Introduction
Co-Infektion, Infektion mit mehreren gleichzeitigen Infektionen, ist die Norm in natürlichen Umgebungen. Co-Infektion kann einen großen Einfluss auf die Krankheitspathologie und der klinischen Behandlung von jeder Infektion. Im Zusammenhang mit der Ko-Infektion, Impfstoff und Wirksamkeit von Medikamenten sowie diagnostische Tests können negativ beeinflusst werden (Übersicht in 1). Trotz ihrer Bedeutung ist die Mehrheit der Erreger der Forschung ist jedoch der Auffassung nur einzelne Infektionen.
Malaria und HIV-1 (HIV) sind die führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität weltweit. Bereiche von Malaria und HIV Endemizität teilen eine breite geografische Überschneidungen, indem Millionen von Menschen, die von Co-Infektion und somit ein Risiko für schwerere klinische Erkrankung 2-10. Die beiden Krankheiten negativ interagieren. In HIV-infizierten Personen, höhere HIV-Viruslast und vorübergehende Abnahmen der CD4 + T-Zellzahlen während einer Malaria-Infektion zu sehen, währendMalariaparasiten Lasten und Risiko von klinischen und schwerer Malaria sind in co-infizierten Personen 2,3,5,7,8,10 höher. Die Mechanismen, durch die HIV erhöht Malaria Schweregrad sind nicht vollständig verstanden und rechtfertigen weitere Untersuchungen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren, mit dem Malaria und HIV-Koinfektion kann in vitro untersucht werden. Insbesondere ermöglicht dieses Verfahren für die Untersuchung von Malaria-spezifischen Immunantworten im Zusammenhang mit HIV-Infektion. Unser Protokoll beschreibt ein vielseitiges Kokultursystem frisch isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von chronisch HIV-infizierten Spendern und in vitro kultivierten P. isoliert falciparum parasitierten Erythrozyten (PfRBC). Die Auswirkungen von HIV antiretroviralen Therapie auf diesen Reaktionen können auch unter Verwendung prospektiv erfasst PBMCs von HIV (+) Spender vor und nach der Behandlung untersucht werden.
Hat dieses System verwendet, um den Einfluss der HIV-Infektion zu untersuchenMalaria-spezifischen angeborenen Immunantwort 11,12 und waren in der Lage, um festzustellen, dass die Malaria-spezifische IFNy und TNF-Antworten werden in NK-Zellen beeinträchtigt, NKT-Zellen, γδ T-Zellen von HIV (+) Spender vor und nach der HIV antiretroviralen Therapie . Darüber hinaus konnten wir dieses System verwenden, um festzustellen, dass Monozyten-Funktionen werden auch in HIV (+) Spendern beeinträchtigt, aber erholen post HIV antiretroviralen Therapie.
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Protocol
Dieses Protokoll erfordert die Rekrutierung von Spendern für Serum und RBC für Parasitenkultur verwendet werden und HIV (+) und nicht-infizierten Spendern für PBMC Isolierung. Institutional Review Boards müssen alle Studien zu genehmigen und alle Geber müssen informierte Zustimmung vor der Blutabnahme zu schaffen.
ACHTUNG: Die Arbeit mit menschlichen Blutproben und die menschliche Malaria-Parasiten erfordert Vorsichtsmaßnahmen. Tragen Sie immer einen Laborkittel, Handschuhe, und die Arbeit in einem Level 2 Biosicherheitsschrank. Im Falle einer versehentlichen perkutanen Exposition für die menschliche Malaria zu melden, um Gesundheit und Sicherheit zur prophylaktischen Behandlung. Zusätzliche Sicherheit geprüft werden sollte auch an Ort und Stelle für die Arbeit mit HIV (+) Blut gestellt werden. Tragen Sie einen Rückschlusslaborkittel. Doppelhandschuh (oben Handschuh sollte Latex). Führen Sie alle Handling in einer Ebene 2 Biosicherheitsschrank. Verwenden Sie keine Glas oder scharfe Gegenstände. Verwenden Sie keine Wasserstrahlpumpe. Legen Sie alle kontaminierten Teile virox Lösung oder Bleichmittel für mindestens 1 Stunde vor der Entsorgung.1 Stunde nach der Anwendung waschen Sie alle Oberflächen mit virox und UV. Beachten Sie, dass jede Institution ihre eigenen spezifischen Biosicherheits Vorschriften, die befolgt werden müssen, haben. Melden Sie alle zufälligen Forderungen an HIV-infizierten Blut zu Gesundheit und Sicherheit für die Bewertung und Berücksichtigung möglicher Postexpositionsprophylaxe.
Hinweis: Verschiedene Stämme von P. falciparum Malaria-Parasiten vorhanden sind. ITG wurde für diese Experimente verwendet, aber verschiedene Stämme verwendet werden. Ausgezeichnete Anweisungen zum Einfrieren und Auftauen Plasmodium falciparum Parasiten sind auf der Website MR4 13 zur Verfügung.
1. Erstellen RPMI-A für die Malariaerreger Kultur
- Machen RPMI-0 durch Mischen von 950 ml ddH 2 O, 1 Paket RPMI-1640-Pulver, 6 g HEPES, 2 g Natriumhydrogencarbonat und 1,35 mg Hypoxanthin.
- Thaw hitzeinaktiviertem Humanserum von zwei verschiedenen Spendern. AB Gebern werden am besten aber jeder kann verwendet werden, wenn Parasiten sind in O-Typ gezüchtet werdenrote Blutzellen (RBC). Kehren Rohre zu mischen. Wenn Serum enthält Partikel oder ist dick Spin bei 2000 Upm und dann auswählen, flüssige Anteil mit Hilfe eines 0,45 um-Filtereinheit.
- Verwendung eines 0,2 & mgr; m Filtereinheit Filter 180 ml RPMI-0, 20 ml Humanserum (10 ml von jedem Spender) und 0,5 ml 10 mg / ml Gentamycin.
Hinweis: Humanes Serum können die Filter verstopfen, so mehr als eine Filtereinheit erforderlich sein. - Beschriften Sie die Mediumflasche mit RPMI-A, das Datum und die Quelle des Serums. Kühlen Sie bis erforderlich. RPMI-A kann bewölkt drehen, wenn gekühlt. Dies ist normal, aber zunehmender Trübung ist ein Zeichen von Verunreinigungen.
Hinweis: das Parasitenwachstum in unterschiedlichen Spenderserum variieren. Es ist eine gute Idee, alle Humanserum Chargen für gute Parasitenwachstum vor der Verwendung zu testen.
2. Vorbereitung Menschliche rote Blutkörperchen für Parasite Kultur
Hinweis: Blutspender sollten Typ O. sein
- Sammeln Sie 7-10 ml Blut in säure citRate-Dextrose (ACD) Röhren. Schreiben des Spenders ID und das Datum der Sammlung auf dem Etikett.
- Shop Blut bei 4 ° C, bis sie benötigt. Verwenden Sie für die Blutparasiten Kulturen innerhalb von 1 Monat.
- Wischen Sie die Oberseite des Rohres mit 70% Ethanol. Stopfen vorsichtig abnehmen und entsorgen. Übertragen Sie Blut in ein 15-ml-Tube. Spin 3 min bei 1.000 x g. Entfernen Plasma durch Aspiration.
- Aussetzen RBC mit einem gleichen Volumen von warmem RPMI-0. Spin für 5 min bei 1.000 x g. Entfernen Sie die Speckhaut durch Absaugen, Resuspension in 5 ml RPMI-0 und wiederholen Sie den Wasch 2 weitere Male.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie genug RPMI-A, um eine Mischung, die 50% RBC ist nach Volumen zu erzeugen.
- Lagerung bei 4 ° C, bis sie benötigt.
3. Die Aufrechterhaltung Parasite Kulturen
- Pre-warmes RPMI-A bis 37 o C.
- Platzieren taut Parasiten (siehe MR4 Protokoll für Auftauen) in eine T25-Kolben mit 5 ml RPMI-A und 75 ul der gewaschenen menschlichen RBC einen Hämatokrit von ca. 3%.Hinweis: Hämatokrit misst das Volumen der RBC im Vergleich zum Gesamtvolumen. Zu berechnen Hämatokrit zu messen das Volumen des gepackten RBC zu dem Gesamtvolumen Medium plus RBC. Annehmen, dass die aufgetauten Parasiten werden mit 75 ul RBC beizutragen. Durch Zugabe von 150 ul RBC Lager in den Kolben (was äquivalent Zugabe von 75 ul gepackten RBC), gibt es insgesamt 150 ul RBC in 5 ml Medium, welches auf einen Hämatokrit von 3% (150 & mgr; l / 5000 entspricht ul x 100% = 3%).
- Der Kolben wird Gas für 30 s mit Parasiten Gasgemisch (1% O 2, 3% CO 2, Rest N 2). Dichtung und Den Kolben breiten Seite nach unten in einem 37 ° C Inkubator, um für die größte Fläche für den Gasaustausch zu ermöglichen.
- Um das Medium wechseln und prüfen Parasitämie (muss täglich durchgeführt werden), vorsichtig den Kolben zu bewegen, um die RBC-Schicht nicht stören. Mit einer sterilen Pasteurpipette unplugged Abziehen der Kulturmedium ohne die Blutschicht zu stören.
- Um PA Preisrasitemia, entfernen Sie ein 10 ul-Probe aus dem Blut-Schicht, legen Sie sie auf einen Glasobjektträger und mit einer zweiten Glasplatte erstellen Sie einen dünnen Blutfilm. Lassen Sie Folie, um zu trocknen.
- Place 4 ml frisches RPMI-A in den Kolben, vorsichtig mischen, Gas für 30 Sekunden, und in Brutschrank bei 37 ° C.
- Färben Sie die Folie mit der Hema3 Färbekit nach Herstellerprotokoll.
- Für optimale Färbung, die Objektträger in der Fixierlösung für 10 sec, Lösung I für 10 sec, und Lösung II für 30 sec. Spülen in Wasser und lassen gleitet, um zu trocknen.
- Berechnen Parasitämie durch Zählen der Anzahl der PfRBC (dunkel gebeizt violett) im Vergleich zu der Gesamtzahl der RBC (Bunt pink). Graf insgesamt 300 Zellen, um die Genauigkeit zu gewährleisten.
- Wenn Parasiten haben eine Parasitämie von 5% erreicht, erweitern Sie die Kultur in eine T75-Flasche mit 40 ml RPMI-A, und 500 & mgr; l RBC.
4. Parasite Synchronisation
Hinweis: Der Tag vor ter experimentieren, den Parasiten Kultur zu synchronisieren durch Behandlung mit Alanin. Nur Ringstadium-Parasiten und nicht infizierten RBC wird diese Behandlung überleben. Alanin-Synchronisation gibt Ihnen eine reine Trophozoit Kultur am nächsten Tag, die in den Co-Kultur-Experimente verwendet werden können. Achten Sie darauf, mit einem Parasiten Kultur, die einen Großteil der Ringstadium-Parasiten enthält starten.
- Alanin herzustellen durch Mischen von 8,01 g Alanin (300 mM) und 0,365 g Tris (10 mM) in 300 ml ddH 2 O. Bringen pH auf 7,4. Filter sterilisiert unter Verwendung eines 0,2 & mgr; m Filtereinheit.
- Pre-warmen Alanin-Lösung auf 37 o C.
- Spin down der Parasit Kultur (5 min x 1.000 x g), und entfernen Medium.
- Pellet in 19 Volumina von Alanin-Lösung (1 ml gepackt RBC zu 19 ml Alanin Lösung). Inkubation für 15 min bei RT.
- Spin 5 min x 1.000 x g. Überstand wird abgesaugt. In RPMI-0 einmal zu waschen. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren in RPMI-A und stellen Hämatokrit auf ~ 3%. Gwie Kolben und Rückkehr zu 37ºC
Anmerkung: Für Co-Kultur-Experimente ein Minimum von 5% Parasitämie Trophozoiten benötigt wird, mit 10% Parasitämie als optimal angesehen.
5. Parasite und RBC Vorbereitung für Co-Kultur-Experimente
- Verwenden ein Verhältnis von 3 PfRBC pro PBMC in Co-Kultur-Experimente, um eine entzündliche Reaktion hervorzurufen. Zur Berechnung der Gesamt PfRBC, zu quantifizieren Parasitämie, indem Sie einen dünnen Blutausstrich wie in 3.5 beschrieben, und Hämatokrit durch Zählen der Anzahl von RBC pro ml Parasitenkultur mit einer Zählkammer.
Anzahl der PfRBC =% Parasitämie x Gesamt RBC / ml x ml Kultur. Zum Beispiel: 10 ml Kultur bei 10 x 10 6 RBC / ml und 10% Parasitämie ist gleich 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Drehen Sie das Parasitenkultur für 5 min bei 1000 xg (RT). Aspirat Medium und Resuspension bei 6 x 10 6 PfRBC pro ml in RPMI-S + (500 ml RPMI-1640, ergänzt mit L-Glutamin und HEPES, 10% Hitze ergänztinaktiviertes FBS, 1,5 ml Gentamicin, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat, 5 ml 10 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml 5 mM β-Mercaptoethanol).
- Die Kontrolle Blut (nicht infizierten RBC vom gleichen Spender zum Halten des Parasit Kultur verwendet werden), berechnet Hämatokrit und resuspendieren in RPMI-S + in der gleichen Anzahl von RBC pro ml auf der Parasitenkultur.
6. Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)
- Sammeln venöses Blut in Natrium-Heparin Röhrchen (grüne Spitze) sowohl von einer chronischen HIV (+) Spender und einem HIV (-) Kontrolle. EDTA Produkt nicht als Antikoagulans wie EDTA Calciums chelatbildende Wirkung betrifft Zellfunktion. Im Durchschnitt erwarten, zwischen 5-10 x 10 6 PBMC pro 10 ml Blut. Bei einem typischen Experiment sammeln 30 ml Blut von jedem Spender. Das Blutvolumen benötigen, um nach den experimentellen Anforderungen angepasst werden.
- So schnell wie möglich und auf jeden Fall innerhalb von einer Stunde von Blut gesammelt,entfernen Sie das Blut aus den Rohren und in einen Kunststoff 50 ml Tube. Monozyten insbesondere wird aktiviert, und halten Sie sich Glas, so ist es wichtig, dass, wenn Glasblutentnahmeröhrchen werden verwendet, Zellen werden so schnell wie möglich entfernt werden.
- Drehen Sie das Blut bei 1.000 × g für 15 min und sammeln Plasma (dies kann für weitere Untersuchungen bei Bedarf verwendet werden - wenn nicht, kann dieser Schritt übersprungen). Man verdünnt das Blut im gleichen Volumen kalter DPBS.
- Zeigen 15 ml Ficoll RT in eine 50-ml-Tube. Langsam, mit einem sterilen Plastiktransferpipette, die Schicht der Blut / DPBS Lösung über die Ficoll ohne Mischen. Es können maximal 25 ml Blut / DPBS Lösung kann über je 15 ml Ficoll geschichtet werden.
- Dreh die Gradienten für 30 min bei RT mit 600 x g. Stellen Sie sicher, die "keine Bremse" Einstellung aktiviert ist.
- Sobald die Zellen gesponnen, suchen Sie nach der Grenzfläche zwischen den beiden Phasen. Hier werden die PBMC sind. Mit einem sterilen Plastiktransferpipette sammeln die PBMC von der Schnittstelle (sieheAbbildung 1). Minimieren Kontamination durch RBC.
- Platzieren gesammelten Zellen in 50-ml-Röhrchen, mit nicht mehr als 20 ml pro Röhrchen. Oberrohr bis zu 50 ml mit steriler kalter DPBS.
- Dreh die Zellen für 10 min bei 4 ° C bei 300 x g.
- Überstand verwerfen, Pellet in 5 ml sterile kaltem DPBS und bündeln alle Zellen des gleichen Spenders in eine Röhre. Oben bis zu 50 ml mit sterilem DPBS, und wiederholen Sie den Waschschritten 2 weitere Male.
- Die Zellen in 10 ml RPMI-S + Medium.
- Entfernen Sie ein 20 ul-Aliquot und mit 20 ul Trypanblau mischen. Je 10 & mgr; l in einem Hämozytometer und zählen Sie die lebenden Zellen (Zellen, die nicht den blauen Farbstoff genommen haben - alle blauen Zellen tot sind). Verwenden Sie ein Hämocytometer auf die Zellzahl in einer Lösung wie folgt zu berechnen.
Hinweis: Ein Hämocytometer weist ein Raster von vorgegebenen Abmessungen so, daß die von den Leitungen abgedeckt ist bekannt.- Stellen Sie sicher, das Hämocytometer sauber ist. Legen Sie das Deckglas über die counting-Bereich. Last 10 ul Zelllösung, indem die Pipettenspitze in eine der V-förmigen Vertiefungen. Die Fläche unter dem Deckglas wird durch Kapillarwirkung zu füllen.
- Setzen Sie den geladenen Hämocytometer unter dem Mikroskop. Der vollständige Raster der Hämocytometer enthält 9 Quadraten von je 1 mm 2. Zählen Sie alle Zellen innerhalb jeder großen Platz. Wenn zu viele Zellen vorhanden sind, verdünnte die Lösung weiter und erzählen.
- Berechnen Zellkonzentration wie folgt: Gesamtzellen / ml = (gesamte gezählte Zellen / Anzahl der Quadrate) x Verdünnungsfaktor x 10.000 Zellen / ml, beispielsweise (500 Zellen / 5 Quadrate) x Verdünnungsfaktor von 20 x 10.000 Zellen / ml = 20 x 10 6 Zellen insgesamt.
- Einstellen Medium auf eine Endkonzentration von 10 x 10 6 pro ml (RPMI-S + Medium).
7. Malaria / HIV-Koinfektion Kultur
- Platte 100 ul isolierten PBMCs und 400 ul RPMI-S + Medium auf eine Platte mit 24 Vertiefungen (1 × 10 6 PBMC pro Vertiefung). Stellen Sie sicher,dass Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung ein: 3 Brunnen für nicht infizierten RBC, 3 Brunnen mit PfRBC, 3 Brunnen mit mittlerer und 3 Brunnen mit PMA / Ionomycin. Dies ist sowohl für die HIV (+) und HIV (-) Probe.
- Zur PfRBC Vertiefungen legen 3 x 10 6 PfRBC in jeder der Vertiefungen (500 & mgr; l der Parasitenkultur 5,2) hergestellt.
- Für nicht infizierten RBC Brunnen, legen Sie 500 ul der nicht infizierten RBC Kultur in 5,3 in jeder der Vertiefungen hergestellt.
- Für mittlere Vertiefungen legen 500 ul RPMI-S + Medium in jeder der Vertiefungen.
- Für PMA / Ionomycin Brunnen, vorzubereiten PMA / Ionomycin-Lösung (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Platzieren 500 ul dieser Lösung in jede Kammer.
Hinweis: Da potente Stimulatoren für T-Zell-Zytokin-Sekretion sind PMA und Ionomycin als positive Kontrolle verwendet, um sicherzustellen Zellen funktional sind. - Plazierungsplatte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator.
- Optional: Verwenden Sie überschüssige Zellen für die phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie oder lagern in einem RNEine Stabilisierungslösung für künftige mRNA Expressionsanalyse.
8. Nachweis von Malaria-Immunantworten
ANMERKUNG: Führen Kokultur Experimente solange 4 Tagen. Während dieser Zeit ist kein Mediumwechsel erforderlich. Der optimale Zeitpunkt wird auf dem Zelltyp von Interesse, und die Frage gefragt, abhängen. Eine Inkubation von 12 bis 48 h ist optimal für Monozyten-Reaktionen auf PfRBCs, während Lymphozyten-Antworten wurden am besten bei 72 bis 96 h beobachtet. Die Zeitpunkte werden müssen auf der Grundlage der experimentellen Frage optimiert werden. Kürzere Zeiträume (2-4 h) verwendet werden, wenn die Interaktion zwischen intakten PfRBC und PBMCs von Interesse ist.
- Spin Platte bei 300 × g für 3 min auf Pellet-Zellen. Sammeln 700 ul Kulturüberstand aus jeder Vertiefung.
- Spin Überstand bei 1.000 xg für 5 min, um sich keine Fremdkörper.
- Aliquot geklärte Überstand nach Bedarf, Etikett, übertragen und bei -20 ° C bis zur Analyse der sekretierten Faktoren zu sein LeistRMED.
- Analysieren Zytokin / Chemokin-Antworten, die durch ELISA oder durch Perlenanordnung (folgen Sie schlug vor, Protokolle des Herstellers).
- Sammeln Zellen restlichen in der Platte in eine RNA Stabilisierungslösung und nutzen für die mRNA-Expressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR 14-16.
9. Die intrazelluläre Durchflusszytometrie zur Zellspezifische Ccytokine Responses Verwendung mit P. PBMC kokultivierten falciparum infizierten RBC
Anmerkung: Wie oben der Länge des Ko-Kultur genannt wird auf dem Zelltyp von Interesse abhängen. Wenn in monozytären Antworten interessiert, eine kürzere Inkubationszeit PfRBC benötigt wird. Mal länger sein für angeborene Lymphozytenantworten yô T-Zellen, NK-Zellen, NKT-Zellen) und mehr noch für CD4 und CD8 T-Zellen. Optimierung erforderlich.
- 6-8 Stunden vor der Analyse fügen 1 ul 1,000x Brefeldin A in alle Vertiefungen. Bringen Sie die Platte um 37 ° C Inkubator. Nach 6-8 h Incubation, Ort, Platte auf Eis für 15 min.
- Zellen aus den Vertiefungen mit heftigem Pipettieren zu entfernen und legen Sie sie in der Bezeichnung microcentifuge Rohre. Scraping erforderlich sein, um Monozyten zu entfernen.
- Spin-Zellen für 5 min bei 1.000 x g. Überstände entfernen. Die Zellen in 500 ul Durchflusszytometrie-Puffer (1x DPBS, 2% hitzeinaktiviertem FBS, 0,02% Natriumazid).
- Kluft Zellen up, so dass jede Probe: ein Rohr für die vollständige Antikörperfärbung (240 & mgr; l) und ein Rohr für fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrollantikörperfärbung (240 ul). Becken eine kleine Menge von jeder Probe (20 ul) für die ungefärbte Durchflusszytometrie Steuerung (dies wird bei der Einrichtung der Durchflusszytometer verwendet werden).
- Spin-Zellen für 5 Minuten bei 500 x g. Überstände entfernen.
- Zellen, die mit nicht-konjugiertem Anti-Human-CD16 / CD32 (5 & mgr; g / ml) in 50 ul Durchflusszytometrie-Puffer für 15 min Inkubation bei 4 ° C an Fc-Rezeptoren zu blockieren.
- 1 ml Durchflusszytometrie-Puffer zu jedem Röhrchen. Spin cells für 5 min bei 500 x g. Überstände entfernen.
- Die Zellen in 50 ul Durchflusszytometrie-Puffer mit einem vortitrierten Konzentration fluorophorkonjugierten Antikörper an gewünschte Zelloberflächenmarker. Vormischung genug Antikörperlösung für alle Proben zu gefärbt werden. Inkubieren Zellen bei 4 ° C für 20 min. Vor light.Note: Betrag jedes Antikörpers müssen optimiert werden. Wir routinemäßig für CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14 zu färben. Titriert Volumina für diese Antikörper werden in Tabelle 1 gezeigt.
- 1 ml Durchflusszytometrie-Puffer zu jedem Röhrchen. Spin-Zellen für 5 Minuten bei 500 x g. Überstände entfernen.
- 100 ul Cytofix / Cytoperm Lösung in jedes Röhrchen. Inkubieren Zellen für 20 Minuten bei 4 o C Vor Licht schützen.
- 1 ml der Perm / Waschpuffer (10x Konzentrat, wie vorgesehen - zu verdünnen, um 1x mit ddH 2 O) in jedes Röhrchen. Spin-Zellen für 5 Minuten bei 500 x g. Überstände entfernen.
- In 100 μl von Perm / Waschpuffer in FMO Kontrollantikörperfärbung Rohren und mischen, um Zellen zu resuspendieren.
- 100 ul perm / Waschpuffer mit einem vortitrierten Konzentration fluorophorkonjugierten Antikörpern gewünschten intrazellulären Marker (dh Cytokine / Chemokine) und Voll Antikörperanfärbung Röhren.
Anmerkung: Menge an jeden Antikörper müssen optimiert werden. Wir routinemßig mit anti-TNF und anti-IFN-Antikörper färben. Titriert Volumina für diese Antikörper werden in Tabelle 1 gezeigt. - Alle Röhrchen für 30 min bei 4 ° C inkubieren Vor Licht schützen.
- 1 ml Perm / Waschpuffer in jedes Röhrchen. Spin-Zellen für 5 Minuten bei 500 x g. Überstände entfernen.
- Die Zellen in 300 ul Durchflusszytometrie-Puffer mit 1% Paraformaldehyd. Lassen Sie sitzen für ein Minimum von 15 Minuten, um HIV zu neutralisieren.
- Bereiten einzigen Antikörper gefärbt Proben unter Verwendung von Kompensations Perlen, um zum Ausgleich auf dem Durchflusszytometer eingestellt werden. Die Art der EntschädigungPerlen von dem verwendeten Antikörper abhängig (dh., Anti-Maus-Ig, Anti-Ratten / Hamster-Ig). Vortex-Perlen. Einen Tropfen Perlen pro Antikörper. Hinzufügen gleiche Mengen an Antikörper, wie zum Färben verwendet. Fügen Sie 200 ul der Durchflusszytometrie-Puffer. Dies sind nun einsatzbereit. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Kügelchen zu waschen.
- Erwerben Sie Proben auf einem Durchflusszytometer so schnell wie möglich und innerhalb von 24 Stunden für beste Ergebnisse. Tandem-Farbstoffe sind anfällig für Spaltung mit Lagerung, so empfehlen wir sofortige Übernahme, wenn möglich.
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Representative Results
Die Graphen zeigen die Niveaus der IFN & ggr; Produktion von NKT-Zellen (Figur 2), mit CD56 + CD3 + γδ- Toren der NKT Zellen Population zu erhalten (Daten nicht gezeigt). Die Zellen wurden für 72 Stunden vor der Färbung kultiviert. Sobald befleckt, 100.000 CD3 + Zellen wurden auf die Strömung erfasst Zytometer zu groß genug Populationen von NK, NKT und γδ-Zellen (Zellen von Interesse) zu erhalten. Ein Minimum von 5600 NKT-Zellen sind auf jedem Graphen angezeigt. TNF-Produktion wird in der gleichen Art und Weise erhalten (Daten nicht gezeigt). Die Diagramme zeigen deutlich, dass IFN & ggr; Produktion niedriger in Zellen von HIV (+) Individuen gegenüber HIV ist (-) Individuen PfRBC belichtet.
Durchflusszytometrie-Analyse ist sehr subjektiv. Es ist daher wichtig, alle geeigneten Kontrollen für jedes Experiment (siehe Abbildung 2). Hintergrundwerte werden unter Verwendung der FMO-Proben, die für eine wahre Darstellung des Zytokinfärbung ermöglicht berechnet.Zellen, die mit PMA / Ionomycin stimuliert wurden als positive Kontrolle verwendet (Daten nicht gezeigt). PMA und Ionomycin sind starke Stimulatoren der T-Zell-Zytokin-Produktion. Ein Mangel an IFN-Produktion in diesen Proben würde höchstwahrscheinlich ein Problem mit dem Färbungsprotokoll. Jedoch können auch andere Variablen wie die Lebensfähigkeit der Zellen oder inaktiv Reagenzien auch Schuld.
Abbildung 1. Darstellung des Ficoll-Gradienten Beitrag Spin Nachweis der Stellung der PBMCs.
Abbildung 2. IFN γ-Produktion durch natürliche Killer T-Zellen. Die Flussdiagramme wurden durch Gating auf CD56 + CD3 + γδ- Zellen (Minimum von 5.600 Ereignisse) erhalten. IFNy Produktion ist in der HIV nachweisbar (-) Probe mit stimuliertP. falciparum infizierte rote Blutzellen. Dieses Zytokin-Antwort ist nicht mehr offensichtlich im Zusammenhang mit einer chronischen HIV-Infektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Unser Protokoll wurde entwickelt, um HIV-Malaria-Koinfektion meisten realistisch studieren in vitro optimiert. Zunächst werden frische menschliche Erythrozyten und Serum für die Malaria-Parasiten Kultur erforderlich. Dies ist entscheidend, um eine gesunde Population von Malaria-Parasiten zu erhalten. Parasite Lysaten kann nicht für Live-Parasiten substituiert sein, wie Zytokin-Produktion viel schneller und intensiver bei der Verwendung von Live-P. falciparum infizierten RBC (PfRBC) 17,18. Zusätzlich Aktivierung von Zelltypen, wie NK-Zellen, erfordert insgesamt PfRBCs und nicht effizient mit Parasiten Lysaten umgeht. Dies kann aufgrund der Notwendigkeit für einen direkten Kontakt zwischen dem PfRBC und Leukozyten sein oder kann aufgrund der instabilen Natur des Parasiten-abgeleiteten Liganden, die mit Zelloberflächenrezeptoren 18 zu interagieren. Malaria PfRBC Kulturen muss auch gut synchronisiert werden (Protokoll 4) vor dem Experiment. Synchronisiert PfRBCs Verbesserung der Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten. Obwohl dieses Protokolls deSchreiber die Verwendung Trophozoitenstadium PfRBC für die Co-Kultur, kann sie leicht für die Untersuchung der Ringstufe PfRBC modifiziert werden.
Menschlichen Leukozyten künstlich mit HIV angesteckt werden, und das Verfahren wurde in Studien von Malaria-HIV-Koinfektion Forschungs 20 verwendet. Allerdings bedeutet dies nicht Modell die Immundysregulation, die an chronischer HIV-Infektion führt. In diesem Co-Kultursystem verwenden wir PBMCs von menschlichen Teilnehmern, die chronisch mit HIV-1 infiziert sind, isoliert. Wenn die Teilnehmer für eine Studie erforderlich ist, ist es wichtig, sorgfältig wählen Sie diese Bevölkerung. Ein- und Ausschlusskriterien sind entscheidend für minimale Variabilität und höchste Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Unsere Kriterien waren eine klare Definition der chronischen HIV-Infektion (> 1 Jahr HIV-infizierten, mit CD4 + T-Zellzahl Rückgang von> 50 Zellen / mm 3 / Jahr) und den Ausschluss von jedermann mit einer gleichzeitigen Infektion. Dies gewährleistet, dass die erzielten Ergebnisse könnten so zurückgeführt werdenLely auf die Wirkung der chronischen HIV-Infektion, und nicht einer anderen Infektion. Darüber hinaus, da wir in der angeborenen Immunantwort interessiert, um Malaria ausgeschlossen wurden wir Spender, früheren Malaria-Infektion hatten.
HIV-infizierten Kontrollen werden für jedes HIV (+) Donor verwendet, an jedem Abtastzeitpunkt, die für die Datennormierung ermöglichen. Es sollte versucht werden, die Kontrollen an ihren jeweiligen HIV (+) Spender für mindestens Alter entsprechen vorzugsweise aber auch Sex (wenn auch in unserer früheren Studie 12 haben wir nicht einen signifikanten Unterschied in Zell-Untergruppen oder Zytokin-Antworten zwischen weiblichen und männlichen beobachten HIV- nicht infizierten Teilnehmer). Wenn Interessenten Probenahme geplant Beibehaltung der gleichen HIV-infizierten Kontroll für jeden Abtastzeitpunkt von Vorteil ist. Antworten aus Experiment variieren experimentierfreudig aufgrund mehrerer Faktoren, einschließlich der Gesundheit der PfRBCs, ihrem Grad der Synchronisation, Parasitämie Pegel und Reifegrad der PfRBCs und Hämatokritwert. Sorgfaltwerden müssen, um so viele von diesen im Einklang zwischen den Experimenten zu halten. Normalisieren auf einen HIV-infizierten Kontroll ermöglicht eine gewisse Rechnungslegung für diese Variablen.
Mit frischen Zellen, ist von größter Bedeutung, um künstliche Ergebnisse zu vermeiden. Einfrieren und Auftauen Proben können einen erheblichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen 21,22 sind, Zytokinproduktion 23-26 und Zelloberflächen-Phänotyp-Marker 27.
Wenn Monozyten von besonderem Interesse sind, ist es wichtig, daß das Glas nicht im Protokoll verwendet. Monozyten an Glas und vielen anderen Kunststoffen 28 einzuhalten. Wir verwenden Polypropylen Plastikpipetten, Pipetten und Röhrchen überall auf Monozyten Haftung und endgültige Entfernung aus unserer Studie Zellpopulationen zu minimieren.
Beim Einrichten des Durchflusscytometrieassay kann jede Kombination von Antikörpern in Abhängigkeit von den Zellen von Interesse verwendet werden. Wir waren besonders daran interessiert, IFNy und TNF-Produktionvon NK-Zellen, NKT-Zellen und γδ T-Zellen. Diese definierte unserer Antikörper-Panel. Wenn unter Verwendung einer anderen Kombination, ist es jedoch wichtig, die Mengen an Antikörper zu jedem Modul zu optimieren. Dies ist entscheidend, um fehlerhafte Daten zu vermeiden. Auch, um die Variabilität zu vermeiden und die Gültigkeit, RGV sind erforderlich, um Hintergrund Cytokinspiegel für jede Bedingung (RBC, PfRBC, mittlere und PMA / Ionomycin) und Teilnehmerbevölkerung zu bewerten (HIV (-) und HIV (+), Abbildung 2). Messen in vitro intrazellulären Zytokin-Produktion führt in der Regel hohen Hintergrundwerten, vor allem, wenn Zellen vor dem Färben kultiviert worden. Da die Kulturbedingungen beeinflussen den Hintergrundwerten, entsprechende RGV sicherzustellen Kenntnis der Hintergrundpegel für jede Probe. Unsere Versorgung der Zellen war begrenzt, deshalb entwarfen wir unsere RGV alle Oberfläche Flecken, aber keine intrazellulären Flecken enthalten. Dies erlaubt es, gezielt Vergleich Cytokin Hintergrundniveaus zu den vielen verschiedenen Zelltypen untersucht.Wir liefen eine einzige Fleck pro Experiment für jede der Oberflächenmarker auf ihre Hintergrundwerte zu bestätigen.
Das beschriebene Protokoll ist ein vielseitiger, die verwendet werden können, um Reaktionen innerhalb von Stunden oder Tagen in Abhängigkeit von den interessierenden Zellen zu untersuchen. Für optimale PfRBC induzierte Cytokin-Produktion aus angeborenen Lymphozyten, maßen wir Durchflusszytometrie Ausgangs nach 2 oder 3 Tagen. Beim Blick auf Monozyten, sind früheren Zeitpunkten (1 oder 2 Tage) empfohlen. Dieses System ermöglicht mehrere Zelltypen und Zellreaktionen durch Strömungs unterscheiden Zytometrie sekretorischen Antworten in Zellüberständen gemessen werden und Expressionsprofile in extrahierte RNA beurteilen. Ferner ist die Verwendung von Antikörpern an spezifische Rezeptoren zu blockieren oder zu neutralisieren, Cytokine können in diesem System weiter zu sezieren Mechanismen verwendet werden. Wir haben erfolgreich IL-18-Rezeptor-Blockade verwendet werden, um IL-18-Rezeptor in PfRBC-induzierte IFN-Antworten 12 implizieren. Dieses System stellt einen realistischenic Verfahren, mit dem eine Reihe von angeborenen Immunantworten gegen Malaria in Zusammenhang mit HIV-Infektion zu bewerten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
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