Wir beschreiben eine Technik zur gleichzeitigen Messung der kraftregulierten Einzelrezeptor-Liganden-Bindungskinetik und Echtzeit-Bildgebung der Kalzium-Signalübertragung in einem einzelnen T-Lymphozyten.
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Methodenartikel
Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermitteln viele zelluläre Funktionen. Bindungskinetik und nachgeschalteten Signal durch diese molekularen Wechselwirkungen ausgelöst werden wahrscheinlich durch die mechanische Umgebung, in der Bindung und Signalisierung erfolgen betroffen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass eine mechanische Kraft kann die Antigen-Erkennung durch regulieren und Auslösen der T-Zellrezeptor (TCR). Dies wurde durch eine neue Technologie, die wir entwickelt und bezeichnet Fluoreszenz Biomembran Kraftsonde (fBFP), die Einzelmolekülkraftspektroskopie mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert möglich. Mit seinem ultra-soft menschlichen roten Blutkörperchen als sensitive Kraftsensor, ein High-Speed-Kamera und Echtzeit-Bildgebung Tracking-Techniken ist von ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm die fBFP und ~ 0,5 ms in Kraft, räumlicher und zeitlicher Auflösung. Mit der fBFP, kann man genau einzigen Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik unter Kraftregelung und gleichzeitig image Bindung ausgelöste intrazelluläre cal messencium Signalisierung auf einer einzelnen lebenden Zellen. Diese neue Technologie kann verwendet werden, um andere Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkung und Signalisierung in anderen Zellen unter mechanischer Regulierung untersuchen.
Einleitung
Zell-zu-Zell und Zell-extrazellulären Matrix (ECM) Haftung wird durch die Bindung zwischen Zelloberflächenrezeptoren, ECM-Proteine und / oder Lipide 1 vermittelt. Bindung erlaubt den Zellen funktionalen Strukturen 1 zu bilden, ebenso wie zu erkennen, zu kommunizieren und zu reagieren, um die Umwelt 1-3. Anders als lösliche Proteine (zB Cytokine und Wachstumsfaktoren), die binden aus einem dreidimensionalen (3D) Fluidphase auf die Zelloberflächenrezeptoren Zelladhäsionsrezeptoren bilden Bindungen mit ihren Liganden über einen schmalen Spalt junctional zu zwei einander gegenüberliegenden Oberflächen, die Molekular beschränk....
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Protokoll
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien und wurde von der menschlichen Forschung Ethik-Kommission des Georgia Institute of Technology genehmigt.
1. Menschen RBCs Isolation, Biotinylierung und Osmolarität Adjustment
Hinweis: Schritt 1.1 sollte von einem ausgebildeten Arzt, wie eine Krankenschwester durchgeführt werden, mit einem Institutional Review Board genehmigten Protokoll.
- Erhalten 8-10 ul (ein Tropfen) Blut von Finger stechen und fügen Sie 1 ml der Carbonat / Bicarbonat-Puffer (Tabelle 1 und 2). Vorsichtig vortexen oder einer Pipette die Mischung und Zentrifuge ....
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Ergebnisse
Die BFP Technik wurde von der Evans Labor 1995 17 voran. Diese picoforce Werkzeug wurde ausgiebig auf Wechselwirkungen von Proteinen auf Oberflächen immobilisiert zu messen, um so zweidimensionale Kinetik von Adhäsionsmolekülen zu analysieren, um die Interaktion mit ihren Liganden 16,19,20 verwendet, 30, um das Molekular Elastizität 21,29 zu messen und zu bestimmen, Protein Konformationsänderungen 21. Für eine fBFP, ein zusätzlicher Satz von Epifluoreszenz bezogene Einrichtung.......
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Diskussion
Eine erfolgreiche fBFP Experiment bringt einige kritische Überlegungen. Erstens, für die Kraftberechnung zu zuverlässig sein, die Mikropipette, die RBC und die Sonde Perle sollte so nah wie möglich koaxial ausgerichtet werden. Die Projektion der RBC in der Pipette über eine Sonde Pipetten Durchmesser sein, so dass die Reibung zwischen dem RBC und dem Pipetten vernachlässigbar ist. Für eine typische menschliche RBC ist die optimale Pipetten Durchmesser von 2,0-2,4 um, die eine beste Anpassung der Gleichung 1 17,30
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Forschung im Zusammenhang mit dieser Arbeit und die Entwicklung der fBFP-Technologie im Zhu-Labor wurden durch NIH-Zuschüsse AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 und TW008753 unterstützt. Wir danken Evan Evans für die Erfindung dieses befähigenden experimentellen Werkzeugs und den Mitgliedern des Evans-Labors, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong und Ken Halvorsen, für ihre Hilfe beim Aufbau des BFP. Wir danken auch den anderen Mitgliedern des Zhu-Labors, Fang Kong, Chenghao Ge und Kaitao Li, für ihre Hilfe bei der Entwicklung der Instrumente.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 & Bull; H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphatpuffer Zubereitung |
| Anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphatpufferpräparation |
| Natriumcarbonat (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Karbonat/Bikarbonat-Pufferpräparat |
| Natriumbikarbonat (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Karbonat/Bikarbonat Präparation Puffer |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% Pufferpräparation |
| Kaliumchlorid (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% Pufferpräparation |
| Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% Pufferpräparation |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5%-Puffervorbereitung |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead-Funktionalisierung |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | Erythrozyten-Biotinylierung |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | Erythrozyten-Osmolaritätseinstellung |
| Ammoniumhydroxid (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glasperle Silanisierung |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glasperlensilanisierung |
| 30% Wasserstoffperoxid (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glasperlensilanisierung |
| Essigsäure (glazial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glasperlensilanisierung |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Funktionalisierung von Glasperlen |
| Borosilikatglas | Distrilab Particle Technology | 9002 | Funktionalisierung von Glasperlen |
| Streptavidin− Maleimid | Sigma-Aldrich | S9415 | Funktionalisierung von Glasperlen |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligandenfunktionalisierung |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intrazelluläre Calciumfluoreszenzfarbstoffbeladung |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intrazelluläre Calciumfluoreszenzfarbstoffbeladung |
| Quantibrite PE-Kügelchen | BD Biosciences | 340495 | Dichtequantifizierung |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Dichtequantifizierung |
| Kapillarrohr 0,7-1,0 mm x 30 Zoll | Kimble Chase | 46485-1 | Mikropipette zur Herstellung von |
| Flammen/Braunen Mikropipetten Abzieher | Sutter Instrument | P-97 | Mikropipette zur Herstellung |
| von Pipetten Microforce | Narishige | MF-900 | Mikropipette zur Herstellung |
| Mineralöl | Fisher Scientific | BP2629-1 | Kammerbaugruppe |
| Mikroskop Deckglas | Fisher Scientific | 12-544-G | Kammerbaugruppe |
| Mikroinjektor | World Precision Instruments | MF34G-5 | Kammerbaugruppe |
| 1 ml Spritze | BD | 309602-Kammer-Montage | |
| Mikropipettenhalter | Narishige | HI-7 | Kammer-Montage |
| Eigenentwickelte mechanische Teile und Adapter, Herstellung von CNC-Bearbeitung. | Biophysik-Instrument | Alle Teile werden gemäß den CAD-Entwürfen angepasst. | BFP-System |
| Mikroskop (TiE invers) | Nikon | MEA53100 | BFP System |
| Objektiv CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP System |
| Kamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP System |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP System |
| Manueller Submikron-Sondenkopf mit hochauflösender Fernbedienung | Karl Süss | PH400 | BFP-System |
| Antivibrationstisch (5' x 3') | TMC | 77049089 | BFP-System |
| 3D-manueller Translationstisch | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D-CAD-Software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP-System |
| LabVIEW-Software | National Instruments | Version 2009 | BFP-System, BFP-Programm |
| 3D-Piezo-Translationstisch | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP-System Linearer |
| Piezo-Accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP-System |
| Mikromanager-Software | Version 1.4 | fBFP-System, Fluoreszenz Bildgebungsprogramm | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrie | fBFP-System | |
| Dual Cam Emissionsfilter (T565LPXR) | Photometrie | 77054725 | fBFP-System |
| Fluoreszenzkamera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP-System |
| Paraffinfolie aus Kunststoff (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | Flaschenversiegelung |
| Karbonat/ Bicarbonat-Puffer (pH 8,5) | 8,4 g/L Natriumcarbonat (Na2CO3), 10,6 g/l Natriumbikarbonat (NaHCO3) | ||
| Phosphatpuffer (pH 6,5-6,8) | 27,6 g/l NaPhosphat monobasisch (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. Zweibasisches Naphosphat (Na2HPO4) | ||
| N2-5% Puffer (pH 7,2) | 20,77 g/l Kaliumchlorid (KCl), 2,38 g/l Natriumchlorid (NaCl), 0,13 g/l monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4), 0,71 g/L anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4), 9,70 g/L Saccharose |
Referenzen
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
