olmayan bir zarar uyaran kasıtlı kullanımıdır. 2 Hipoksik önkoşullanma in vivo ve in vitro çalışmalar, hem de vuruş karşı koruma sağlayan beyinde pleiotropik değişikliklere gösterilmiştir . 3 Bununla birlikte, hipoksi bir tek maruziyet sadece erişkin farelerde iskemiye karşı toleransı az 72 saat uyaran, kısa vadeli nöro sunmaktadır. Lin ve ark hipobarik hipoksi 14 saat, günlük risklerin 4 Hatta dört hafta sonra. found o nöro sadece bir hafta. 5 Tekrarlanan hipoksik önkoşullama (TÜSP) için devam etti sıklığı, süresi ve hipoksik risklerin yoğunluk stokastik varyasyonlar ile karakterizedir. Tek bir önkoşullanma meydan aksine, TÜSP farelerde sekiz hafta kadar süren bir serebroprotektiftir fenotip oluşturmakta. 6 RHP son hipoksi maruz kaldıktan sonra hafta boyunca enfarktüs hacimleri, kan-beyin bariyeri (KBB) bozulması, damar iltihabı ve lökosit ROS azaltılmış . ÜSP özellikle işemik hemisferde B hücresi popülasyonlarının korurken, T hücresi, monosit ve makrofaj popülasyonlarının düşürülmesinde iskemik beyin iltihabı, indirgenmiş. 7 Aslında, ÜSP felç dahil olmak üzere, herhangi bir merkezi sinir sistemi hasarı önce farelerde bir bağışıklık bastırıcı fenotipi neden olmuştur. ÜSP ile tedavi edilen sağlıklı farelerden izole ÜSP ile muamele edilmiş B hücreleri, antijen sunumu ve antikor üretimi hem de bir baskılanması ile, özel bir anti-inflamatuar bir fenotip sergilemiştir.pro-enflamatuar adaptif immün mekanizmaları genel azalma sadece merkezi sinir sistemi özgü enflamatuar hastalıklar için endojen bağışıklık indükleme ÜSP mükemmel bir yöntem sağlar, aynı zamanda, bir ön-iltihabik nedenleri mevcuttur sistemik yaralanma ya da hastalık modelleri.
TÜSP geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAo) Aşağıdaki infarkt hacmi ve BBB bozulma azaltır. Gibi yaygın olarak kullanılan tMCAo inme hayvan modelleri, çarpıcı bir şekilde inme olduğunun anlaşılması, yanı sıra, daha etkili nöroterapötik tasarımını geliştirmek. İlk Koizumi ve arkadaşları tarafından geliştirilen. 1986 yılında, 8 tMCAo prosedürü kemirgenlerde inme ve reperfüzyon aşağıdaki inflamasyon araştırmak için tercih edilen yöntemlerden birini uyaran bir yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. TMCAo yöntemleri geliştikçe, silikon kaplı filamentlerin daha yakın zamanda kullanım daha başka modeller 9,10 <kıyasla subaraknoid kanama riskini azaltmak/ Sup> maalesef tMCAo sık sık enfarktüs hacimleri geniş bir varyasyon üreten olsa ve güvenilirliğini artırmak. 11-13 Bu çalışmaların çoğu 2,3,5 trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyanarak koronal beyin kesitlerinde enfarktüsü bölgeleri belirginleştiren, kabul edilen bir enfarktüs ölçümü için altın standart o canlı, yinelenebilir sonuçlar üretmek için basit ve ucuz bir yoldur çünkü. TTC mitokondri içinde mevcut dehidrojenazın bir alt-tabaka olarak hizmet eder. Beyin dilimleri TTC çözeltisi maruz kaldıklarında formazan non çözünür indirgeme ürünü, uygun bir mitokondrilerinde koyu kırmızı bir renk çöktürülmesi burada TTC seçici canlı hücre alınır. Çünkü iskemik dokuda mitokondriyal disfonksiyon, bu doku hasarlı ve sağlıklı doku farklılaşması için izin beyaz kalır. 14
TÜSP ayrıca iskemik yarımkürede BBB bozulması azaltır. 6. Bu nedenle, BBB bütünlüğünün ikili miktarının aynı b içindeTTC-tabanlı infarkt hacmi olarak yağmurlar endojen koruma dolu etkinlik ile ilgili faydalı bilgiler ve tedavi edilmemiş ve tedavi edilen hayvanlarda BBB bozulması ve enfarktüs arasındaki potansiyel nedensel ilişkileri sağlayacak 15 tespitler. inme ikincil bir kesintiye BBB, aracılığıyla periferik kandan akını sonuçta iskemik inmeli hastalarda enfeksiyon ve ölüm oranlarının artırılması, iskemik yarımkürede lökosit popülasyonları, pro-inflamatuar sitokinler, oksidatif stres, vazojenik ödem ve hemorajik dönüşümünü artırır . 16,17 hayvan modellerinde BBB bozulması ölçülmesi için yaygın bir yöntem, beyin içine Evans mavisi (EB) boya sızıntı niceliğinin belirlenmesine dayandığı. 15,18-21 EB seçici albümin, bir küresel serum proteinine bağlanan (MW = 65 kDa) Bu yaralanmamış hayvanlarda BBB aşmaz. 22 iskemik inme sonrasında, EB beyin infiltratlar ve optik yoğunluk withi ölçümü için izin 620 nm'de fluorescesn perfüze yaralı parankim. 22 optik yoğunluk EB transkardiyak perfüzyon ile otopsi kortikal damar yıkanıp olmuştur BBB geçirgenliği ile doğru orantılıdır. EB tatbikat hayvanlarda TTC-lekeli beyinleri hemen işleme ile, enfarktüs hacmi BBB bozulması hem etkin bir şekilde belirlenebilir. Bu nöronal yaralanma BBB bozulması inme sonrası beyinde eşlik işlemleri değildir Bununla birlikte, dikkat edilmesi gereken, 23,24 şekilde kurban süre seçimi, önemli bir husustur.
Aşağıdaki protokol RHP yöntemi, geçici bir arter tıkanıklık uyarılması için tMCAo yöntemini detayları bu modellerin insan hastalarda orta serebral arter tıkanıklıkları ve nöral ve vasküler inme yaralanma bitiş noktaları belirlemek için ikili histolojik yöntemler. TTC genel bir enfarktüs hacim ölçümü sağlayan, hücre ölümü ve toplu doku hasarı büyüklüğüneume, EB BBB hasar hemisferik ölçümü için sağlarken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol deneysel hayvan kullanımı için Sağlık (NIH) politikası için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından riayet UT Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Tekrarlayan Hipoksik Önkoşullanma
- Özel tasarım dört gaz regülatörleri ile ilgili debimetreler ve (O 2) tankları bir giriş portu aracılığıyla odalarına akmasına oksijenden sıkıştırılmış gazın izin PVC borular standart 15 L indüksiyon odalarına ekleyin. Özel tasarım hakkında daha fazla bilgi için donatım ve Malzemeleri bakın.
- 8 ve% 11,% O 2 poz almak Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma (TÜSP) Grubu ve Kontrol Grubu, aynı zamanda% 21 O 2 (oda havası) için pozlama alırsınız: 2 gruba fareler bölün. Frekans varyasyonlarının Tablo 1'e bakınız, yoğunluk (8 ve% 11 O2 ve% 21 O 2) ve ÜSP maruz kalma süresi (2 ya da 4 saat). </ Li>
- Kendi O 2 tanklarına bağlı olan odalar, sağlam yiyecek ve su şişeleri ile her kafesin üst filtre kapağını çıkarın ve kafes yerleştirin. Kapatın ve bölmenin kapağını sabitleyin.
- Tanklar için ana gaz vanasını açın ve pozlama ilk 5 dakika dakika (LPM) başına 2 L her indüksiyon odası için başlangıç akış ayarlayın. Maruz kalanı için 1 LPM akış hızını azaltın.
- Maruziyet sonunda, 0 LPM akışını azaltmak ve tankların gaz vanasını kapatın.
- Kamara kapaklarını açın ve her kafeste filtre üst kapağını değiştirin. Bir sonraki hipoksi maruziyetinde kadar standart konut kafesleri yerleştirin.
- NPD (Steris) ya da her kullanımdan sonra eşdeğer bir dezenfektan / deodorant her indüksiyon odasını aşağı püskürtün.
- Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, iki hafta boyunca her gün aynı zamanda 21 ve% ÜSP fareler hem Açığa.
2. GeçiciOrta Serebral Arter Tıkanıklığı (tMCAo)
- Nihai RHP maruz kaldıktan sonra inme zamanlaması hakkında daha fazla bilgi için tartışma bakın.
- Aseptik cerrahi işyeri hazırlayın. % 70 Etanol veya eşdeğer dezenfektan ve tüm cerrahi aletler otoklav ile temizleyin çevredeki işyeri.
- Serebral kan akımı (CBF) göreceli değişiklikleri ölçmek için Laser Doppler Flowmetri (LDF) aleti ayarlayın. 37 ° C'ye kadar ısıtma pedi açın. 34 ° C inkübatör açın.
- Küçük bir indüksiyon odasında% 4 izofluran /% 70 NO 30/2% O 2 karışımı kısa bir pozlama ile fareler anestezi. Hafifçe pençe kısma doğru anestezi onaylayın. Fare pençesini çekilirse, indüksiyon odasına fare dönmek ve izofluran pozlama devam edin.
- Anestezi indüksiyon odasından fareler çıkarın ve hızlı bir şekilde burun konisi farenin burnunu yerleştirin. Anes akışını kapatarak, burun konisi gaz akışını açınhipestezi indüksiyon odası.
- % 70 No 2 /% 30 O 2 gaz karışımı değiştirmeden, prosedürün geri kalanı için idame dozu olarak% 1.8 izofluran sabitleyin. Nefes yavaş ve prosedür boyunca düzenli kalır ama nefes hızlı ve sığ olursa, izofluran dozu artırmak gerekir. Bakım dozlu bir deneyde kullanılan ekipman üretiminde ve hayvan arasında değişebilir.
- Bir microshaver kullanarak, göz ucuyla ve kulak yanı sıra boyun ventral orta hat arasındaki temporal bölgede saç tıraş. Fazla kürk çıkarın ve işlem sırasında kurumasını kornealar korumak için steril bir pamuklu çubukla göz kayganlaştırıcı uygulayın. Aseptik koşullarda sürdürmek için steril bir pamuklu çubukla alkol pedleri ve çubukla providon-iyot ile kesi bölgeyi silin.
- Kemirgen cerrahi kurallarına göre analjezikler uygulayın.
- Göz ve kulak arasındaki zamansal deri yoluyla bir kesi yapmak.Temporal kas Açığa. Cerrahi mikro makas kullanarak, beyaz kas çizgili alanı içinde zamansal sırtı zamansal kas ligament kesti.
- Yavaşça kafatası yoluyla orta serebral arter (MCA) görselleştirmek için forseps ile yanal kas toplu itin. Temporal kasın kesildikten sonra, bölge kan ile dolabilir. Yavaşça herhangi bir potansiyel kanama sadık bir pamuklu bir bez kullanın.
- MCA alanına LDF prob ucunu hedefleyin. Bu alanda fareler arasında değişmektedir olarak seçilen gemi kaydedin.
- Istikrarlı bir kırmızı kan hücresi akı okunana kadar kafatası ile yerde ve aynı hizada yer LDF tutun ve bazal CBF olarak bu değeri kaydediniz. Lazer Doppler flowmetri Ideal temel CBF> 600 akı, ama bu üreticiye değişir. Bazal CBF ise <400 akı, akım kayıt yakındaki bir ven veya hedef damarın üzerine sonda tamamlanmamış bir yerleştirme muhtemeldir.
- Taban CBF kurulduktan sonra repositiFare üzerinde böylece boyun maruz kalmaktadır. Başını Destek ve roket ucu konisi gelen sürekli anestezi altında fare tutmak.
- Sadece klavikulaya mandibulanın altından ventral orta hat kesi olun.
- Forseps kullanarak, sol karotis arter (CCA) açığa çıkarmak için tüm yüzeysel fasya teşrih künt. Bağ dokusu ve vagus sinirinden CCA ayırın.
- Kalıcı bir 6.0 ipek sütür ile CCA Arter. Filament yerleşim kapatılmasıy için yeterli oda izin mümkün olduğunca proksimaline kadar bağlanması dikiş yerleştirin.
- Döngü ve gevşek massedici dikişine CCA distalinde etrafında ikinci bir ipek kravat 6.0 sütür. Massedici Filament sonradan karotis yoluyla dişli olacak gibi arteri tıkamak için dikkatli olun.
- Gevşek bağlı ipek sütür ile CCA distal kelepçe 8 x 2 mm hafif mikro serrafine areterial kelepçe kullanın. Yavaşça forseps ile CCA kaldırın ve lige sütür olarak proksimal olarak, küçük bir boylamasına bir kesi yapmak3 mm Vannas mümkündür.
- Arter lümen girmek için kesiden bir 12 mm silikon kaplı 6.0 gauge naylon massedici filament geçirin ve sonra bir kaç mm ilerlemek. Gevşek CCA dışına itmek filaman ve arteriyel kelepçesini kaldırmaz kan akışını sağlamak için kapatıcı filamanın ucu etrafında ikinci gevşek ipek sütür sıkın.
- Internal karotis arter içine CCA (ICA) ve dış karotid arter (ECA) ilk ayrımında, 9 10.5 mm geçmiş için ICA.Advance massedici filamanın girmek için ilk çatallanma sağ dalı haline massedici filaman iplik Sol internal karotis arter (ICA) içine ikinci ipek sütür.
- Kısa bir süre ICA girdikten sonra, ICA ve pterogopalantine arter (KİK) arasında ikinci çatallanma sol dal içine tıkayıcı filament ilerlemek. PPA Görselleştirme size massedici filamanın tam yerleştirme ile hafif bir direnç hissedene kadar yani devam olası değildir.Forseps ile ICA Kaldırma Filament ikinci birfurcation sol dalı haline daha kolay iplik yardımcı olabilir. İkinci ipek sütür sıkın.
- MCA üzerinde kesi görünür böylece fareyi çevirin. LDF donanımları ile, CBF LDF okumaları aracılığıyla engellenmiş olduğunu onaylayın. Başarılı bir tıkanma temel CBF bir>% 80 azalma olduğunu.
- Doğru pozisyon elde edildiğinde tamamen çift düğüm fırsat massedici filamanın çevresine ikinci ipek sütür sıkın ve. Gerekirse, hafifçe itmek veya başarılı bir tıkanıklığı (bazal CBF örn>% 80 azalma) için CBF kriterlerini ulaşmak için massedici filament çekin.
- 6.0 naylon sütür ile boyun ve baş ağzını kapatınız.
- Tıkanma süresi için 34 ° C kuluçka makinesi içinde yer fareler. Oklüzyon Önerilen uzunluğu 60 dk, ancak bu yaş, gerilme bağımlı serebrovasküler anatomi, 25 farklılıklardan ve olduğa ölçüde için değişiry (hafif, orta, şiddetli) istenen. Hayvanlar anestezi kapalı geliyor dakika içinde bilincini yeniden emin olun.
- Adım 2.3 açıklandığı gibi, izofluran ile hayvan yeniden uyutmak, 5 dk önceden tanımlanmış kapama süresinin bitiminden önce, kafa derisi kesi açıp MCA perfüzyon hala transkranial LDF okumaları kullanılarak azaltılır onaylayın. CBF yeterince (örneğin <% 20 bazal BKA) azalır değilse, MCA oklüzyonu sırasında bir noktada reperfüzyon ve fare daha deney dışında tutulmalıdır.
- Orta hat boyun kesi açın ve gevşek CCA çevresinde üçüncü bir ipek sütür kravat, CCA çatallanma ikinci ipek sütür ama proksimal distal filaman çıkarıldıktan sonra dış karotid arter (ECA) canlı kalmasını sağlamak için.
- Kes veya tıkayıcı iplik (yani ikinci ipek sütür) tutan düğümü çöz ve yavaş yavaş massedici filament çekilme. Çıkarıldı sonra, hızlı bir şekilde kapatmakCCA etrafında üçüncü ipek sütür ICA kan akmasını en aza indirmek için. Çift düğüm bu dikiş ve 6.0 naylon sütürler ile kesi kapatın.
- Reperfüzyon 5 dakika sonra CBF seviyesini ölçmek için fare yerleştirin. Başarılı reperfüzyon genellikle tıkanıklığı akışı gibi, araştırmacılar kendi kriter kurabilir, bazal CBF>% 50 BKA olarak tanımlanan, ancak. Hayvanlar taban% 50 altında bir CBF sergilemek ise, MCA 'kalıcı' tıkalı olduğu muhtemeldir ve bu nedenle başka bir çalışma dışlama kriterini temsil eder.
- 6.0 naylon sütür ile her iki kesiler kapatın. Kemirgen kurallarına göre tuz, anestezi (Lidokain) ve antibiyotik sağlayın. Bununla birlikte antibiyotik (minosiklin 3 mg / kg), bazı küçük dozlarda nöroprotektif şu felç olduğu tespit edilmiştir. 26
- Temiz, steril bir kafes içinde ameliyat, yer farelerin aşağıdaki ısıtılmış inkübatör bilinç kazanmak sonra. Nemlendirilmiş foo sağlayınd veya beslenme hidrasyon diyet jel takviyeleri ve hayvanlar gibi su petri inme sonrası hareketlilik sınırlı olacaktır. Aşırı ameliyat sonrası ağrı ve ölüm kurtarma sırasında yakından hayvanları izleyin.
3. Evans Mavi (EB) Enjeksiyon
- Reperfüzyon sonrası EB 22 saat enjekte edilir ve kurban ve TTC boyama öncesinde 2 saat boyunca kan dolaşımında sirküle edilmelidir.
- (Tuzlu su içinde% 2 EB) enjeksiyon için EB çözeltisi yapmak ve yavaşça oda sıcaklığında karıştırın. Filtre filtre kağıdı ile bir çözelti veya oda sıcaklığında, küçük çözünmemiş EB kaldırmak için şırınga ve saklamak için bağlanmış bir 0.2 mikron filtre içinden itmek.
- Enjeksiyon için gerekli EB miktarı (4 ml / kg vücut ağırlığı) 29 ölçü bir iğne ile 0.3 cc insülin şırıngaya boya istenilen miktarda çizmek ve çözelti, oda sıcaklığında olduğundan emin olun hazırlanması
- Düz dipli koruyucularını kullanarak fare kısıtlamaktadır. Yanal damar upp böylece kuyruk tutermost. Yanal damarları kuyruk merkez çizgisinin her iki tarafında yer almaktadır. Enjeksiyon için sabit fare tutmak için kuyruk ucunu tutun.
- Damarın perfore için dikkatli olmak, damar içine yaklaşık 3.5 mm iğne takın. İğne şırınga geri çekme ve kan izleri bakarak ven olduğunu doğrulayın.
- 1 dakikalık bir süre boyunca, boyanın tüm enjekte edilir. Çözelti venine olacak, basınç şırıngaya uygulandığında çok az direnç olmalıdır. Fare kuyruğu, bacaklarda ve gözünde ani renk değişikliği ile EB başarılı sistemik venöz yönetimini onaylayın.
- Kuyruk iğne çıkarın ve yavaşça kanamayı durdurmak amacıyla temiz gazlı bez ile basınç uygulayın.
- Farenin cilt mavi döndüğünde zamanlama başlayın. 2 saat zayıflamış BBB nüfuz için EB dolaşmaya izin verin.
4. 2,3,5 Triphenyltetrazolium Klorür (TTC) Boyama
- Toz tamamen çözündükten sonra, hemen ardından 4 ° C 'de bir şişe kapağı folyo ve deposuna aktarımı. TTC ve TTC ile boyandı doku ışığa duyarlı bulunmaktadır.
- 27 dil bilgisi kanatlı infüzyon iğne soğuk 0.01 M PBS, buz ile doldurulmuş ve birleştirilmiş bir 60 cc şırınga ile 5 ml / dk akış hızında perfüzyon Pompayı çalıştırın. Yaklaşık 0.5 cm kalbin sol ventrikül içine iğne ucu yerleştirin ve sağ atrium kesti. Venöz kan renksiz görünene kadar aşamalı sulandırılmış venöz kan perfüzyon sırasında atrium dışarı akması gerekir. Transkardiyal kalbinden 30 mi, 0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS) serpmek.
- Matrisin rostral tarafında ikinci yuvaya paslanmaz çelik 0.21 mm kalınlığında bıçak sokarak koku ampuller çıkarın.
- Matrisin kaudal tarafında dördüncü yuvaya bir bıçak sokarak beyincik çıkarın.
- Matriste kalan yuvaları orta yuvaya bıçağı yerleştirin. Eşit dilimleme sırasında dokuda en eşit dağılımını sağlamak için kalan doku bisecting kalan bıçakları takın.
- Tüm bıçaklar takıldıktan sonra, onu nemlendirmek için beyne PBS 1 ila 2 damla ekleyin.
- Bıçak kaldırrostral bölge ile başlayan matristen bir defada s biri. TMCAo sonra TTC analizi için ilk 7 dilim tutun. Dikkatle TTC-dolu bir şişeye bıçak dilim aktarmak için küçük bir spatula kullanın.
- Bölümler slaytta düzenlenir zaman standart bir tarayıcı kullanılarak slayt tarayın. Görüntü analizi için 600 dpi en az çözünürlük ayarlayın. Hayvanın adını ve taranan görüntüde bir metrik cetvel dahil ettiğinizden emin olun.
- Slayt ters çevirinve toplanan tüm verileri sağlamak için arka tarafını tarar.
5. Enfarktüs Hacim Ölçümü
- Standart bir görüntü analizi yazılımı (ör ImageJ) kullanarak, enfarktüs hacmini ölçmek.
- Yeterli analizi için yüksek çözünürlüklü (örn 600 dpi) Tarama görüntüler. Bitki görüntüler. Taranan görüntüde yer alan metrik cetvel kullanarak tüm görüntüler için ölçek standart hale.
- Aşağıdaki formül kullanılarak kontralateral yarımkürenin toplam hacmi hesaplayın. Ipsilateral yarımkürenin toplam hacmini hesaplamak için bu formülü tekrarlayın.
Her dilim dilim kalınlığı x toplam kontralateral yarımkürede toplamı - Dolaylı infarkt hacmi hesaplayın. . Bir kontrol olarak sağlıklı, kontralateral yarımkürede kullanarak inme ipsilateral ödem Kontrol 27 dolaylı enfarktüs hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
Kontralateral yarımkürenin Toplam hacim -
(Toplam volumenfarktüs 3 ölçümün ipsilateral hemisfer e -Ortalama hacmi)
6. Kan beyin bariyeri (KBB) Bütünlük Niceleme
- EB ölçümü için hazırlık ilk 2,5 inç tekneler tartmak tartmak. Kilo kaydedin ve her bir hayvan için iki tartmak tekneler etiket: ipsilateral hemisferde diğeri kontralateral yarımkürede için bir.
- TTC-lekeli bölümleri taradıktan sonra, ipsilateral ve kontralateral hemisfer içine atılan jilet ile her bölüm bisect. Bir tartmak teknede 7 kesimlerinden ipsilateral hemisferlerin yerleştirin ve ağırlığı kaydedin. Kontralateral yarımkürede için tekrarlayın.
- Hemen 48 saat boyunca 56 ° C'de bir fırın grubu ağırlıkça tekneler aktarın.
- Kurutuldu bölümleri tartın. Ayrı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine her iki yarımkürede aktarın.
- Her bir yarım küre için gerekli formamid miktarı (kuru doku 8 ml / g) hesaplayın ve bunların ilgili microcentrifug ekleE tüpleri. Formamid ışığa karşı hassastır ve ileriye bu noktadan itibaren folyo tüm formamit tedavi edilen örnekleri kapsamaktadır.
- Başka bir 48 saat daha 56 ° C'de ayarlanmış bir kuluçka mikrosantrifüj tüpleri aktarın.
- 48 saat sonra, etiketli mikrosantrifüj tüpler başka bir dizi içine mavi süpernatant dışarı pipetle. Ayıklanır süpernatant hacmi maksimize etmek tüpün dibine doku itin. Süpernatant tüpleri tutun ve tüm doku atmayın.
- Standart eğri için formamid EB üstel seri dilüsyonları hazırlayın. Formamid EB 64 ug / ml ile 0.125 ila 1 boş (formamid sadece) ve daha sonra 10 üstel çözümler ug / ml ekleyin.
- Bir 96-yuvalı plaka içine, standart eğri için yapılan seyreltileri 300 ul Pipet. İlgili kuyulara süpernatant 300 ul pipetle.
- 620 nm'de bir spektrofotometrede absorbansı ölçülür.
- Absorbans o ile EB dilüsyonlarının standart eğri karşılaştırınSüpernatan örnekleri f. optik yoğunluğu BBB bütünlüğü ile doğru orantılıdır.
- Arka plan olarak kontralateral yarımkürede optik yoğunluğunu varsayalım ve katlık değişime belirlemek için formül (ipsilateral-kontralateral) / kontralateral kullanın. İstatistiksel analiz hakkında daha ayrıntılı bilgi için Martin ve ark bakın. 2010. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, 10 haftalık ÜSP içine rasgele başlangıcında (n = 10), 25 erkek Swiss Webster fareleri veya% 21 O 2 (n = 15) grupları dahildir. İki hafta son RHP maruz kaldıktan sonra, cerrahi işlemler kör gruplarla, yapıldı ve gün arasında denge. TMCAo ardından, 1 fare ameliyat sonrası iyileşme döneminde ölen ve reperfüzyon CBF kriterini karşılamak yoktu çünkü 1 fare çalışma dışı bırakıldı. Her ikisi de dışlanmış fareler% 21 O 2 grup vardı. Uyarınca kurallara GELİYORUM, 28 Tablo 2 cerrahi parametreleri gösterir. Dolaylı enfarktüs hacimleri, hemisferik şişlik (yani, ödem) ve Evans mavisi (EB) ekstravazasyonlar Tüm veriler eşleştirilmemiş t-testi (ortalama, standart sapma gösterilir) ile analiz edilmiştir. Şekil 2'de gösterilmiştir ve aykırı bir yanlış Discovery Oranı ile tespit 4 aykırı kaldırıldı% 1 (Graphpad Prism), daha az (2% 21, RHP den 2) EB veri kümesinden.
2 ile tedavi edilen farelerde (62.6 ± 42.6 mm 3) ile karşılaştırıldığında neredeyse yarısı (33,9 ± 23.0 mm 3) ile enfarktüs hacimleri azalmış, ancak bu farkın önemsiz olduğu = 0.10). Ancak, a priori Güç analizi aykırı çıkarıldı sonra RHP-tedavi edilen farelerde ile elde etmedi gerekli n = 10 başına grup, öngördü. Bu RHP kullanarak gelecek deneyler tasarımında dikkate alınmalıdır. Hemisferik şişmesi üzerinde ÜSP hiçbir etkisi yoktu, ödem. 6 RHP-tedavi edilen farelerde ile eşdeğer olabilir TTC hacim analizinden elde edilen bir metrik normalize iskemik yarımkürede içinde BBB bozulması azalma eğilimi (p = 0.05) sergiledi kontralateral hemisfer. Şekil 2D her iki tedavi grubunda için EB sızıntı değerlerinin bir aralığını gösterir.
Şekil 1:. Özel tasarlanmış RHP odaları Üst panel dört adede kadar odalarında hava akışının bireysel izlenmesi için özel olarak oluşturulmuş debimetreler göstermektedir. Hava geçirgen boru akış ölçer bırakarak ve alt panelde 15 L indüksiyon odasının giriş bağlantı takılarak olarak gösterilmiştir. RHP hava sirkülasyonu sağlamak için süresince çıkış noktası açık kalır.
Şekil 2.:. ÜSP infarkt hacmi ve BBB kesinti ÜSP (A), kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında% 46 infarkt hacmi azaltır azaltır, ancak hiçbir TTC verilerden elde edilen hemisferik şişme etkisi (B) (C) Aynı hayvanlarda, ÜSP BBB bozulmasını azaltır (p = 0,05), kontrlateral yanm küreden normalize sızıntı. (D) Örnek TTC lekeleri her iki ÜSP-muamele edilmiş ve% 21 O 2 Evans Blue ile tanımlandığı gibi olduğu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sistemik hipoksi farelerde (yani, 2 saat% 11 O 2) Bir tek maruziyet "geçici" kısa ömürlü hipoksik ön hazırlık meydan epigenetik yanıtı anlam tMCAo, 29 beyni korur ve temel fenotip içinde geri günler. Hipoksik önkoşullama uyaranın Tekrarlanan sunumlar dramatik nöroprotektif fenotip süresini uzatmak. 6 Birçok çalışma tekrarlayan uyaran trenin sıklığı, büyüklüğü ve süresi bu yanıtın kritik belirleyicileri olduğunu göstermiştir. Örneğin, sadece aynı yoğunluk ve hipoksi süresi (2 saat 11% oksijen) haftada 3 kez (MWF) üzerinde 2 tMCAo, 6 nörovasküler koruma için terapötik pencere uzatmak vermedi hafta ama uzun ikna etmek için yeterli oldu yinelenen retinada vadeli iskemik tolerans. 30 İlginçtir ki, her ne kadar sistemik hipoksi (5 poz 5 saat 8% O 2 </ Sub>) 5 hipoksik maruziyet 3 gün arayla yerleştirilmiş olsaydı nöro kayboldu, 6 gün arayla 3 gün, son hipoksik maruziyet sonrası uyarılan tMCAo karşı korumalıdır aralıklı. 31 Bu farkın nedeni belirsizliğini koruyor, ancak bağlı olabilir Bu protokolde ve / veya bu şiddeti hipoksik zorluklar arasında yetersiz iyileşme süresi ciddi hipoksi akrabası süresi.
Yaralanma uyaran süre değil sıklığı, büyüklüğü ve süresi etki alanları arasında tekrarlayan hipoksik meydan kısa, titrasyon olarak, tolerans gelişimi için kritik görünüyor, dokuya özgü ve belki de türe özgü etkiler söz değil. % 8 6 saat O 2 hipokampal nöron ölümünü indükleyen olsa Örneğin, TÜSP poz 9 3, 4 saat boyunca% 8 O 2 maruz kalma içerir. 32 Dolayısıyla, ilgili RHP protokolüne sıkı bir bağlılık olmalıdır süresi ve endojen indükleme hipoksik maruz şiddetikoruma. Önkoşullanma kaynaklı korunmasına ilişkin sirkadiyen ritmin potansiyel etkisi daha keşif ihtiyacı olmasına rağmen, belirli bir grup için günün aynı anda 33 performans RHP pozlama olası karıştırıcı etki riskini azaltır. Doz-yanıt ve etkinlik açısından, fokal inme en sağlam ÜSP aracılı koruma, sağlıklı farelere bağışıklık bastırıcı bir fenotip sergileyen ÜSP-tedavi edildiğinde tMCAo (a zamanda nihai hipoksik maruziyet 3 Aşağıdaki 2 hafta indüklendi oluştu iskemik yaralanma olmaması). 7 Bu 2 haftalık zaman noktası maksimal diğer akut MSS yaralanmalara karşı koruma ya da diğer organ sistemleri içinde dönemi ile aynı olmayabilir. Hem RHP protokol ve epigenetik yanıt zamansal özellikleri şüphesiz her yeni öteleme kullanım için optimizasyon ihtiyacınız olacaktır.
TMCAo prosedürünün en büyük sınırlamalar biri enfarktüs vo heterojen dağılımıLumes bu temsili veri seti ile gösterildiği gibi. Willis, leptomeningeal anastomozlar ve dorsal teminat kavşaklar Circle tarafından sağlanan kollateral dolaşım tutarsız infarkt hacimleri yol açabilir. 34 Varyasyon farelerin farklı suşları Willis poligonu yanı sıra arka iletişim arter varlığı ve açıklığı, 25 arası 35 başka gruplar içinde enfarktüs hacimleri tutarlılığını azaltabilir. Sağlam örneklem büyüklükleri ve çoğaltma genellikle kesin sonuçlar üretmek için gerekli olan ve buna bağlı olarak açtıktan sonra deney tasarımı dahil edilmelidir. Inme indüksiyonu için diğer yöntemler, örneğin bir çapak yanal kafatasında bir delik veya MCA'nın uzak dallarının fototromboz yoluyla birincil MCA dal tıkanıklığı özellikle uzak fokal iskemi yöntemleri, genellikle strok hacmi daha az varyasyon üretir. Onlar aynı anda hücre dışı ve hücre içi ödem üretmek olarak FOTOTROMBOTİK vuruş, ancak, bir phenomeno sınırlın insanlarda iskemik inmelerin görmedim. 36 Tersine, tMCAos nedeniyle orta serebral arterin tıkanması meydana insanlarda tüm inmelerin% 60 üzerinde olduğu gibi klinik ortama daha doğrudan uygulanabilir. 37 Nihayet, tMCAo sırasında kullanılan anestezi, izofluran , izofluran seviyeleri ameliyatları arasında tedavi edilen ve edilmeyen deney grupları arasında tutarlı olmalıdır bu nöro hesaba amacıyla. nöro ikna etmek için 38 gösterildiği ve potansiyel nöroprotektif etkilerini azaltmak için <% 3 muhafaza edilmiştir. 39
Zaman, TTC boyama işleminde kritik önem taşımaktadır. 4 saat ila 7 gün arasında değişen TTC lekeleme iskemi sonrası gerçekleştirilebilir olan zamanı strok literatürde büyük farklılıklar vardır, ancak inme sonrası, 18,40 TTC lekeleme çoğu için inme sonrası 24-48 saat sonra gerçekleşmelidir tutarlı ve net bir şekilde tasvir enfarktüs hacimleri. TTC enfarktüs hacimleri arı varn inme sonrası 24 saat stabilize ancak 48 saat sonra, iskemik beyin içine makrofajların bir akını, TTC ile beyin dokusunun boyanması derhal kurban takip etmeli Ayrıca infarkt hacmi zor. 14,40 tanımlayan yapar bulundu. Boyama Geciktirme nedeniyle hayvan ölümü değil beyin enfarktüsü sonucu artan mitokondriyal ölüm leke kalitesini azaltacaktır. Beyin bıçakları sokulması esnasında nemli tutulur değilse mitokondriyal ölüme benzer bir artış ortaya çıkar. Bu protokol, açık bir şekilde TTC lekelemesi ile infarkt analizi fayda gösterir, diğer immünohistolojik lekeleri tMCAo Aşağıdaki enfarktüs hacmini ölçmek için kullanılabilir. Cresyl mor veya floro-yeşim boyama kurban sonrasında boyama az sert zaman gereksinimleri vardır, ama bu klasik lekeler kriyostat veya mikrotomla elde çok ince kesitler gerektiren ve dolayısıyla bütünleştirici toplamı ve analiz için daha fazla zaman gerektirir. 14 Ayrıca, bu stbelirli bir beyin infarkt hacmi ve BBB bütünlüğü arasında doğrudan karşılaştırma olasılığını ortadan kaldırarak, 15 diğerleri tarafından geliştirilen ains BBB bozulma EB miktar ile bağlantılı olarak kullanılamaz. Saf beyaz bir hacim karşı tipik pembe sergilenen hayvanlar ÜSP ile muamele edilmiş olduğu not edilmelidir. 6 ÜSP ile tedavi edilmiş farelerde enfarktüs arınma önlemek için, biz karşı daha fazla pembe sağlıklı dokuda neden TTC için daha kısa boyama süresi Kullanımda Koyu kırmızı. Evans Mavisi işlem de o kadar saf beyaz infarktlar Bu protokolde sunulan ikili miktar boyama olası değildir infarkt alanını koyulaşabilir.
Içinde ve gruplar arasında EB ölçümü karşılaştırmak amacıyla, tüm hayvanlar EB eşdeğer sirkülasyon sürelerini geçmelidir. Diğerleri EB hemen sonra reperfüzyon enjekte ve EB kadar 72 saat, 41 ya da 4 saat sonrası tMCAo alternativ olarak, 4 saat boyunca 15 dolaşmaya için dolaşmasına izin varE yaklaşımları. kesintiye BBB haçlar ve beyin dokusu girer EB miktarı enjeksiyonu zaman kurban zamanına albümin bağlı boyanın ayrılmaz birikimini temsil eder. Bu nedenle, bu yazıda anlatılan yöntem, 22 ve reperfüzyon 24 saat arasında tam zamanında BBB durumunu ortaya çıkarır ve daha önceki veya sonraki açıklıklar veya bariyer kapanması kaçırabilir. Bunun aksine, Wang ve arkadaşları tarafından kullanılan yöntem. 72 saat o 3 gün inme sonrası dönemde BBB durumunda tüm değişiklikler de dahil olmak üzere, inme takip için BBB durumunu ortaya koymaktadır 42 Ne protokol daha iyi veya kötü olduğunu.; kısa sirkülasyon süreleri kullanarak BBB geçici açılış "eksik" bir riski var olmaya devam etmekle beraber, bu müfettişlerin BBB patofizyolojisi belirli zamansal özelliklerini tanımlamak ve burada gösterildiği gibi, diğer yöntemler ile eşleştirmek için izin verir. Diğerleri intrakardiyak 1 dk transcardial perfüzyon sonrası EB enjekte edilerek TTC ve EB birleştirdik. 18 Ancak, bu bir araya geldihod tutarsız sonuçlar yukarıda tarif edilen protokole göre çok daha karmaşık bir işlemdir.
ÜSP için en gelecek vaat eden yönlerden biri de, diğer hastalık durumlarında bu önkoşullanma protokolün öteleme uygulamasıdır. Aralıklı hipoksik maruz iskemi daha diğer pro-inflamatuar MSS şartlarında koruyucu olduğu tespit edilmiştir. Alzheimer sıçan modelinde, hipobarik hipoksi 4 saat günlük risklerin 2 hafta bellek saklama ve beta-amiloid intraserebral enjeksiyonlar sonrası kortikal nöronların kaybı bozulma azalır. 43 Aralıklı hipoksi (hipobarik hipoksi 15 saat, günlük risklerin 2 hafta ) L-buthionine- [S, R] '-sulfoximine (L-BSO) infüzyonu, striatal dopaminerjik iletimi bozar Parkinson modeli farelere koruyucu olduğu tespit edilmiştir. 44 Bununla birlikte, Alzheimer ve Parkinson bu modeller incelenmiştir kısa vadeli etkileriÜSP tarafından uyarılan uzun vadeli nöro araştırılması hipoksik önşartlama. 43,44 araştırma için verimli bir gelecek yönünde olabilir. Ayrıca, RHP tarafından uyarılan nöro EB ile analiz edilebilir Alzheimer fare modellerinde geliştirilmiş BBB dürüstlük, kadar uzanabilir. 45 çift TTC ve EB analizi daha yararlı Parkinson modelinde olacağını o striatal lezyonları 46 ve BBB indükler olarak sırasıyla TTK 48 ve EB, 49 ile ölçülebilir bozulma, 47. Genel TÜSP bu benzersiz uzun vadeli, anti-inflamatuar ve nöroprotektif etkileri indükler gibi büyük öteleme potansiyele sahip önkoşullamanın basit, güçlü şeklidir. TTK ve EB ikili ölçümü de kolayca mitokondriyal bozulması, hücre ölümünü ve BBB sızıntı içeren diğer hastalık devletlere uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
- Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
- Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
- Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
- Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
- Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
- Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
- Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
- Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
- Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
- Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
- Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
- Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
- Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
- Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
- Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
- Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
- Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
- Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
- Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
- Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
- Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
- Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
- Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
- Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).
