Introduction
שיתוף זיהום, דלקת עם זיהומים במקביל מרובים, היא הנורמה בסביבות טבעיות. שיתוף זיהום יכול להיות השפעה גדולה על פתולוגיה מחלה ועל הניהול הקליני של כל זיהום. בהקשר של שיתוף זיהום, חיסון ויעילות תרופה, כמו גם בדיקות אבחון, יכול להיות מושפע באופן שלילי (בדיקה ב 1). עם זאת, למרות חשיבותה, רוב מחקר הפתוגן רואה זיהומים רק אחת.
מלריה וHIV-1 (HIV) מובילות גורמים לתחלואה ותמותה בעולם. תחומי מלריה והאיידס endemicity לשתף חפיפה גיאוגרפית רחבה, לשים מיליוני אנשים בסיכון לשיתוף זיהום וכתוצאה מכך בסיכון למחלות קליניות חמורות יותר 2 - 10. שתי המחלות אינטראקציה שלילית. באנשים שנדבקו ב- HIV, עומס נגיפי HIV גבוה וירידות זמניות בספירת CD4 + T-cell ניתן לראות בהידבקות במלריה, ואילונטל טפיל מלריה וסיכון של מלריה קלינית וחמורה הם גבוהים יותר אצל אנשים שנדבקו בשיתוף 2,3,5,7,8,10. המנגנונים שבאמצעותם HIV מגביר את חומרת מלריה אינם מובנים במלואם ולהצדיק חקירה נוספת.
כאן אנו מתארים שיטה שבאמצעותה מלריה ושיתוף זיהום HIV ניתן ללמוד במבחנה. באופן ספציפי, שיטה זו מאפשרת לבחינת תגובות חיסוני מלריה ספציפית בהקשר של זיהום HIV. הפרוטוקול שלנו מתאר מערכת תכליתית שיתוף תרבות שימוש בתאי הדם היקפיים mononuclear מבודדים טרי (PBMCs) מבודדת מכרוני תורמים נגועים ב- HIV ובמבחנת פ התרבותי falciparum parasitized אריתרוציטים (PfRBC). ההשפעה של טיפול התרופתי HIV על תגובות אלה יכול להיות גם נבחנה באמצעות PBMCs מכאן ולהבא שנאסף מאיידס (+) מראש תורמים ולאחר טיפול.
יש לנו בשימוש במערכת זו כדי לחקור את ההשפעה של זיהום HIVבתגובה חיסונית מולדת מלריה ספציפית 11,12, והצליחה לקבוע כי תגובות IFNγ וTNF מלריה ספציפית לקויים בתאי NK, תאי NKT, γδ תאי T מאיידס (+) מראש תורמים ופוסט-HIV טיפול תרופתי . בנוסף, היינו יכול להשתמש במערכת זו כדי לקבוע כי פונקציות monocytic גם לקויים באיידס (+) תורמים, אבל להתאושש לאחר HIV טיפול תרופתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה דורש הגיוס של תורמים לסרום וRBC לשמש לתרבות טפילה, ותורמי HIV (+) ונגועים לבידוד PBMC. לוחות סקירה מוסדיים לאשר את כל המחקרים וכל התורמים חייבים לתת הסכמה מדעת לפני לקיחת דם.
זהירות: עבודה עם דגימות דם אדם וטפילי מלריה אנושיות מחייבת אמצעי זהירות. תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, ועבודה בממשלת בטיחות ביולוגית ברמת 2. במקרה של חשיפת מלעורית המקרית למלריה אנושית, לדווח לבריאות ובטיחות לטיפול מניעתי. גם תמורה נוספות בטיחות יש לשים במקום לעבודה עם HIV בדם (+). ללבוש מעיל מעבדה סגירה בחזרה. כפפה זוגית (כפפה עליונה צריכה להיות לטקס). לבצע את כל טיפול בקבינט בטיחות ביולוגית ברמת 2. אל תשתמשו בזכוכית או חפצים חדים. אל תשתמש בaspirator. מניחים את כל הפריטים המזוהמים בפתרון virox או אקונומיקה למינימום של שעה 1 לפני השלכת.לשטוף את כל המשטחים עם virox וUV במשך שעה 1 לאחר שימוש. שים לב שכל מוסד יהיה תקנותיהם הספציפיות הבטיחות הביולוגית שצריכות להיות אחרי. דווח על כל החשיפות מקריות לדם נגוע באיידס לבריאות ובטיחות להערכה והתחשבות של טיפול מונע לאחר חשיפה אפשרית.
הערה: זנים שונים של פ טפילי המלריה falciparum קיימים. ITG שימש לניסויים אלה, אך ניתן להשתמש בו זנים שונים. הוראות מצוינת על טפילי הקפאה וההפשרה falciparum Plasmodium זמינות באתר האינטרנט של MR4 13.
1. ביצוע RPMI-למלריה טפיל תרבות
- הפוך RPMI-0 על ידי ערבוב 950 מיליליטר של DDH 2 O, 1 שקית של האבקה RPMI-1640, 6 גרם של HEPES, 2 גרם של סודיום ביקרבונט, ו1.35 מ"ג של hypoxanthine.
- חום הפשרה מומת בסרום אנושי משני תורמים שונים. תורמי AB הם אבל כל יכולים לשמש הטובים ביותר אם טפילים גדלים בסוג Oתאי דם אדומים (RBC). היפוך צינורות לערבב. אם בסרום מכיל חומר חלקיקים או הוא ספין עבה ב2,000 סל"ד ואז לסנן חלק נוזלי באמצעות יחידת 0.45 מיקרומטר מסנן.
- שימוש במסנן יחידה 0.2 מיקרומטר מסנן 180 מיליליטר של RPMI-0, 20 מיליליטר של סרום אדם (10 מיליליטר מכל תורם), ושל 0.5 מיליליטר של 10 מ"ג / מיליליטר gentamycin.
הערה: סרום אדם יכול לסתום את המסנן כך ייתכן שתידרש יחידת מסנן אחד או יותר. - תווית הבקבוק הבינוני עם RPMI-, התאריך, והמקור של הסרום. מכניס למקרר עד שנדרש. RPMI-עלול להפוך מעונן כאשר בקירור. זה נורמלי, אבל עננות גוברים היא סימן לזיהום.
הערה: צמיחה טפיל עשויה להשתנות בסרום תורם שונה. זה רעיון טוב כדי לבדוק את כל קבוצות בסרום האנושיות לצמיחת טפיל טובה לפני השימוש.
2. אדם תאי דם האדום מתכוננים לטפיל תרבות
הערה: תורמי דם צריכים להיות סוג א '
- לאסוף 7-10 מיליליטר של דם לחומצה-CITצינורות (ACD) שיעור דקסטרוז. לכתוב קוד זיהוי של התורם ותאריך של אוסף על התווית.
- דם חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד צורך. להשתמש בדם לתרבויות טפיל בתוך 1 חודש.
- נגב את החלק העליון של הצינור עם אתנול 70%. מוציא בזהירות פקק וזורקים. העבר את הדם לתוך צינור 15 מיליליטר. ספין 3 דקות ב 1000 x גרם. הסר פלזמה על ידי שאיפה.
- להשעות RBC עם נפח שווה של RPMI-0 חמים. ספין במשך 5 דקות ב 1000 x גרם. הסר את המעיל באפי על ידי שאיפה, גלול ב 5 מיליליטר של RPMI-0 ולחזור על השטיפה 2 פעמים יותר.
- הסר את supernatant ולהוסיף מספיק RPMI-לייצר תערובת שהוא 50% RBC לפי נפח.
- חנות ב 4 מעלות צלסיוס עד צורך.
3. שמירה על תרבויות טפיל
- RPMI-טרום חם עד 37 מעלות צלסיוס
- הנח טפילים מופשרים (ראה פרוטוקול MR4 להליך הפשרה) לתוך בקבוק T25 עם 5 מיליליטר של RPMI-ו -75 μl של RBC אדם שטף להמטוקריט של ~ 3%.הערה: המטוקריט מודד את הנפח של RBC בהשוואה להיקף כולל. כדי לחשב המטוקריט למדוד את הנפח של RBC הארוז להיקף הכולל של מדיום בתוספת RBC. תניח שהטפילים המופשרים יתרמו 75 μl של RBC. על ידי הוספת 150 μl של מניית RBC (שהוא שווה ערך להוספת 75 μl של RBC הארוז) לבקבוק יש בסך הכל 150 μl של RBC לתוך 5 מיליליטר של מדיום, אשר שווה להמטוקריט של 3% (150 μl / 5000 μl x 100% = 3%).
- גז הבקבוק למשך 30 שניות עם תערובת גז טפיל (1% O 2, 3% CO 2, איזון N 2). לאטום ומניח בצד הרחב הבקבוק למטה בC חממה 37 o שתאפשר לשטח הגדול ביותר לחילוף גזים.
- כדי לשנות את המדיום ולבדוק parasitemia (שצריך לעשות ביום), להעביר בזהירות את הבקבוק כדי לא להפריע את שכבת RBC. בעזרת פיפטה פסטר המנותקת סטרילי לצייר את מדיום התרבות מבלי להפריע את שכבת הדם.
- כדי לבדוק הרשות הפלסטיניתrasitemia, להסיר מדגם 10 μl משיכבת הדם, למקם אותו בשקופית זכוכית ובאמצעות שקופיות זכוכית שנייה ליצור סרט דם דק. לאפשר שקופית להתייבש.
- מקום 4 מיליליטר של RPMI-טרי לתוך הבקבוק, לערבב בעדינות, גז למשך 30 שניות, ומקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס.
- להכתים את השקופיות באמצעות ערכת צביעת Hema3 פי הפרוטוקול של היצרן.
- עבור מכתים אופטימלי, לטבול שקופיות בפתרון הקיבוע במשך 10 שניות, פתרון שבמשך 10 שניות, ופתרון השני למשך 30 שניות. יש לשטוף במים ולהשאיר לייבוש שקופיות.
- לחשב parasitemia על ידי ספירת מספר PfRBC (מוכתם סגול כהה) לעומת המספר הכולל של RBC (ורוד מוכתם). ספירה כוללת של 300 תאים כדי להבטיח דיוק.
- כאשר טפילים הגיעו parasitemia של 5%, להרחיב את התרבות לבקבוק T75, באמצעות 40 מיליליטר של RPMI-, ו -500 μl של RBC.
4. טפיל סנכרון
הערה: ביום שלפני לאהוא להתנסות, לסנכרן את התרבות הטפיל על ידי טיפול עם אלאנין. טפילי שלב טבעת בלבד וRBC נגוע ישרדו את הטיפול הזה. סנכרון אלאנין ייתן לך תרבות trophozoite טהורה למחרת, שניתן להשתמש בניסויי שיתוף התרבות. הקפד להתחיל עם תרבות טפיל המכילה ברוב של טפילי שלב טבעת.
- הכן פתרון אלאנין ידי ערבוב 8.01 גרם של אלאנין (300 מ"מ) ו.365 גרם של טריס (10 מ"מ) ב300 מיליליטר של DDH 2 O. להביא pH 7.4. סנן לעקר באמצעות יחידת 0.2 מיקרומטר מסנן.
- פתרון אלאנין טרום חם עד 37 מעלות צלסיוס
- ספין למטה התרבות הטפיל (5 דק 'x 1,000 XG), ולהסיר בינוני.
- גלולה גלולה ב 19 כרכים של פתרון אלאנין (1 מיליליטר ארוז RBC ל -19 מיליליטר פתרון אלאנין). דגירה במשך 15 דקות ב RT.
- 5 דקות x 1,000 x גרם ספין. לשאוב supernatant. לשטוף בRPMI-0 פעם. לשאוב supernatant והגלול בRPMI-ולהתאים המטוקריט ל~ 3%. Gכבקבוק ותמורה ל -37 מעלות צלסיוס
הערה: בניסויים שיתוף תרבות נחוץ parasitemia מינימום של trophozoites 5%, עם parasitemia 10% נחשב אופטימלי.
5. טפיל וRBC הכנה לניסויים משותף התרבות
- השתמש יחס של 3 PfRBC לPBMC בניסויי שיתוף התרבות לגרום לתגובה דלקתית. כדי לחשב PfRBC הכולל, לכמת parasitemia ידי הפיכת כתם דם דק כמתואר ב3.5, והמטוקריט על ידי ספירת המספר של RBC לכל מ"ל של התרבות טפילה באמצעות hemocytometer.
מספר parasitemia =% PfRBC x מיליליטר x / מיליליטר כולל RBC של התרבות. לדוגמא: 10 מיליליטר של התרבות ב 10 parasitemia x 10 6 RBC / מיליליטר ו -10% הוא שווה 0.1 x 10 6 / מיליליטר x 10 מיליליטר = 10 x 10 6 PfRBC. - ספין התרבות הטפיל במשך 5 דקות XG ב 1000 (RT). בינוני לשאוב, וגלול בשעת 6 x 10 6 PfRBC לכל מיליליטר ב RPMI-S + (500 מיליליטר RPMI-1640 בתוספת L- גלוטמין וHEPES, 10% חוםFBS המומת, 1.5 מיליליטר גנטמיצין, 5 מיליליטר של 100 פירובט נתרן מ"מ, 5 מיליליטר של 10 חומצות אמינו לא חיוניות מ"מ ממ, 5 מיליליטר של 5 מ"מ β-mercaptoethanol).
- קח שליטת דם (RBC נגוע מאותו התורם משמש לשמירה על התרבות הטפיל), לחשב המטוקריט וגלול ב+ RPMI-S באותו המספר של RBC לכל מיליליטר כתרבות הטפיל.
6. בידוד של תאים ההיקפיים אדם הדם mononuclear (PBMC)
- איסוף דם ורידים בצינורות הפרין נתרן (למעלה ירוק) משתי תורם כרוני HIV (+) ו- HIV (-) שליטה. אל תשתמש בEDTA כנוגד קרישה כמו פעולת chelating סידן של EDTA משפיעה על תפקוד תא. בממוצע צופה בין 5-10 x 10 6 PBMC לכל 10 מיליליטר של דם. לניסוי טיפוסי לאסוף 30 מיליליטר של דם מכל תורם. נפח הדם צריך להיות מותאם על פי דרישות ניסוי.
- מהר ככל האפשר ובהחלט תוך שעה של דם נאסף,להסיר את הדם מהצינורות והמקום לתוך צינור פלסטיק 50 מיליליטר. מונוציטים בפרט יופעלו ולהיצמד לזכוכית, ולכן חשוב שתאים אם צינורות איסוף דם זכוכית משמשים יוסרו מהר ככל האפשר.
- ספין הדם XG ב 1000 במשך 15 דקות ולאסוף פלזמה (זה יכול לשמש למחקרים אחרים במידת צורך - אם לא בשלב זה ניתן לדלג). לדלל את הדם בנפח שווה של DPBS הקר.
- מניחים 15 מיליליטר של RT Ficoll לתוך צינור 50 מיליליטר. לאט לאט, בעזרת פיפטה העברה פלסטיק סטרילי, שכבת הפתרון / DPBS דם על Ficoll ללא כל ערבוב. מקסימום של 25 מיליליטר של דם פתרון / DPBS ניתן שכבתי על כל 15 מיליליטר של Ficoll.
- ספין הדרגתיים במשך 30 דקות ב RT ב 600 x גרם. ודא שהגדרת 'לא בלם "היא על.
- ברגע שהתאים הסתחררו, לחפש את הממשק בין שני השלבים. זה המקום שבי PBMC הוא. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק סטרילי לאסוף את PBMC מהממשק (ראהאיור 1). למזער זיהום על ידי RBC.
- הנח תאים שנאספו בצינורות 50 מיליליטר, עם לא יותר מ 20 מיליליטר לכל צינור. צינור עליון עד 50 מיליליטר עם DPBS הקר סטרילי.
- ספין התאים במשך 10 דקות ב C o 4 ב 300 x גרם.
- בטל supernatant, resuspend גלולה בDPBS הקר סטרילי 5 מיליליטר וברכה כל תאים מאותו התורם לצינור אחד. ראש הדף עד 50 מיליליטר עם DPBS סטרילי, וחזור על צעדים לשטוף 2 פעמים יותר.
- תאי Resuspend ב 10 מיליליטר RPMI-S + בינוני.
- להסיר aliquot 20 μl ולערבב עם 20 μl של trypan כחול. פיפטה 10 μl בhaemocytometer ולספור את תאי חיים (תאים שלא לקחו את הצבע הכחול - כל התאים הכחולים מתים). השתמש בhaemocytometer לחשב מספר תאים בפתרון כדלקמן.
הערה: יש haemocytometer רשת של ממדים מוגדרים כך שהאזור המכוסה על ידי הקווים ידוע.- ודא haemocytometer הוא נקי. מניחים את coverslip על countiאזור ng. עומס 10 μl של פתרון תא על ידי הצבת קצה פיפטה לאחת מהבארות בצורת V. השטח מתחת לcoverslip ימלא ידי פעולת נימים.
- מניחים את haemocytometer הטעון תחת מיקרוסקופ. הרשת מלאה בhaemocytometer מכילה 9 ריבועים של 1 מ"מ 2 כל אחד. לספור את כל התאים בתוך כל ריבוע גדול. אם יותר מדי תאים נמצאים, לדלל את הפתרון נוסף וספירה חוזרת.
- חישוב ריכוז תא כדלקמן: סה"כ תאים / מיליליטר = (תאים כולל נספרו / # של ריבועים) x 10,000 תאים / מיליליטר גורם לדילול x, גורם לדוגמא, (500 תאים / 5 ריבועים) x דילול של 20 x 10,000 תאים / מיליליטר = 20 x 10 6 תאים בסך הכל.
- התאם בינוני לריכוז סופי של 10 x 10 6 לכל מיליליטר (RPMI-S + בינוני).
7. מלריה / האיידס Co-זיהום תרבות
- צלחת של PBMCs המבודד 100 μl 400 μl של RPMI-S + בינוני לצלחת 24 גם (1 x 10 6 PBMC לכל היטב). ודאשהבארות להגדיר בשלושה עותקים: 3 בארות לRBC נגוע, 3 בארות עם PfRBC, 3 בארות עם מדיום, ו -3 בארות עם PMA / ionomycin. זה גם ל- HIV (+) ו- HIV (-) מדגם.
- לבארות PfRBC, מקום 3 x 10 6 PfRBC בכל אחת מהבארות (500 μl של התרבות טפילה שהוכן ב5.2).
- לנגועים RBC בארות, מקום 500 μl של תרבות RBC נגוע הערוך 5.3 בכל אחת מהבארות.
- לבארות בינוניות, מקום 500 μl של RPMI-S + בינוני בכל אחת מהבארות.
- לPMA / ionomycin בארות, להכין פתרון PMA / ionomycin (2.5 pg / ml, 250 pg / בהתאמה מ"ל). הנח 500 μl של פתרון זה בכל טוב.
הערה: כגירוי חזק של הפרשת ציטוקינים תא T, PMA וionomycin משמשים כביקורת חיובית כדי להבטיח תאים פונקציונליים. - צלחת מקום ב 37 o C ב5% CO 2 באינקובטור.
- אופציונאלי: להשתמש בתאים עודפים לניתוח פנוטיפי באמצעות cytometry זרימה או חנות בRNפתרון ייצוב לניתוח ביטוי mRNA עתיד.
8. איתור של תגובות חיסוני המלריה
הערה: בצע ניסויי שיתוף תרבות לעוד 4 ימים. אין שינוי בינוני נדרש בתקופה זו. נקודת הזמן האופטימלית תהיה תלויה בסוג התא של עניין ושאל את השאלה. דגירה של 12-48 שעות היא אופטימלית לתגובות monocytic לPfRBCs, ואילו תגובות הלימפוציטים נצפו הכי טובות ב72-96 שעות. נקודות הזמן תצטרך להיות מותאמות המבוססות על השאלה הניסיונית. תקופות קצרות (2-4 שעות) ניתן להשתמש אם אינטראקציה בין PfRBC שלם וPBMCs היא עניין.
- צלחת ספין ב 300 XG במשך 3 דקות לתאי גלולה. לאסוף 700 μl של supernatant תרבות מכל טוב.
- ספין supernatant XG ב 1000 למשך 5 דקות לברורות של כל פסולת.
- Aliquot פינה supernatant לפי צורך, תווית, והקפאה במתחת -20 ° C עד ניתוח של גורמים מופרשים הוא להיות performed.
- לנתח תגובות ציטוקינים / chemokine ידי ELISA או על ידי מערך חרוז (אחרי הפרוטוקולים הציעו היצרן).
- איסוף התאים שנותרו בצלחת לפתרון RNA ייצוב ולנצל לניתוח ביטוי mRNA על ידי בזמן אמת PCR כמו 14-16.
9. תאיים cytometry זרימה לתגובות Ccytokine תא ספציפי באמצעות PBMC שיתוף תרבותי עם פ RBC מאשרום falciparum
הערה: כפי שצוין לעיל באורך של התרבות המשותפת יהיו תלוי בסוג התא של עניין. אם מעוניין בתגובות monocytic לPfRBC תקופת דגירה קצרה יותר יש צורך. פעמים תהיה ארוכות יותר לתגובות הלימפוציטים מולדים γδ תאי T, תאי NK, תאי NKT), ועוד עדיין לתאי CD4 ו CD8 T. אופטימיזציה תידרש.
- 6-8 שעות לפני הניתוח להוסיף 1 μl של 1,000x brefeldin לכל הבארות. להחזיר את הצלחת עד 37 o C חממה. לאחר incub 6-8 שעותני, צלחת מניח על קרח במשך 15 דקות.
- הסרת תאים מהבארות באמצעות pipetting הנמרץ ולמקם אותם לתוך צינורות microcentifuge שכותרת. גירוד עשוי להידרש כדי להסיר מונוציטים.
- תאי ספין במשך 5 דקות ב 1000 x גרם. הסר supernatants. תאים גלולים ב500 μl cytometry זרימת החיץ (1x DPBS, 2% FBS חום מומת, 0.02% אזיד הנתרן).
- תאים עד לחלק כל כך שכל דגימה יש: צינור אחד לצביעה מלאה נוגדן (240 μl), וצינור אחד למכתים נוגדן שליטה אחד מינוס ניאון (FMO) (240 μl). בריכת כמות קטנה של כל דגימה (20 μl) לזרימה בלא כתם cytometry שליטה (זה ישמש בהקמת cytometer הזרימה).
- תאי ספין במשך 5 דקות ב 500 x גרם. הסר supernatants.
- דגירה תאים עם CD16 אנטי אנושי / CD32 (5 מיקרוגרם / מיליליטר) unconjugated ב -50 זרימת μl cytometry חיץ במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלסיוס לחסום קולטני Fc.
- הוסף 1 מיליליטר של cytometry זרימת חיץ לכל צינור. ce ספיןLLS במשך 5 דקות ב 500 x גרם. הסר supernatants.
- תאי Resuspend ב -50 μl של cytometry זרימת חיץ עם ריכוז טיטרציה מראש של נוגדני fluorophore מצומדות לסמנים פני תא רצוי. פתרון מספיק נוגדנים מראש תערובת עבור כל הדגימות להיות מוכתם. דגירה תאים בC o 4 במשך 20 דקות. להגן מlight.Note: הסכום של כל נוגדן יצטרך להיות מותאם. אנחנו באופן שיגרתי להכתים לCD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. כרכי טיטרציה לנוגדנים אלה מוצגים בטבלה 1.
- הוסף 1 מיליליטר של cytometry זרימת חיץ לכל צינור. תאי ספין במשך 5 דקות ב 500 x גרם. הסר supernatants.
- להוסיף לפתרון cytofix / cytoperm 100 μl לכל צינור. דגירה תאים במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלסיוס להגן מפני אור.
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ סלסול / לשטוף (מסופק כ10x להתרכז - לדלל ל1x באמצעות DDH 2 O) על צינור אחד. תאי ספין במשך 5 דקות ב 500 x גרם. הסר supernatants.
- הוספת 100 μl של סלסול / לשטוף חיץ לצינורות מכתים נוגדן שליטת FMO ולערבב לresuspend תאים.
- להוסיף למאגר סלסול / לשטוף 100 μl עם ריכוז טיטרציה מראש של נוגדני fluorophore מצומדות לסמנים רצויים תאיים (כלומר, ציטוקינים / כמוקינים) לצינורות מכתים נוגדן מלאים.
הערה: הסכום של כל נוגדן יצטרך להיות מותאם. אנחנו באופן שיגרתי להכתים עם אנטי TNF ונוגדנים-IFNγ אנטי. כרכי טיטרציה לנוגדנים אלה מוצגים בטבלה 1. - דגירה כל הצינורות במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס להגן מפני אור.
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ פרם / Wash על צינור אחד. תאי ספין במשך 5 דקות ב 500 x גרם. הסר supernatants.
- תאים גלולים ב300 μl cytometry זרימת חיץ עם paraformaldehyde 1%. בואו לשבת למינימום של 15 דקות כדי לנטרל HIV.
- הכן דגימות מוכתמות נוגדן בודד באמצעות חרוזים פיצוי, שישמש לפיצוי שנקבע על cytometer את הזרימה. הסוג של פיצויחרוזים יהיו תלויים בנוגדנים המשמשים (כלומר., אנטי העכבר איג, אנטי-עכברוש / אוגר איג). חרוזים וורטקס. הוסף טיפה אחת של חרוזים לנוגדן. להוסיף כמויות שווה של נוגדן המשמש לצביעה כ. הוסף 200 μl של cytometry זרימת החיץ. אלה הם מוכנים לשימוש. אין צורך לשטוף את החרוזים.
- לרכוש דגימות על cytometer זרימה בהקדם האפשרי ובתוך 24 שעות לתוצאות הטובות ביותר. צבעי טנדם רגישים לניתוק עם אחסון ולכן אנחנו ממליצים רכישה מיידית במידת האפשר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגרפים מציגים את רמות ייצור IFNγ מתאי NKT (איור 2), באמצעות CD56 + CD3 + γδ- שערים כדי להשיג את אוכלוסיית תאי NKT (מידע לא מוצג). התאים היו בתרבית במשך 72 שעות לפני מכתים. ברגע מוכתם, 100,000 תאי CD3 + נרכשו על cytometer הזרימה להשיג מספיק אוכלוסיות גדולות של NK, NKT ותאי γδ (תאים של עניין). מינימום של 5,600 תאי NKT מוצגים בכל גרף. ייצור TNF מתקבל באותו אופן (מידע לא מוצג). הגרפים מראים בבירור כי ייצור IFNγ הוא נמוך יותר בתאים מאיידס (+) בהשוואה לאנשי HIV (-) אנשים שנחשפו לPfRBC.
ניתוח תזרים cytometry הוא מאוד סובייקטיבית. לכן זה חיוני לכל הבקרות המתאימות עבור כל ניסוי (ראה איור 2). רמות רקע מחושבות באמצעות דגימות FMO, המאפשרת לייצוג אמיתי של מכתים ציטוקינים.תאי מגורה עם PMA / ionomycin שמשו כביקורת חיובית (מידע לא מוצג). PMA וionomycin הם גירוי חזק של ייצור ציטוקינים תא T. חוסר ייצור IFNγ בדגימות אלה הייתם ככל הנראה מצביע על בעיה בפרוטוקול מכתים. עם זאת, משתנה אחרים כגון כדאיות תא או חומרים כימיים פעילים יכול להיות גם באשמה.
תיאור איור 1. פוסט שיפוע ספין Ficoll מפגין העמדה של PBMCs.
ייצור 2. IFN γ איור ידי תאי הרוצח הטבעי T. זרימת דיאגרמות התקבלו על ידי gating על CD56 + CD3 + γδ- תאים (מינימום של 5,600 אירועים). ייצור IFNγ ניתן לזהות באיידס (-) המדגם מגורה עםפ falciparum נגוע בתאי דם אדומים. תגובת ציטוקינים זה כבר לא נראה לעין בהקשר של זיהום HIV כרוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול שלנו כבר מותאם כדי ביותר מציאותי ללמוד שיתוף זיהום HIV-מלריה במבחנה. ראשית, RBCs אדם טרי וסרום נדרשים לתרבות טפיל מלריה. זה חיוני כדי להשיג אוכלוסייה בריאה של טפילי מלריה. lysates טפיל לא ניתן להחליף לטפילי חיים כייצור ציטוקינים הוא הרבה יותר מהיר ואינטנסיבי בעת השימוש בפ החי falciparum נגוע RBC (PfRBC) 17,18. בנוסף, הפעלה של סוגי תאים כמו תאי NK, דורשת כל PfRBCs, ולא לעבוד ביעילות עם lysates טפיל. זה יכול להיות בגלל הצורך במגע ישיר בין PfRBC ויקוציט או יכול להיות בגלל האופי לא יציב של ligands נגזר הטפיל כי אינטראקציה עם קולטני תא שטח 18. תרבויות המלריה PfRBC גם חייבת להיות מסונכרנות היטב (פרוטוקול 4) לפני הניסוי. PfRBCs המסונכרן לשפר את שחזור של נתונים הניסיוניים. למרות דה פרוטוקול זהסופרי השימוש בשלב trophozoite PfRBC לתרבות משותפת, זה יכול בקלות להיות שונה למחקר של שלב טבעת PfRBC.
לויקוציטים אדם יכול להיות נגוע באופן מלאכותי עם HIV, ושיטה זו נעשתה שימוש במחקרים של מחקר משותף זיהום המלריה-HIV 20. עם זאת, זה לא מודל חוסר הוויסות החיסונית כתוצאה מהידבקות ב- HIV הכרונית. במערכת שיתוף תרבות זו אנו משתמשים PBMCs מבודד ממשתתפים אנושיים שנגועים כרוני עם HIV-1. כאשר משתתפים נדרשים למחקר, חשוב לבחור אוכלוסייה זו בזהירות. קריטריונים להכללה והדרה הם חיוניים כדי להבטיח שונות מינימליות ושחזור מרבי. הקריטריונים שלנו כללו הגדרה ברורה של זיהום HIV הכרוני (HIV נגוע ל> 1 שנה, עם ירידת ספירת תאי T מסוג CD4 + של> 50 תאים / מ"מ 3 / שנה) וההרחקה של כל אדם עם זיהום במקביל. זה הבטיח כי התוצאות שהתקבלו ניתן לייחס כל כךLely להשפעה של זיהום HIV הכרוני, ולא עוד זיהום. בנוסף, מאז שהיו מעוניינים בתגובות חיסון מולדים למלריה שנכללנו תורמים שהיו זיהום מלריה קודם.
בקרות HIV-נגוע משמשות גם לכל תורם HIV (+), בכל נקודת זמן דגימה, כדי לאפשר לנורמליזציה נתונים. ניסיון צריך להיעשות כדי להתאים בקרות לתורמם בהתאמה HIV (+) לפחות גיל אבל רצוי גם מין (אם כי במחקר קודם שלנו 12 אנחנו לא רואים הבדל משמעותי בתת תא או תגובות ציטוקינים בין נשים וגברים ל- HIV משתתפים נגוע). אם דגימה פוטנציאלי מתוכננת שמירה על שליטת HIV-נגוע זהה עבור כל נקודת זמן דגימה הוא מועיל. תגובות יכולות להשתנות מניסוי לניסוי בשל גורמים רבים, כולל הבריאות של PfRBCs, תוארם של סנכרון, רמת parasitemia ושלב של בשלות של PfRBCs, ורמת המטוקריט. טיפוליש לנקוט כדי לשמור על כמה שיותר עקבי אלה בין ניסויים. נרמול לשליטת HIV-נגוע מאפשר לכמה חשבונאי במשתנים אלה.
שימוש בתאים טריים הוא בעל חשיבות עליונה כדי למנוע תוצאות מלאכותיות. דגימות הקפאה להפשרה יכולה להיות השפעה משמעותית על 21,22 כדאיות תא, ייצור ציטוקינים 23-26 ופנוטיפי פני תא סמני 27.
אם מונוציטים הם בעלי עניין מיוחד, חשובה שהזכוכית אינה משמשת בפרוטוקול. מונוציטים לדבוק זכוכית ופלסטיק רב אחר 28. אנו משתמשים בטפטפות פוליפרופילן פלסטיק, טפטפות העברה, וצינורות לאורך למזער דבקות מונוציטים וההסרה אולטימטיבית מאוכלוסיות תאי מחקר שלנו.
בעת הגדרת cytometry הזרימה assay, כל שילוב של נוגדנים יכול לשמש בהתאם לתאים של עניין. היינו מעוניינים במיוחד בייצור IFNγ וTNFמתאי NK, תאי NKT ותאי T γδ. זה מוגדר בלוח הנוגדן שלנו. עם זאת, אם באמצעות שילוב שונה, חשוב כדי לייעל את הכמויות של נוגדנים לכל לוח. זה חיוני כדי למנוע נתונים שגויים. כמו כן, כדי למנוע השתנות ולהבטיח את התוקף, FMOs נדרש להעריך רמות ציטוקינים רקע לכל מצב (RBC, PfRBC, בינוני, וPMA / ionomycin) ואוכלוסיית משתתף (HIV (-) ו- HIV (+), איור 2). המדידה בייצור ציטוקינים תאיים מבחנה גורמת בדרך כלל לרמות גבוהות רקע, במיוחד כאשר תאים בתרבית כבר לפני מכתים. מאז תנאי התרבות משפיעים על רמות רקע, FMOs המתאים להבטיח ידע של רמת הרקע לכל דגימה. האספקה של תאים שלנו הייתה מוגבלת, ולכן אנחנו נועדו FMOs להכיל את כל כתמי פני השטח אבל אין כתמים תאיים. זה מאפשר להשוואה הספציפית של רמות רקע ציטוקינים בכל סוגי התאים השונים למדו.גם רצנו כתם אחד לכל ניסוי לכל אחד מסמני המשטח לאשר רמות הרקע שלהם.
הפרוטוקול המתואר הוא אחד צדדי, שבו ניתן להשתמש כדי לבחון את תגובות בתוך שעות או ימים, תלויות בתאים של עניין. לייצור ציטוקינים הנגרמים על-PfRBC אופטימלי מימפוציטים מולדים, מדדנו cytometry זרימת הפלט לאחר 2 או 3 ימים. כאשר מסתכלים על מונוציטים, נקודות זמן קודם (1 או 2 ימים) מומלצות. מערכת זו מאפשרת לסוגים שונים של תאים ותגובות תא ללהבחין על ידי cytometry זרימה, תגובות הפרשה להימדד supernatants תא, ופרופילי ביטוי תוערך RNA חילוץ. יתר על כן, שימוש בנוגדנים לחסום קולטנים ספציפיים או לנטרל יכולים להיות מנוצלים ציטוקינים במערכת זו כדי לנתח נוסף מנגנונים. אנחנו השתמשנו בהצלחה IL-18 מצור קולט לסבך IL-18 קולט בתגובות IFNγ המושרה PfRBC 12. מערכת זו מייצגת ריאליסטיתשיטת IC שבו להעריך מספר תגובות חיסון המולדים למלריה בהקשר של הידבקות ב- HIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
- Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
- Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
- Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
- Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
- Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
- Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
- Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
- Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
- Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
- Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102 (2012).
- Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
- Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
- Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
- Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
- Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).
