Humane microRNAs translozieren von Wirts-Erythrozyten zu Plasmodium falciparum-Parasiten. Im Folgenden werden die Techniken beschrieben, mit denen synthetische microRNAs in Erythrozyten des Wirts transfiziert und alle RNAs aus P. falciparum isoliert werden. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Polysomen in P. falciparum beschrieben, um die ribosomale Belegung und das translationale Potenzial von Parasitentranskripten zu bestimmen.
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Methodenartikel
Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die genetische Variation für die Sichelzell Allel verantwortlich (HBS) ermöglicht Erythrozyten auf eine Infektion durch den Malaria-Parasiten, P. wider falciparum. Die molekulare Grundlage dieses Widerstands, von dem bekannt ist multifaktoriell, bleibt unvollständig verstanden. Jüngste Studien festgestellt, dass die unterschiedliche Expression von Erythrozyten microRNAs, einmal in Malaria-Parasiten transloziert, wirken sich sowohl auf die Genregulation und Parasitenwachstum. Diese miRNAs wurden später gezeigt, um mRNA-Translation durch Bildung einer chimären RNA-Transkript über 5 'RNA-Fusion mit diskreten Teilmengen von Parasiten mRNAs hemmen. Hierbei sind die Techniken, die verwendet wurden, um die funktionelle Rolle und putative Mechanismus zugrunde liegende Erythrozyten mikroRNAs an der Genregulation und Translations Potential von P. studieren falciparum, einschließlich der Transfektion von modifizierten synthetischen mikroRNAs in Wirts Erythrozyten, werden detailliert beschrieben. Schließlich wird eine Polysomen-Gradientenverfahren verwendet, um das Ausmaß zu bestimmen translation dieser Transkripte. Gemeinsam dürfen diese Techniken uns zu zeigen, dass die fehlregulierte Ebenen der Erythrozyten microRNAs tragen zur Zell intrinsische Malaria Widerstand der Sichel-Erythrozyten.
Einleitung
Malaria, durch apicomplexan Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht, ist die häufigste menschliche parasitäre Erkrankung, weltweit zu infizieren rund 200 Millionen Menschen jedes Jahr und verursacht etwa 600.000 Todesfälle 1. Von den fünf Plasmodium-Arten, die Menschen infizieren, die relevant für die menschliche Krankheit sind P. falciparum und P. vivax, die aufgrund ihrer weit verbreiteten Distributionen und Potenzial für schwere Malaria Komplikationen. Der Lebenszyklus des Malaria-Parasiten-Infektion erfordert beider Mücken und Menschen. Wenn eine infizierte Mückenstiche einen Menschen, die Parasiten reisen durch den Blutstrom in die Leber, wo eine erste Runde der Replikation erfolgt. Nach Merozoiten Bruch von der Host-Hepatozyten, infizieren sie in der Nähe von roten Blutzellen, die Einleitung entweder asexuell oder sexueller Replikation. Die asexuelle Phase der Replikation, die 48 Stunden in P. dauert falciparum ist der Schwerpunkt dieser Studie, da es sowohl die Quelle der meisten malArie Symptome und ist leicht in vitro rekapituliert.
Während eine Reihe von öffentlichen Gesundheitsinitiativen, einschließlich der Verbesserung der Anti-Malaria-Therapien haben etwas reduziert die Belastung durch Malaria weltweit, die anhaltende Entstehung von arzneimittelresistenten Parasiten stellt ein Problem für Malaria-Kontrolle Anstrengungen. Ein Bereich, der neue Therapieansätze vorschlagen kann, ist die Studie darüber, wie verschiedene genetische Varianten Resistenz gegen Malaria. In malariaendemischen Gebieten, eine Vielzahl von Erythrozyten-Polymorphismen sind durchaus üblich 2,3. Diese Mutationen, mit Sichelzell wobei vielleicht das bekannteste, sind oft mit erheblichen Resistenz gegen den Ausbruch der symptomatischen Malariainfektion 4 verbunden. Die zugrunde liegenden Mechanismen, durch die sie verursachen Erythrozyten an Malaria-Infektion zu widerstehen sind unvollständig verstanden. Parasitierten Erythrozyten mit Hämoglobin-Mutationen sind, gelten verstärkte Phagozytose durch verbesserte zelluläre Steifigkeit und Dehydrierung, diemit verringerten Invasion von P. zugeordnet falciparum 5. HBC Allel betrifft auch Protein-Expression auf der Erythrozytenoberfläche und mit dem Umbau des Zytoskeletts, ferner Hemmung Parasitenentwicklung 6,7. Schließlich P. falciparum wächst schlecht in homozygoter Sichel (HBSS) Erythrozyten 8,9 in vitro, was darauf hindeutet, intrinsische erythrozytären Faktoren Malariaresistenz. Doch während all dieser Mechanismen scheinen eine Rolle zu spielen, sie nicht vollständig erklären die Mechanismen hinter Sichelzelle Resistenz gegen Malaria.
Ein möglicher Satz von Erythrozyten-Faktoren, die schlecht verstanden, bleiben die großen Pool von miRNA vorhanden innerhalb von reifen Erythrozyten. MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, 19-25 nt in der Größe, die Übersetzung und / oder Stabilität der Ziel-mRNAs durch Basenpaarung in der 3'-UTR zu vermitteln. Sie haben bei der Steuerung der Immunantwort von Säugetieren in Verbindung gebracht worden, einschließlich der Unterdrückung of die Virusreplikation 10 und gezeigt wurden, um Resistenz gegen Viren in Pflanzen Sie haben auch gezeigt, dass mehrere Erythrozyten-Prozesse, einschließlich Erythropoese 11,12 und Eisenstoffwechsel 13 regulieren. Frühere Studien identifiziert eine reiche und vielfältige Bevölkerung von Erythrozyten-miRNAs, deren Expression dramatisch in HBSS verändert Erythrozyten 14,15. Da reifen Erythrozyten mangelt aktive Transkription und Translation, bleibt die funktionelle Bedeutung dieser Erythrozyten miRNAs unklar. Als wesentliche Stoffaustausch zwischen der Wirtszelle und P. auftritt falciparum während der intraerythrozytären Entwicklungszyklus (IDC) 16, wurde spekuliert, dass die veränderte miRNA Profil innerhalb HbS Erythrozyten direkt mit zell intrinsische Malaria Festigkeit beizutragen.
Diese Studien schließlich zur Entwicklung einer Pipeline führte zu isolieren, zu identifizieren und funktionell untersuchen die Rolle des menschlichen miRNA innerhalb der malaria Parasiten P. falciparum, die ergab, dass diejenigen Host / menschlichen miRNAs letztendlich kovalent Sicherung und dann translational verdrängen Parasiten mRNA-Transkripte 17. Dies war ein Beispiel für den ersten Quer Spezies chimäre Transkripte Transspleiß gebildet und impliziert, dass dieser miRNA-mRNA Fusion könnte in anderen Spezies, einschließlich anderer Parasiten auftreten werden. Alle trypanosome mRNAs Transspleißprodukten mit einer Splice-Leader (SL), um die Trennung der polycistronische Transkripte 18 regulieren. Da P. falciparum fehlt Orthologe für Dicer / Ago 19,20 ist es möglich, dass Erythrozyten-miRNAs entführen ähnliche SL Maschinen in P. falciparum in Zielgenen zu integrieren. Jüngste Studien in P. falciparum haben in der Tat zeigte die Anwesenheit von 5'-Spleißstelle Leader-Sequenzen 21. Diese Studie beschreibt die Verfahren, die zur Entdeckung der menschlichen Parasit miRNA-mRNA Fusionstranskripte geführt, die sowohl transkriptomischen und Übersettionalen Regeltechnik. Die allgemeinen Ziele dieser Methoden sind, um die Auswirkungen von kleinen RNAs in der Genregulation Phänotypen und Übersetzungs Potential von P. untersuchen falciparum Transkripte.
Die anfängliche Identifizierung von Menschenparasit chimären Transkripten geltend gemachten Benutzung RNA Analysetechniken, wie beispielsweise Echtzeit-PCR, Transkriptom-Sequenzierung und EST-Bibliothek zu erfassen, die sowohl insgesamt und kleinen RNAs, anstatt mit Hilfe von Techniken, die nur vereinzelt kleine RNAs enthalten. Isolieren aller RNA zusammen in einem großen Pool, anstatt separat, erlaubte die Identifizierung beider transloziert menschlichen kleine RNAs im Parasiten sowie das Vorhandensein dieser kleinen RNA-Sequenzen als Teil einer größeren Sequenz. Dies erforderte dann eine Analyse der Übersetzungszustand dieser Fusions mRNAs, die funktionellen Konsequenzen dieser Fusionen bestimmen.
Während umfangreiche Bemühungen auf Charakterisierung des Parasiten Genom eind Transkriptom haben zum Verständnis der Biologie des Parasiten 22-25 hinzugefügt wird, wird weit weniger über die Translationsregulation der mRNA Transkriptom über den Lebenszyklus von P. bekannt falciparum 26. Diese begrenzte Verständnis des Parasiten Proteom hat sowohl Verständnis des Parasiten der Biologie und die Fähigkeit, neue Ziele für die nächste Generation von Anti-Malaria-Therapeutika identifizieren behindert. Diese Lücke im Verständnis der Zellbiologie des Parasiten wurde vor allem aufgrund der Mangel an geeigneten Techniken beibehalten, um Translationsregulation in P. untersuchen falciparum. Ein aktuelles Papier beschrieben die Verwendung von ribosomalen Footprinting von P. falciparum, die globale Übersetzungsstatus 21 zu bestimmen. Eine gut etablierte Messtranslations Potential von Transkripten ist die Anzahl der von Polysomen-Profiling bestimmt zugeordnet Ribosomen. Jedoch, wenn diese Technik auf P. angewendet falciparum </ em>, ist es nicht in der Lage, die meisten Polysomen erholen und fängt vorwiegend monosomes. In jüngerer Zeit haben mehrere Gruppen 27,28 P. optimiert falciparum Polysom Techniken durch Lyse der Erythrozyten und Parasiten gleichzeitig, um die Polysomen zu bewahren und zu charakterisieren, die ribosomale Belegung und translationalen Potenzial dieser Malaria-Parasiten während ihrer asexuelle Entwicklung in Wirts roten Zellen 28.
Zusammen zeigen diese Verfahren, dass die beobachtete Fusion von menschlichen miRNA und Parasiten mRNAs moduliert Parasitenprotein Übersetzung dieser Fusions mRNAs, die unter Verwendung von zuvor beschriebenen Verfahren 27 gezeigt wurde, und ist eine wichtige Determinante der Malaria Widerstand HbAS und HbSS Erythrozyten 17. Diese Methoden sinnvoll in einem System suchen zu identifizieren und funktionell zu erforschen RNA-Splicing Ereignisse sein, ob diese Fusion RNAs sind in P. falciparum oder andere eukaryotische Systeme.
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Protokoll
1: Isolierung von kleinen RNAs, die von P. falciparum Während des IDC
- Erhalten Malariaparasiten in asexuellen Kultur 29.
HINWEIS: Die erforderliche Kulturgröße wird von der gewünschten Anwendung variieren; jedoch eine 10 ml Kultur bei 3-5% Parasitämie und 5% Hämatokrit bietet ausreichend RNA für Echtzeit-PCR (RT-PCR). Die Technik wurde ursprünglich für asynchrone Kulturen optimiert, aber wenn bestimmten Zeitpunkten während des Infektionszyklus gewünscht werden, können Ringstadium-Parasiten von Sorbit Synchronisierung nicht später als 10-12 Stunden nach der Invasion synchronisiert werden. Synchronisierung nach Ablauf eines Zyklus (ca. 48 h) 29 wiederholt werden. - Pool infizierten Zellen zusammen (ca. 5 x 10 9 RBCs bei 3-5% Parasitämie) und füllen kaltem PBS an die Spitze des Rohres und Zentrifugieren bei 800 xg für 5 min ohne Bremse zu Pellet der roten Blutkörperchen.
- Nach der Zentrifugation, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit Hilfe eines Ansaugpipette, befestigtauf ein Vakuum, da die Erythrozyten-Pellet ist leicht zu entfernen. Nochmals mit kaltem 1x PBS Waschen des Pellets.
- Resuspendieren Zellpellet in kaltem 0,15% Saponin (in 1x PBS) und auf Eis für 30 min.
- Centrifuge Zellen bei 1.500 × g für 12 min bei 4 ° C, zu entfernen Überstand (die dunkel in der Farbe rot sein wird) und Pellet in kaltem PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
ANMERKUNG: Um sicherzustellen, dass die vorliegenden mikroRNAs waren reflektierend mikroRNAs innerhalb Parasiten und nicht erythrozytären Kontamination ist eine Anzahl von Parasiten Isolationsbedingungen wurden getestet: 1) Saponin Lyse, 2) Saponin Lyse mit RNaseA Behandlung der Wirtszelle miRNAs und 3 kombiniert ) Methyl-beta-Cyclodextrin-Behandlung, um die Parasiten aus der Wirts Erythrozyten zu entfernen. Alle Behandlungen ergaben ähnliche Ergebnisse. - Lyse der isolierte Parasiten Pellet mit den empfohlenen 600 & mgr; l Lysepuffer. Dieses Volumen Lysepuffer genügt Kulturen bis zu ~ 30 ml von 2% Hämatokrit und 5% Parasitämie.
HINWEIS: Für größere Parasiten Kulturen, kann dieses Volumen erhöht werden. Es ist wichtig, um eine vollständige Lyse der Parasitenpellet durch gründliches Vortexen für mindestens 1 min zu gewährleisten. Auch zur Vereinfachung der Extraktion, die lysierten Proben können in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. - Mit 60 & mgr; l oder 1/10 Volumen Lysepuffer in Schritt 6 verwendet, Homogenat Additiv (2 M Natriumacetat, pH 4).
- Lassen Proben auf Eis für 10 min.
- Mit 600 & mgr; l oder ein Volumen gleich der Menge Lysepuffer in Schritt 6 zu jeder Probe und Vortex für 1 min zugegeben saurer Phenol choloroform.
- Trennen der wässrigen und organischen Phasen durch Zentrifugation der Proben bei 10000 × g für 5 min. Diese Drehung ist länger als die durch den Bausatz vorgeschlagen, um sicherzustellen, dass alle Hämoglobin / Hämozoins ist in der organischen Phase.
- Sammeln Sie die obere (wässrige) Schicht und überträgt es in ein frisches Röhrchen. Wiederholen Sie die Schritte 9 und 10, wenn die wässrige Phase ist weiß oder (wahrscheinlicher) Braun in der Farbe, die pro schlägttein Verschmutzung.
- Bestimmen das Volumen des resultierenden Überstands mit einer Pipette und fügen 1,25 Volumina 100% Ethanol (~ 800 & mgr; l) und durch Umschütteln 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen 5 mal.
- Passieren jede Probe durch ein bereitgestellt RNA-bindende Filterpatrone (von denen mehrere verschiedene im Handel erhältlich sind) entweder durch Zentrifugation bei 14.000 × g für 1 min oder durch Verwendung einer Vakuumkammer.
- Waschen Sie die Filterpatrone mit 700 ul der miRNA-Waschpuffer 1 unter Verwendung einer Mikrozentrifuge, Spinning bei 14.000 × g für 1 min.
- Zweimal durch Zentrifugieren bei 14.000 · g für jeweils 1 min Waschen Sie die Filterpatrone mit 500 ul Waschpuffer 2/3.
- Eluieren RNA mit 100 ul DEPC-Wasser, das auf 95 ºC vorgewärmt wurde, in zwei Wäschen von 50 & mgr; l, Zentrifugieren bei 14.000 xg für jeweils 1 min. Messung der Konzentration von RNA durch UV-Absorption bei 260 nm.
HINWEIS: Ein RNA-Gel (entweder TBE-Harnstoff-Acrylamid oder denaturierenden Formaldehyd-Agarose-Gel) kann be verwendet, um die Größenverteilung der isolierten RNAs beurteilen.
HINWEIS: Diese RNA ist für die Analyse von Mikroarray, RNA-Sequenzierung, Northern Blot und Ribonuklease Protection Assay.
2: Quantifizierung von kleinen RNAs, die von P. falciparum Während des IDC
- Bestimmen Sie die Konzentration der einzelnen Proben in Schritt 1 getrennt mit UV-Spektrophotometrie bei 260 nm.
- Erzeugen Echtzeit-PCR-Primer für den gewünschten RNA-Spezies. Für miRNA allein haben wir vorgefertigte miRNA qPCR-Assays, während für mRNAs oder Fusions miRNA-mRNA wir entwickelt Primer für SYBR grün. Für die Fusions RNAs, der Vorwärtsprimer war der miRNA-Sequenz selbst (miR-451: AAACCGTTACCATTACTGAGTT), während die Rückseite war eine genspezifische Primer ~ 100 bp stromabwärts von dem miRNA in der mRNA-Sequenz (PKA-R: ATCGAACATGCTGTGAACAT).
- Machen cDNA aus den RNA-Proben unter Verwendung von entweder einer Haarnadelprimer für miRNAs (verwenden 20-40 ng RNA) alleine oder zufälligen Hexameren für mRNA und / oder miRNA-mRNA Fusions Arten (unter Verwendung von 1 & mgr; g RNA). Mischungs RNA und Primer für 5 min bei 65 ° C, dann auf Raumtemperatur abkühlen. Anschließend fügen reverse Transkriptase-Mix (0.5 & mgr; l reverse Transkriptase, 0,5 ul RNase Inhibitor, 1 ul dNTPs (jeweils 2,5 mM), 4 & mgr; l 5x-Puffer, 2 & mgr; l 0,1 M DTT, 1 & mgr; l H 2 O).
- Führen Proben auf einem Thermocycler zum Aufspüren von entweder SYBR grün oder TaqMan-Sonden. SYBR green quantitative PCR 30 für spezifische Gene wurde als ein 3-Schritt-PCR, 95 ° C für 15 sec, niedrigsten Primerannealing Temperatur minus 5 ° C für 30 s ausgeführt wird, und 68 ° C für 30 Sekunden, für 40 Zyklen unter Verwendung eines Handels SYBR Green Master Mix. miRNA Echtzeit-PCR wurde als eine Zwei-Schritt-PCR für 1 min laufen, 95 ° C für 15 sec und 60 ° C für 40 Zyklen.
- Quantifizierung Assays unter Verwendung des ΔΔCt Verfahren und normalisieren sie entweder gegen Rab GTPase (PF08_0110) oder 18S rRNA 31.
3: Einführungvon kleinen RNAs in Malaria-Erregern
- Pellet 300 ul rote Blutkörperchen pro Transfektion durch Zentrifugation bei 800 × g bei Bremse 1 (250 ul von RBCs etwa 1,5 x 10 9 Zellen, schließlich verwendet werden) in komplettem Malariamittel für 5 min.
- Zweimaliges Waschen der Erythrozyten mit RPMI und resuspendieren in komplettem cytomix (120 mM KCl; 0,15 mM CaCl2; 10 mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4, pH 7,6; 25 mM HEPES, pH 7,6; 2 mM EGTA, pH 7,6; 5 mM MgCl 2; pH mit KOH nach dem Zentrifugieren bei 800 xg für 5 Minuten bei Bremse 1 eingestellt) bei 50% Hämatokrit.
- Übertragen Sie die Zellen bis zu einer 0,2 cm Elektroporationsküvette.
- In 10 ug oder entsprechenden Betrag, der kundenspezifische synthetische Oligonukleotide an die Küvetten und Resuspendieren der Kulturen.
- Stellen Sie die Elektroporator bis 310 V / 950 & mgr; F und liefern einen Impuls zu jeder Küvette.
- Resuspendieren der 300 ul RBC in der Küvette in vorgewärmten komplette malArie Medien und platten sie in 24-Well-Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einem luftdichten Behälter mit Malaria Blutgasgemisch (3% O 2, 5% CO 2).
- Nach 4 Stunden, infizieren transfizierten RBCs mit synchronisierten späte Trophozoiten auf eine ungefähre endgültige Parasitämie von 1%.
- In frisch transfiziert RBCs alle 4-6 Tage, um infizierten Kulturen und bestimmen Sie die% Parasitämie durch FACS mit Jo-Jo-1-Färbung, wie in Abschnitt 4 angegeben.
4: Bestimmung der Erythrozyten-microRNAs Wirkung auf Parasiteninfektion bewerten
- Nehmen Sie 100 ul der resuspendierten Kultur durch Mikropipette und in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zweimaliges Waschen mit 1 ml 1 × PBS und zentrifugieren in einer Tischmikrozentrifuge durch Zentrifugation bei 800 × g für 5 min.
- Pellet in 1 ml 0,025% Glutaraldehyd. Proben, 20 min bei RT.
HINWEIS: Proben können hier für mehrere Wochen bei 4 ° C gelagert werden. Danach pelletieren die infizierte RBCs durch Zentrifugation bei 800 × g für 5 min. Waschen zweimal mit 1 ml 1x PBS. - Pellet in 1 ml 0,015% Saponin. Inkubieren bei 4 ° C für 15 min. Pellet infizierter Erythrozyten durch Zentrifugation bei 800 × g für 5 min. Waschen zweimal mit 1 ml 1x PBS. Repeat.4.3. Die Zellen in 1 ml 1 × PBS, enthaltend 1 ul (1,000x) DNA-Farbstoff.
- Bestimmen den Grad der Parasitämie auf einem Durchflusszytometer, bei 488 nM Anregung und ~ 530 nm (FL-1) Emission.
- Zuerst Gate das Durchflusszytometer basierend auf FSC und SSC auf Erythrozyten zu konzentrieren. Dann messen Sie den Grad der Parasitämie (infizierten Erythrozyten) in der gesperrten RBC durch Fluoreszenz in der FL-1-Kanal.
HINWEIS: später Parasiten sind 10X mehrere fluoreszierende als früher Parasiten und ~ 100X oben nicht infizierten Erythrozyten. Auch das Sammeln bei niedriger Geschwindigkeit neigt dazu, Rauschen zu reduzieren. Schließlich hat diese Herangehensweise an 3 H-Hypoxanthin Einbau und Giemsa sowohl wie zuvor berichtet 13, sowie alle Techniken gav verglichenE ähnliche Ergebnisse.
5: Biotin-Tagging und Elution von miRNA-mRNA Fusion Produkte
- Direkt bestellen kundenspezifische synthetische RNA-Oligonukleotide mit Desthiobiotin (DB), die kovalent an das 5'-Ende verbunden sind.
- Transfektion von nicht-infizierten roten Blutkörperchen mit Desthiobiotin konjugierten (DB-) miRNA und unmodifizierten miRNA (negative Kontrolle), wie in Schritt 3 dargestellt.
- Infizieren transfiziert RBCs mit P. falciparum-Parasiten zu einer Start Parasitämie von 0,5% (Schritt 1.1).
- Auszug Parasiten RNA 4 Tage (96 Stunden) später, wie oben in Schritt 1 beschrieben.
- Inkubieren 10 ug Parasiten RNA mit 50 & mgr; l Streptavidin-Kügelchen gepackt, aufgenommen mittels Mikropipette, und drehen sich auf einem Mikrozentrifugenröhrchen Rotator für 1 Stunde bei 4 ° C.
- Pellet die Kügelchen bei 800 · g für 30 Sekunden und Waschen mit 20 mM KCl und 1 / 1.000 RNase Inhibitor.
- Eluieren RNAs aus den Perlen durch Konkurrenz mit 2 mM Biotin und mit 200 & mgr; l RNA-Capture-Elutionspuffer (20 mM KCl, 1/1000 RNase Inhibitor und 2 mM Biotin) bei 4 ° C über Nacht mit Rotation.
- Bestimmen den Grad der Anreicherung angegeben P. falciparum Transkripte mit SYBR green qRT-PCR und microRNA-Anreicherung (positive Kontrolle) durch TaqMan qPCR wie in Schritt 2 angegeben.
6: Polysomen Trennung an die ribosomale Belegung von P. Bestimmen falciparum
- Platzieren von 5 ml 15% Saccharose-Lösung (400 mM Kaliumacetat, 25 mM Kalium HEPES, pH 7,2, 15 mM Magnesiumacetat, 200 & mgr; M Cycloheximid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase-Inhibitor und 15% Saccharose ) in einem SW41 Ultrazentrifugenröhrchen (14 x 89 mm).
- Unter Verwendung einer 5 ml Spritze mit 5 ml 50% Saccharose-Lösung (400 mM Kaliumacetat, 25 mM Kalium HEPES, pH 7,2, 15 mM Magnesiumacetat, 200 & mgr; M Cycloheximid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase Inhibitor, und 50% Saccharose) unterhalb der 15% Saccharose mit einem langen Stahlnadel, dann entfernen Sie die Nadel.
- Verschließen Sie die Oberseite des Gradienten Rohr mit Parafilm, kippen Sie den Schlauch langsam auf die Seite, in einer stabilen Position gegen Wegrollen, so dass es horizontal auf der Tischplatte. Halten des Rohres auf seiner Seite für mindestens 2 Std. Während der Wartezeit, beginnen Sie mit Schritt 6.5.
- Nach 2 Stunden langsam kippen Sie das Rohr wieder aufrecht und übertragen Sie das Rohr auf Eis, so dass sie für mindestens 15 Minuten vor der Probenbeladung (Schritt 14) zu kühlen.
- Sammeln Sie genug Plasmodium infizierte Blutstadium Kultur 100-500 ug Gesamt-RNA, oder ungefähr 100 ml asynchronen Kultur bei 3-5% Parasitämie zu generieren. Hinzuzufügen 1/10 dem Volumen des Kulturmediums, das 10-fach (2 mM) Cycloheximid (CHX) und bei 37 ° C für 10 min.
- Pellet Kulturen durch Zentrifugation bei 500 g für 7 min mit der Zentrifuge (Bremse 1), dann zweimal waschen mit Raumtemperatur 1x PBS, das 200 uM CHX. Resuspendieren der Parasitenkulturen in 1x PBS, das 200 uM CHX und speichern Sie auf dem Eis.
- Schätzen Sie das Volumen der RBC-Pellet. Hinzufügen Lysepuffer (400 mM Kaliumacetat, 25 mM Kalium HEPES, pH 7,2, 15 mM Magnesiumacetat, 200 & mgr; CHX, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase Inhibitor, 1% (v / v) IGEPAL CA -630, und 0,5% (w / v) DOC) in die RBC-Pellet bis zu einem Endvolumen von 4,25 ml. Inkubieren des Lysats bei 4 ° C für 10 Minuten unter Rotation.
- Transfer des Lysats auf Mikrozentrifugenröhrchen und anschließend zentrifugiert werden die Proben in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g und 4 ° C für 10 min.
- Vorbereitung Saccharosekissen durch Pipettieren von 1,25 ml kaltem 0,5 M Saccharose-Kissen-Lösung (400 mM Kaliumacetat, 25 mM Kalium HEPES, pH 7,2, 15 mM Magnesiumacetat, 200 & mgr; M Cycloheximid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml RNase Inhibitor und 0,5 M Saccharose) in einem SW55 Ultrazentrifugenröhrchen (13 x 51 mm).
- Sorgfältig Schicht 3,75 ml Lysatüberstand (aus Schritt 7) auf der Oberseite des Saccharose-Kissen unter Verwendung einer Spritze und kleine (~ 27) Gauge-Nadel. Store die verbleibende Lysat (~ 500 & mgr; l) bei -80 ° C, um die Gesamt-RNA Niveaus zu extrahieren, wie in Abschnitt 1 angegeben.
- Laden der Proben in der Ultrazentrifuge Rotor vorgekühlter bis 4 ° C, das 13,2-ml-Röhrchen aufnehmen kann. Zentrifugieren der Proben bei 366.000 × g und 4 ° C für 146 min.
- Mit einer Pipette den Überstand in ein 15 ml konischen Röhrchen. Lagern Sie den Überstand bei -80 ° C für die RNA-Isolierung von freiem (ungebundenem von Ribosomen) RNAs.
- Resuspendieren Ribosom-Pellet in 500 ul Ribosomen Resuspensionspuffer (400 mM Kaliumacetat, 25 mM Kalium HEPES, pH 7,2, 15 mM Magnesiumacetat, 200 & mgr; M Cycloheximid, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, und 40 U / ml RNase-Inhibitor) durch Pipettieren von 5 min.
- Zentrifugieren der Proben in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g und 4 ° C für 10 min.
- Während die Gradienten von Schritt 4 auf Eis, entfernen Sie die Parafilm, dann vorsichtig Schicht das Ribosom Suspension oben auf dem Gradienten using eine Spritze und kleine (~ 27) Nadel.
- Legen Sie den Schlauch in ein vorgekühltes Ultrazentrifuge Rotor und Zentrifuge die geladenen Farbverläufe bei 200.000 xg und 4 ° C für 180 min. Wenn der Spin beendet ist, zentrifugiert store Gradienten bei 4 ° C, bis Sie sie auf den Fraktionator zu laden.
- Legen Sie eine leere Ultrazentrifugenröhrchen in die Gradienten Fraktionator (dies kann ein Rohr in einem vorherigen Durchlauf verwendet werden kann), dann mit RNase-freiem Wasser waschen für 5 min bei 100 x 10 Geschwindigkeit.
- Während des Wasch in Schritt 6.16, stellen Sie die Empfindlichkeit des UV-Absorptionsdetektor. Ein guter Ausgangsempfindlichkeit liegt bei 0,2, aber dies möglicherweise in späteren läuft auf der A 254-Signal (die auf Parasiten Nummer usw. auf Basis variiert), je nach eingestellt werden.
- Sobald die Detektorempfindlichkeit eingestellt ist, stellen Sie die Grundliniensignal auf Null, während Wasser durch den Detektor strömt.
- Nach dem Waschen der Fraktionssammler, kehren Sie den Flüssigkeitsstrom, bis die Leitungen leer sind und dann remove, das leere Ultrazentrifugenröhrchen.
- Führen Sie 60% Saccharose-Lösung durch den Fraktionator bis zum Nadelgerät verlässt.
- Legen Sie die Röhrchen mit dem ersten Gradienten an der Spitze der Ladekammer und die Dichtung festziehen, dabei nicht zu fest anziehen. Dann durchstechen die Unterseite des Rohres mit der Nadel.
- Setzen Sie die Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit von 12,5 x 10 (von der Strömungsgeschwindigkeit Drehknopf auf der Vorderseite der Pumpe gesteuert wird), legen Sie dann den automatischen Fraktionssammler bis 18 sec Fraktionen zu sammeln (~ 330 & mgr; l / Fraktion) in Mikrozentrifugenröhrchen.
- Start vorwärts Fluss der 60% Saccharose-Lösung.
- Wenn der erste Tropfen des Gradienten-Lösung fällt in den Mikrozentrifugenröhrchen, sofort beginnen sowohl die Fraktionssammlung und Live-Mitschnitt der A 254-Signal.
- Nach einem starken Rückgang in der A 254-Signal beobachtet, entsprechend der Schnittstelle zwischen 50% und 60% Saccharose-Lösungen, zu stoppen sowohl die Fluidströmung und A 254 Aufnahme.
- Bewahren Sie die Gradientenfraktionen bei -80 ° C für die spätere Verwendung.
- Kehren Sie den Flüssigkeitsstrom bei 100 x 10-fach, bis das 60% Saccharose-Lösung leert sich der Ultrazentrifugenröhrchen.
- Wenn es zusätzliche Gradienten zu fraktionieren, entfernen Sie die leere Ultrazentrifugenröhrchen aus der Ladekammer und starten Sie mit Schritt 6.21. Wenn alle Proben abgeschlossen sind, waschen Sie die Vorrichtung wurde in Schritten 6.16 und 6.19 durchgeführt.
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Ergebnisse
Globale Profilierung der menschlichen microRNA in P. falciparum
Die hier vorgestellten Techniken wurden verwendet, um Mikro-RNAs von Parasiten in einer Vielzahl von Bedingungen zu extrahieren. Eine Sache zu beachten ist, dass RNA-Extraktionen für die nicht infizierten Erythrozyten wurden durchgeführt, wie in 32, die oft als Bezugspunkt für die microRNA Daten sowohl in diesem Artikel und der ursprünglichen Studie 29 vorgestellt serviert angezeigt. Diese früheren...
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Diskussion
HbS ist eine der häufigsten Hämoglobinvarianten in Malaria-endemischen Gebieten, vor allem, weil er Schutz gegen schwere Malaria durch P. verursacht falciparum. Die Techniken erforderlich, um die Rolle des menschlichen MikroRNA in der Genregulation P. charakterisieren falciparum werden in diesem Manuskript beschrieben. Durch Extraktion der Gesamt-RNA in einer solchen Weise, dass alle kleinen RNAs umfassen, und durch Ausführen einer relativ einfachen Parasiten Lyseverfahren waren diese...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu deklarieren.
Danksagungen
Diese Forschung wurde finanziert von der Doris Duke Charitable Foundation, dem Burroughs Wellcome Fund, dem NIH R21DK080994, dem Pilotprojektfonds des Duke Chancellor, der Roche Foundation for Anemia Research und der Bill and Melinda Gates Foundation. G.L. wird unterstützt von Duke's UPGG und dem NIH (Grant # 5R01AI090141-03) und K.A.W. vom NSF Graduate Research Fellowship Program.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENZIEN - Alle Reagenzien müssen RNAsefrei sein.Diethyl | |||
| pyrocarbonate | Sigma | D5758 | DEPC |
| DEPC-behandeltes Wasser (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| Yoyo-1 DNA-Fluoreszenzfarbstoff | Thermo Fisher | ||
| Gene Pulser II Elektroporator | Bio-Rad | ||
| 0,2 cm Elektroporationsküvetten | |||
| 4 M Kaliumacetat | Mallinckrodt | 6700 | |
| 2 M Kalium HEPES | Sigma | H0527 | pH 7,2 |
| 1 M Magnesiumacetat | Sigma | M-2545 | |
| 1 M Dithiothreitol | Forschung Produkte International | D11000 | DTT |
| 100 mM Phenylmethylsulfonatfluorid | Sigma | P7626 | PMSF, gelöst in Isopropanol |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| 10% (w/v) Natriumdesoxycholat | Sigma | D-6750 | DOC |
| Cycloheximid | Sigma | C-7698 | CHX |
| Saccharose | Mallinckrodt | 8360-04 | |
| RNAseOUT (Invitrogen, Kat.-Nr. 100000840) | Invitrogen | ||
| RPMI-1640 mit L-Glutamin | Cellgro | 10-040-CV | |
| 10% AlbuMAX I | Invitrogen | 11020-039 | w/v in sterilem Wasser |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HT Supplement (100x) (Invitrogen, Kat.-Nr. 11067030) | |||
| 45% (w/v) Saccharose (Sigma, Kat.-Nr. G8769) | |||
| 1 M HEPES-Puffer (Gibco, Kat.-Nr. 15630-080) | |||
| 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; Cellgro, Kat. Nr. 2109310CV) | |||
| Corning 500 ml Vakuumfilterflasche (VWR, Kat.-Nr. 430769) | |||
| Objektträger (VWR, Kat.-Nr. 48311-702) | |||
| Giemsa-Färbung (50X) (VWR, Kat.-Nr. m708-01) | |||
| mirVana miRNA-Isolationskit (Ambion, ThermoFisher Scientific). | |||
| 5' Biotin-konjugierte reife miRNA (Sequenz variiert je nach miRNA des Interesses) (Dharmacon) | |||
| Biotinpulver (Sigma-Aldrich) | |||
| 1 M Kaliumchlorid | |||
| Streptavidin Sepharose Hochleistungsperlen (GE Healthcare) | |||
| Ribosomen-Resuspensionspuffer (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| Lysepuffer (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| 15 % (w/v) Saccharose-Gradientenlösung (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| 50 % (w/v) Saccharose-Gradientenlösung (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| 0,5 M Saccharose-Kissen (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| 60 % (w/v) Saccharose-Chase-Lösung (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| Plasmodium-Zellkulturmedien (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| RNA-Capture-Waschpuffer (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| RNA-Elutionspuffer (siehe REAGENZIEN-SETUP) | |||
| REAGENZ-SETUP | |||
| Solutions | |||
| Plasmodium-Zellkulturmedien | |||
| 500 ml RPMI-1640 mit L-Glutamin | |||
| 0,5 ml Gentamicin | |||
| 5 ml HT-Supplement | |||
| 2,5 ml 45 % Glukose | |||
| 25 ml 10 % AlbuMAX I | |||
| 12,5 ml 1 M HEPES | |||
| Sterilfilter mit 0,2 mm Vakuumfilterkolben. | |||
| Plasmodium-Zellkulturmedien mit 10x CHX | |||
| Gleiches Rezept wie Plasmodium-Zellkulturmedien oben, mit der Zugabe von: | |||
| 2 mM Cycloheximid-Medium | |||
| wird wie gewohnt hergestellt, dann CHX bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugeben und filtrieren. | |||
| 1x PBS, das Cycloheximid | |||
| Cycloheximid enthält, wird frisch zu 1x PBS bis zu einer Endkonzentration von 200 mM gegeben und bis zur Verwendung bei 4 OC gehalten. | |||
| Ribosomen-Resuspensionspuffer | |||
| 400 mM Kaliumacetat | |||
| 25 mM Kalium HEPES, pH 7,2 | |||
| 15 mM Magnesiumacetat | |||
| 200 mM Cycloheximid (frisch zugeben) | |||
| 1 mM DTT (frisch zugeben) | |||
| 1 mM PMSF (frisch zugeben) | |||
| 40 U/ml RNaseOUT (frisch zugeben) | |||
| Lysepuffer | |||
| , mit dem Zusatz von: | |||
| 1% (v/v) Igepal CA-630 | |||
| 0,5 % (w/v) DOC | |||
| Saccharoselösungen | |||
| , mit der Zugabe unterschiedlicher Mengen an Saccharose: | |||
| 15% (w/v) Saccharose, um 15%ige Saccharose-Gradientenlösung | |||
| herzustellen50 % (w/v) Saccharose zur Herstellung von 50 % Saccharose Gradientenlösung | |||
| 0,5 M Saccharose zur Herstellung von 0,5 M Saccharosekissen | |||
| Wie oben beschrieben, müssen Cycloheximid, DTT, PMSF und RNaseOUT frisch zugegeben werden. | |||
| Die 60%ige Saccharose-Chase-Lösung benötigt nur Saccharose und Wasser, keine anderen Komponenten | |||
| 60% (w/v) Saccharose in DEPC-behandeltem Wasser, um 60%ige Saccharose-Chase-Lösung | |||
| RNA Capture Wash Buffer | |||
| 20 mM KCl | |||
| 5 Einheit/ml Rnase Out (Invitrogen)< | |||
| strong>RNA Capture Elution Buffer | |||
| Gleiche Rezeptur wie RNA Capture Wash Buffer, mit dem Zusatz von: | |||
| 2 mM Biotin | |||
| EQUIPMENT | |||
| SW55 Ti Ultrazentrifugenrotor (Beckman, Kat.-Nr. 342194) | |||
| SW41 Ti Ultrazentrifugenrotor (Beckman, Kat.-Nr. 331362) | |||
| Ultra-ClearTM ½ x 2 Zoll (13 x 51 mm) Ultrazentrifugenröhrchen für die SW55 (Beckman, Kat.-Nr. 344057) | |||
| Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) Ultrazentrifugenröhrchen für die SW41 (Beckman, Kat.-Nr. 331372) | |||
| L8-80M Ultrazentrifuge (Beckman) | |||
| Stumpfe Spritzennadel aus Stahl, 4 Zoll, 16 G (Aldrich, Kat.-Nr. Z261378) | |||
| 1 ml Spritze mit 27 G½ Nadel (Becton Dickinson, Kat.-Nr. 309623) | |||
| 5 ml Spritze (Becton Dickinson, Kat.-Nr. 309646) | |||
| Parafilm | |||
| Röhrenrotator, End-over-End-Mikrozentrifuge | |||
| , gekühlt | |||
| Dichtegradientenfraktionierungssystem (Teledyne Isco, Kat.-Nr. 69-3873-179) | |||
| TracerDAQ (Measurement Computing) | |||
| Eppendorf 5810R Zentrifuge | |||
| Eppendorf A-4-81 Rotor (Eppendorf, Kat.-Nr. 022638807) |
Referenzen
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