Introduction
Co-infektion, infektion med flera samtidiga infektioner, är normen i naturliga miljöer. Co-infektion kan ha en stor inverkan på sjukdoms patologi och på den kliniska hanteringen av varje infektion. I samband med samtidig infektion, vaccin och läkemedel effekt, liksom diagnostiska tester kan påverkas negativt (ses över 1). Men trots dess betydelse, anser majoriteten av patogener forskning endast enstaka infektioner.
Malaria och HIV-1 (HIV) är ledande orsakerna till sjuklighet och dödlighet globalt. Områden av malaria och hiv endemicitet dela en bred geografisk överlappning, sätta miljontals människor som riskerar att co-infektion och därmed löper risk för allvarligare klinisk sjukdom 2-10. De två sjukdomar samverkar negativt. Hos HIV-infekterade individer, högre HIV virusbelastningen och tillfälliga minskningar i CD4 + T-celltal kan ses under en malariainfektion, medanmalariaparasiten bördor och risk för klinisk och svår malaria är högre i co-infekterade individer 2,3,5,7,8,10. De mekanismer genom vilka HIV ökar malaria svårighetsgrad är inte helt klarlagda och garanterar ytterligare utredning.
Här beskriver vi en metod som malaria och hiv-infektion kan studeras in vitro. Specifikt, ger denna metod för undersökning av malariaspecifika immunsvar i samband med HIV-infektion. Vår protokoll beskriver en mångsidig samodlingssystemet användning nyisolerade perifera mononukleära blodceller (PBMC) isolerades från kroniskt HIV-infekterade donatorer och in vitro odlade P. falciparum parasite erytrocyter (PfRBC). Effekterna av hiv antiretroviral behandling på dessa svar kan också undersökas med hjälp av prospektivt insamlade PBMC från HIV (+) donatorer före och efter behandling.
Vi har använt detta system för att undersöka effekterna av HIV-infektionpå malariaspecifika medfödda immunsvar 11,12, och kunde fastställa att malariaspecifika IFNy och TNF-svar försämras i NK-celler, NKT-celler, γδ T-celler från HIV (+) donatorer före och efter HIV antiretroviral behandling . Dessutom kunde vi använda detta system för att fastställa att monocytiska funktioner är också nedsatt hos HIV (+) givare, men återhämta sig efter HIV antiretroviral behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll kräver rekrytering av donatorer för serum och RBC som skall användas för parasit kultur och HIV (+) och oinfekterade donatorer för PBMC isolering. Institutional Review Boards måste godkänna alla studier och alla givare måste ge informerat samtycke före blodprovstagning.
VARNING: Arbeta med blodprov mänskliga och mänskliga malariaparasiter kräver säkerhetsåtgärder. Använd alltid laboratorierock, handskar och arbeta i en nivå 2 biosäkerhet skåp. I händelse av oavsiktlig perkutan exponering för humana malaria, rapporterar till hälsa och säkerhet för profylaktisk behandling. Ytterligare säkerhetsinformation Man bör också inrättas för att arbeta med HIV (+) blod. Använd en back stänger labbrock. Dubbel handske (top handske bör latex). Utför all hantering i en nivå 2 biosäkerhet skåp. Använd inte glas eller vassa föremål. Använd inte aspirator. Placera alla förorenade föremål i virox lösning eller blekmedel i minst 1 timme före kassering.Tvätta alla ytor med virox och UV under 1 timme efter användning. Observera att varje institution har sina egna specifika biosäkerhet regler som måste följas. Rapportera alla oavsiktliga exponeringar mot HIV-infekterat blod till hälsa och säkerhet för utvärdering och bedömning av eventuella postexpositionsprofylax.
Obs: Olika stammar av P. falciparum malaria parasiter finns. ITG användes för dessa experiment, men olika stammar kan användas. Utmärkta instruktioner om frysning och upptining Plasmodium falciparum parasiter finns på MR4 webbplats 13.
1. Göra RPMI-A för Malariaparasite kultur
- Gör RPMI-0 genom att blanda 950 ml DDH 2 O, 1 paket RPMI-1640 pulver, 6 g HEPES, 2 g natriumbikarbonat, och 1,35 mg hypoxantin.
- Tina värmeinaktiverat humant serum från två olika donatorer. AB donatorer är bäst men vilken kan användas om parasiter odlas i O-typröda blodkroppar (RBC). Vänd rören att blanda. Om serum innehåller partiklar eller är tjock centrifugering vid 2000 varv per minut och sedan filtrera vätskedelen med hjälp av en 0,45 um filterenhet.
- Med användning av en 0,2 | am filterenhet filter 180 ml RPMI-0, 20 ml av humant serum (10 ml från varje donator), och 0,5 ml 10 mg / ml gentamycin.
Obs: Humant serum kan täppa till filtret så mer än en filterenhet kan krävas. - Märk mediet flaska med RPMI-A, datum, och källan till serumet. I kylskåp fram till användning. RPMI-A kan vända grumlig när kylda. Detta är normalt, men ökande grumlighet är ett tecken på förorening.
Obs: Parasit tillväxten kan variera i olika donatorserum. Det är en bra idé att testa alla mänskliga serumsatser för god parasit tillväxt före användning.
2. Förbereda humana röda blodceller för Parasite kultur
Obs: Blodgivare ska vara typ O.
- Samla 7-10 ml blod i syra-CIThastighets dextros (ACD) rör. Skriv givarens ID och insamlingsdatum på etiketten.
- Butiks blod vid 4 ° C tills det behövs. Använd blod för parasitkulturer inom en månad.
- Torka av röret med 70% etanol. Försiktigt bort proppen och kasta. Överför blod till en 15 ml-rör. Spin för 3 min vid 1000 X g. Ta plasma genom aspiration.
- Suspendera RBC med lika stor volym av varmt RPMI-0. Snurra under 5 min vid 1000 x g. Avlägsna lättcellskoncentratet genom aspiration, resuspendera i 5 ml RPMI-0 och upprepa tvätten ytterligare 2 gånger.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt tillräckligt RPMI-A för framställning av en blandning som är 50% RBC i volym.
- Förvara vid 4 ° C tills det behövs.
3. Upprätthållande Parasit kulturer
- Pre-varm RPMI-A till 37 ° C
- Placera upptinade parasiter (se MR4 protokoll för upptining procedur) i en T25-kolv med 5 ml RPMI-A och 75 ul tvättade humana RBC för en hematokrit av ~ 3%.Obs: Hematokrit mäter volymen av RBC jämfört med den totala volymen. För att beräkna hematokrit mäta volymen av packade RBC till den totala volymen av medium plus RBC. Antag att de upptinade parasiter kommer att bidra 75 il RBC. Genom att tillsätta 150 pl av RBC-lager (vilket motsvarar tillsats av 75 ul packade RBC) till kolven finns det totalt 150 pl av RBC in i 5 ml medium, vilket är lika med en hematokrit av 3% (150 pl / 5000 il x 100% = 3%).
- Gas kolven under 30 sekunder med parasit gasblandning (1% O 2, 3% CO2, balans N 2). Försegla och placera kolven breda sidan nedåt i en 37 ° C inkubator för att möjliggöra för den största ytan för gasutbyte.
- Om du vill ändra på medellång och kontrollera parasitemi (behöver göras dagligen), försiktigt flytta kolven för att inte störa RBC skiktet. Med hjälp av en steril unplugged pasteurpipett dra av odlingsmediet utan att störa blodlagret.
- För att kontrollera parasitemia, ta ett prov 10 pl från blodlagret, placera den på en glasplatta och med hjälp av en andra glasskiva skapa en tunn blodfilm. Låt bilden för att torka.
- Placera 4 ml färskt RPMI-A i kolven, blanda försiktigt, gas under 30 sekunder, och placera i inkubator vid 37 ° C.
- Fläck sliden med hjälp av Hema3 färgningskit enligt tillverkarens protokoll.
- För optimal färgning, dopp glider i fixeringslösningen under 10 sekunder, lösning I för 10 sekunder, och lösningen II för 30 sek. Skölj i vatten och låt objektglasen torka.
- Beräkna parasitemi genom räkning av antalet PfRBC (målat mörkt lila) som funktion av totala antalet RBC (målat rosa). Räkna totalt 300 celler för att säkerställa exakthet.
- När parasiter har nått en parasitemia av 5%, expandera kulturen i en T75 kolv, med hjälp av 40 ml av RPMI-A, och 500 pl av RBC.
4. Parasite Synkronisering
Obs: Dagen före than experimentera, synkronisera parasiten kulturen genom behandling med alanin. Bara ring scen parasiter och oinfekterade RBC kommer att överleva denna behandling. Alanin synkronisering kommer att ge dig en ren trophozoite kultur nästa dag som kan användas i co-kultur experiment. Se till att börja med en parasit kultur som innehåller en majoritet av ringscen parasiter.
- Bered alanin lösning genom blandning av 8,01 g av alanin (300 mM) och 0,365 g tris (10 mM) i 300 ml DDH 2 O. Bring pH till 7,4. Filtrera sterilisera med användning av en 0,2 | am filterenhet.
- Pre-varm alanin lösning till 37 ° C
- Spinn ner parasiten kultur (5 min x 1000 xg), och ta bort medium.
- Resuspendera pelleten i 19 volymer alanin-lösning (1 ml packade RBC till 19 ml alanin lösning). Inkubera i 15 min vid RT.
- Spin 5 min x 1000 X g. Sug ut supernatant. Tvätta i RPMI-0 en gång. Aspirera supernatanten och återsuspendera i RPMI-A och justera hematokrit till ~ 3%. Gsom kolv och återgå till 37 ° C
Obs! För co-kultur experiment behövs en minimi parasitemi av 5% trofozoiter, med 10% parasitemi anses optimal.
5. Parasit och RBC Förberedelse för Co-kultur experiment
- Använd ett förhållande av 3 PfRBC per PBMC i samarbete kultur experiment för att framkalla ett inflammatoriskt svar. För att beräkna den totala PfRBC, kvantifiera parasitemi genom att göra en tunn blodutstryk såsom beskrivs i 3,5, och hematokrit genom att räkna antalet RBC per ml av parasit kultur med användning av en hemocytometer.
Antal PfRBC =% parasitemi x totala RBC / ml x ml kultur. Till exempel: 10 ml odling vid 10 x 10 6 RBC / ml och 10% parasitemi är lika med 0,1 x 10 6 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC. - Snurra parasit kultur för 5 min vid 1000 x g (RT). Aspirera medium och resuspendera vid 6 x 10 6 PfRBC per ml i RPMI-S + (500 ml RPMI-1640 kompletterat med L-glutamin och HEPES, 10% värmeinaktiverat FBS, 1,5 ml gentamicin, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, 5 ml 10 mM MEM icke-essentiella aminosyror, 5 ml 5 mM β-merkaptoetanol).
- Ta kontroll blod (oinfekterade RBC från samma donator som används för att upprätthålla parasitkulturen), beräkna hematokrit och återsuspendera i RPMI-S + vid samma antal RBC per ml som parasiten kulturen.
6. Isolering av humana perifera mononukleära blodceller (PBMC)
- Samla venöst blod natriumheparin rör (grön topp) från både en kronisk HIV (+) givare och en HIV (-) kontroll. Använd inte EDTA som en antikoagulant som EDTA: s kalcium kelatbildande verkan påverkar cellfunktion. I genomsnitt förväntar mellan 5-10 x 10 6 PBMC per 10 ml blod. För ett typiskt experiment samla 30 ml blod från varje donator. Blodvolymen kommer att behöva justeras i enlighet med de experimentella kraven.
- Så snart som möjligt och definitivt inom en timme av blod samlas,ta bort blodet från rören och plats i en plast 50 ml rör. Monocyter i synnerhet kommer att aktiveras och hålla sig till glas, så det är viktigt att om insamling av glas blodprovsrör används celler avlägsnas så fort som möjligt.
- Spin blodet vid 1000 x g under 15 min och samla plasma (detta kan användas för andra studier om så krävs - om inte detta steg kan hoppas över). Späd blodet i lika stor volym av kall DPBS.
- Placera 15 ml RT Ficoll i ett 50 ml rör. Långsamt, med användning av en steril plast överföringspipett skikt blod / DPBS lösning över Ficoll utan någon blandning. Högst 25 ml blod / DPBS lösning kan skiktas över varje 15 ml Ficoll.
- Snurra gradienter för 30 min vid RT vid 600 X g. Kontrollera att inställningen "ingen broms" är på.
- När cellerna har spunnits, leta efter gränsytan mellan de två faserna. Det är där PBMC är. Med användning av en steril plast överföringspipett samla PBMC från gränssnittet (seFigur 1). Minimera förorening av RBC.
- Placera uppsamlade cellerna i 50 ml rör, med högst 20 ml per rör. Överrör upp till 50 ml med steril kalla DPBS.
- Snurra cellerna under 10 min vid 4 ° C vid 300 x g.
- Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 5 ml sterilt kalla DPBS och slå alla celler från samma givare i ett rör. Top upp till 50 ml med sterilt DPBS, och upprepa tvätten steg 2 gånger.
- Resuspendera cellerna i 10 ml RPMI-S + medium.
- Ta en 20 ul alikvot och blanda med 20 il trypanblått. Pipett 10 ul i en hemocytometer och räkna levande celler (celler som inte har tagit upp den blå färgen - alla blå celler är döda). Använd en hemocytometer för att beräkna antalet celler i en lösning enligt följande.
Obs: En hemocytometer har ett rutnät av angivna mått, så att det område som omfattas av linjerna är känd.- Se till hemocytometer är ren. Placera täckglas över counting-området. Belastning 10 pl cellösningen genom att placera pipettspetsen i en av de V-formade brunnar. Arean under täckglaset fylls genom kapillärverkan.
- Placera den laddade hemocytometer under ett mikroskop. Hela nätet av haemocytometer innehåller 9 rutor av 1 mm 2 vardera. Räkna alla celler inom varje stort torg. Om för många celler är närvarande, späd lösningen vidare och omräkning.
- Beräkna cellkoncentration enligt följande: Totala celler / ml = (totala antalet celler räknade / # av kvadrater) x utspädningsfaktor x 10000 celler / ml, t ex (500 celler / 5 kvadrater) x spädningsfaktor av 20 x 10000 celler / ml = 20 x 10 6 celler totalt.
- Justera medium till en slutlig koncentration av 10 x 10 6 per ml (RPMI-S + medium).
7. Malaria / HIV-infektion Kultur
- Plansch 100 pl av isolerade PBMC och 400 fil RPMI-S + mediet till en 24-brunnsplatta (1 x 10 6 PBMC per brunn). Se tillatt brunnar sätts upp i tre exemplar: 3 brunnar för oinfekterade RBC, 3 brunnar med PfRBC, 3 brunnar med medium och 3 brunnar med PMA / Ionomycin. Detta är både för HIV (+) och HIV (-) prov.
- För PfRBC brunnar, placera 3 x 10 6 PfRBC i varje brunn (500 jil parasit kultur upprättats i 5.2).
- För oinfekterade RBC brunnar, placera 500 ul av oinfekterade RBC kultur framställts i 5.3 i varje brunn.
- För medel brunnar, placera 500 | il RPMI-S + medium i var och en av brunnarna.
- För PMA / Ionomycin brunnar, förbereda PMA / Ionomycin-lösning (2,5 pg / ml, 250 pg / ml). Placera 500 pl av denna lösning i varje brunn.
Anmärkning: Som potenta stimulatorer av T-cell cytokinsekretion, PMA och Ionomycin används som en positiv kontroll för att säkerställa celler är funktionella. - Placera plattan vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Tillval: Använd överskott celler för fenotypisk analys med flödescytometri eller butik i ett RNEn stabilisering lösning för framtida mRNA expressionsanalys.
8. Påvisande av Malariaimmunsvaret
Obs: Utför sam-kulturexperiment under så länge som 4 dagar. Inget medium ändring krävs under denna tid. Den optimala tidpunkten kommer att bero på celltypen av intresse och frågan ställdes. En inkubationstid på 12-48 timmar är optimal för monocytiska svar på PfRBCs, medan lymfocytsvar var bäst observerades vid 72-96 timmar. Tidpunkterna måste optimeras baserat på den experimentella fråga. Kortare perioder (2-4 h) kan användas om växelverkan mellan intakt PfRBC och PBMC är av intresse.
- Centrifuge plattan vid 300 xg under 3 min till pelletceller. Samla 700 il odlingssupernatant från varje brunn.
- Spin supernatanten vid 1000 xg under 5 min till fri från skräp.
- Alikvot rensas supernatanten efter behov, etikett, och frys vid under -20 ° C tills analys av utsöndrade faktorer är att vara performed.
- Analysera cytokin / kemokina svar genom ELISA eller pärla array (följ tillverkarens föreslagna protokoll).
- Samla cellerna som återstår i plattan in i en RNA-stabiliserande lösning och använda för mRNA-expressionsanalys med kvantitativ realtids-PCR 14-16.
9. intracellulär flödescytometri för cellspecifik Ccytokine svar via PBMC samodlade med P. falciparum Infekterade RBC
Notera: Såsom nämnts ovan längden hos samodling kommer att bero på celltypen av intresse. Behövs om intresserad av monocytiska svar på PfRBC en kortare inkubationstid. Tiderna kommer att vara längre för medfödda lymfocytsvar γδ T-celler, NK-celler, NKT-celler), och ännu längre för CD4 och CD8 T-celler. Optimering kommer att krävas.
- 6-8 h före analys tillsätt 1 pl av 1,000x Brefeldin A till samtliga brunnar. Återgå plattan till 37 ° C inkubator. Efter 6-8 h incubation, plats plattan på is under 15 minuter.
- Ta bort celler från brunnarna med kraftig pipettering och placera dem i märkta microcentifuge rör. Skrapning kan krävas för att avlägsna monocyter.
- Spin celler för 5 min vid 1000 x g. Avlägsna supernatanter. Resuspendera cellerna i 500 | il flödescytometri buffert (1x DPBS, 2% värmeinaktiverat FBS, 0,02% natriumazid).
- Divide celler upp så att varje prov har: ett rör för fullständig antikroppsfärgning (240 ul), och ett rör för fluorescerande minus en (FMO) kontrollantikropp färgning (240 pl). Pool en liten mängd av varje prov (20 ul) för ofärgade flödescytometri kontroll (detta kommer att användas för att inrätta flödescytometern).
- Spin celler för 5 min vid 500 x g. Avlägsna supernatanter.
- Inkubera cellerna med okonjugerat anti-humant CD16 / CD32 (5 pg / ml) i 50 pl flödescytometri buffert under 15 min vid 4 ° C för att blockera Fc-receptorer.
- Tillsätt 1 ml av flödescytometri buffert till varje rör. Spin ceLLS för 5 min vid 500 x g. Avlägsna supernatanter.
- Resuspendera cellerna i 50 fil flödescytometri buffert med en i förväg titrerad koncentrationen av fluoroforen-konjugerade antikroppar mot önskade cellytemarkörer. Förblandning tillräckligt antikroppslösningen för alla prover som ska färgas. Inkubera cellerna vid 4 ° C under 20 minuter. Skydda från light.Note: Belopp för varje antikropp måste optimeras. Vi rutinmässigt färgas för CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Titrerade volymer för dessa antikroppar visas i tabell 1.
- Tillsätt 1 ml av flödescytometri buffert till varje rör. Spin celler för 5 min vid 500 x g. Avlägsna supernatanter.
- Tillsätt 100 ni cytofix / cytoperm lösning till varje rör. Inkubera cellerna under 20 min vid 4 ° C Skyddas från ljus.
- Tillsätt 1 ml av perm / tvättbuffert (tillhandahålls som 10x koncentrat - späd till 1x med hjälp av DDH 2 O) till varje rör. Spin celler för 5 min vid 500 x g. Avlägsna supernatanter.
- Tillsätt 100 μl perm / tvättbuffert till FMO kontroll antikroppsfärgningsrören och blanda för att resuspendera cellerna.
- Tillsätt 100 pl av perm / tvättbuffert med en förtitrerad koncentration av fluoroforen-konjugerade antikroppar mot önskade intracellulära markörer (dvs., cytokiner / kemokiner) till fullantikroppsfärgningstuber.
Obs: Mängden av varje antikropp måste optimeras. Vi rutinmässigt färgas med anti-TNF och anti-IFNy-antikroppar. Titrerade volymer för dessa antikroppar visas i tabell 1. - Inkubera alla rör för 30 min vid 4 ° C Skyddas från ljus.
- Tillsätt 1 ml Perm / tvättbuffert till varje rör. Spin celler för 5 min vid 500 x g. Avlägsna supernatanter.
- Resuspendera cellerna i 300 ^ flödescytometri buffert med 1% paraformaldehyd. Låt sitta i minst 15 minuter för att neutralisera HIV.
- Förbered enda antikropp färgade prover med kompensations pärlor, som ska användas för ersättning ställa upp på flödescytometern. Den typ av ersättningpärlor kommer att bero på de antikroppar som används (dvs.., anti-mus Ig, anti-rått / hamster-Ig). Vortex pärlor. Tillsätt en droppe av pärlor per antikropp. Lägg lika mängder av antikropp som användes för färgning. Tillsätt 200 ul av flödescytometri buffert. Dessa är nu klar att användas. Det finns inget behov att tvätta pärlorna.
- Förvärva prover på en flödescytometer så snart som möjligt och inom 24 timmar för bästa resultat. Tandem färgämnen är känsliga för dissociation med förvaring så vi rekommenderar omedelbar förvärv om det är möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diagrammen visar nivåerna av IFNy-produktion från NKT-celler (Figur 2), med användning av CD56 + CD3 + γδ- grindar för att erhålla den NKT-celler populationen (data ej visade). Cellerna odlades under 72 h före färgning. När färgas, 100.000 CD3 + celler förvärvades på flödescytometern för att få tillräckligt stora populationer av NK, NKT och γδ celler (celler av intresse). Minst 5.600 NKT-celler visas på varje graf. TNF-produktion erhålles på samma sätt (data ej visade). Kurvorna visar tydligt att IFNy-produktion är lägre i celler från HIV (+) individer jämfört med HIV (-) individer som utsätts för PfRBC.
Flödescytometrianalys är mycket subjektiv. Det är därför viktigt att ha alla lämpliga åtgärder för varje experiment (se figur 2). Bakgrundsnivåerna beräknas med hjälp av FMO prover, som gör det möjligt för en sann återgivning av cytokin färgning.Celler stimulerade med PMA / Ionomycin användes som en positiv kontroll (data ej visade). PMA och Ionomycin är starka stimulatorer av T-cell-cytokinproduktion. Brist på IFNy-produktion i dessa prover skulle sannolikt indikera ett problem med färgningsprotokollet. Emellertid kan andra variabler såsom cellviabilitet eller inaktiva reagens också vara fel.
Figur 1. Avbildning av Ficoll-gradient inlägget spinn visar positionen av PBMC.
Figur 2. IFN γ produktion av naturliga mördar T-celler. Flödesscheman erhölls genom grind på CD56 + CD3 + γδ- celler (minst 5.600 händelser). IFNy-produktion är detekterbar i HIV (-) prov stimulerades medP. falciparum infekterade röda blodkroppar. Detta cytokinrespons är inte längre uppenbart i samband med en kronisk HIV-infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår protokoll har optimerats för de flesta realistiskt studera HIV-malaria samtidig infektion in vitro. Först färska humana RBC och serum krävs för malariaparasit kultur. Detta är avgörande för att få en frisk befolkning av malariaparasiter. Parasit lysat kan inte ersätta levande parasiter som cytokinproduktion är mycket snabbare och intensivare när man använder levande P. falciparum infekterade RBC (PfRBC) 17,18. Dessutom aktivering av celltyper som NK-celler, kräver hela PfRBCs, och fungerar inte effektivt med parasit lysat. Detta kan bero på behovet av direkt kontakt mellan PfRBC och leukocyt- eller kan vara på grund av den instabila naturen hos parasithärrörande ligander som interagerar med receptorer på cellytan 18. Malaria PfRBC kulturer måste också vara väl synkroniserad (protokoll 4) innan experimentet. Synkroniserade PfRBCs förbättra reproducerbarheten av de experimentella data. Även om detta protokoll describes användningen av trofozoit steget PfRBC för samodling, kan den lätt modifieras för studier av ringsteget PfRBC.
Humana leukocyter kan artificiellt smittats av hiv, och denna metod har använts i studier av malaria-hivinfektion forskning 20. Men detta inte modellen immun dysregulation som är resultatet av kronisk HIV-infektion. I denna samodlingssystem använder vi PBMC isolerade från mänskliga deltagare som kroniskt infekterade med HIV-1. När det krävs deltagare för en undersökning, är det viktigt att noga välja denna patientgrupp. Integration och uteslutningskriterier är viktigt att se till minsta variation och maximal reproducerbarhet. Våra kriterier ingår en tydlig definition av kronisk HIV-infektion (HIV-infekterade för> 1 år, med CD4 + T-celler minskning med> 50 celler / mm3 / år) och uteslutandet av någon med en samtidig infektion. Detta säkerställde att de uppnådda resultaten kan tillskrivas sålely effekten av kronisk HIV-infektion, och inte en annan infektion. Dessutom, eftersom vi var intresserade av medfödda immunsvar till malaria vi utesluta givare som hade tidigare malariainfektion.
HIV-oinfekterade kontroller används också för varje HIV (+) donator, vid varje samplingstidpunkt, för att möjliggöra för data normalisering. Ett försök bör göras för att matcha kontroller för att deras respektive HIV (+) donator under åtminstone ålder men företrädesvis också sex (även i vår tidigare studie 12 vi inte märker en betydande skillnad i cellgrupper eller cytokinsvar mellan kvinnliga och manliga HIV- oinfekterade deltagare). Om blivande provtagning planeras bibehålla samma HIV-uninfected kontroll för varje provtagningstidpunkt är fördelaktigt. Svaren kan variera från experiment till experiment på grund av flera faktorer, inklusive hälsa PfRBCs, graden av synkronisering, parasitemi nivå och mognadsgrad av PfRBCs och hematokrit nivå. Skötselmåste vidtas för att hålla så många av dessa konsekvent mellan experiment. Normalisera till en HIV-oinfekterade kontroll medger en viss redovisning för dessa variabler.
Med färska celler är av största vikt att undvika konstgjorda resultat. Nedfrysning och upptining prover kan ha en betydande inverkan på cellviabilitet 21,22, cytokinproduktion 23-26 och cellytan fenotypmarkörer 27.
Om monocyter är av särskilt intresse, är det viktigt att glaset inte används under protokollet. Monocyter följa glas och många andra plaster 28. Vi använder polypropenplast pipetter, överföringspipetter, och rör hela att minimera monocytvidhäftning och ultimata borttagning från våra studiecellpopulationer.
När man sätter upp flödescytometri-analysen, kan vilken som helst kombination av antikroppar användas beroende på cellerna av intresse. Vi var särskilt intresserade av IFNy och TNF-produktionfrån NK-celler, NKT-celler och γδ T-celler. Detta definierat vår antikroppspanel. Men om man använder en annan kombination, är det viktigt att optimera mängderna av antikropp för varje panel. Detta är avgörande för att undvika felaktiga uppgifter. Dessutom, för att undvika variabilitet och säkerställa giltighet är FMO krävs för att bedöma bakgrunds cytokinnivåer för varje tillstånd (RBC, PfRBC, medium och PMA / Ionomycin) och deltagare befolkning (HIV (-) och HIV (+), Figur 2). Mätning in vitro intracellulär cytokinproduktion oftast resulterar i höga bakgrundsnivåerna, särskilt när celler har odlats före färgning. Eftersom odlingsbetingelser påverka bakgrundsnivåerna, lämpliga ramar av ömsesidiga åtaganden att säkerställa kunskap om bakgrundsnivån för varje prov. Vår leverans av celler var begränsad, därför har vi utformat våra FMO att innehålla alla fläckar men inga intracellulära fläckar. Detta möjliggör för den specifika jämförelse av cytokin bakgrundsnivåer på alla de olika celltyperna som studerats.Vi sprang också en enda fläck per experiment för varje ytmarkörer att bekräfta deras bakgrundsnivåer.
Det protokoll som beskrivits är en mångsidig en, som kan användas för att undersöka svar inom timmar eller dagar beroende på cellerna av intresse. För optimal PfRBC-inducerad cytokinproduktion från medfödda lymfocyter, mätte vi flödescytometri utgång efter 2 eller 3 dagar. När man tittar på monocyter, är tidigare tidpunkter (1 eller 2 dagar) rekommenderas. Detta system gör det möjligt för flera celltyper och cellsvar att särskilja genom flödescytometri till sekretoriska svar mätas i cellsupernatanter, och uttrycksprofiler som skall bedömas i extraherat RNA. Vidare kan användning av antikroppar blockerar specifika receptorer eller neutralisera cytokiner kan användas i detta system för att ytterligare dissekera mekanismer. Vi har framgångsrikt använt IL-18-receptorblockad för att blanda in IL-18-receptorn i PfRBC-inducerad IFNy-svar 12. Detta system innebär en realistic metod för att bedöma ett antal medfödda immunsvar till malaria i samband med HIV-infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
